鐵椆樹(shù)果與紅菇抗氧化有效成分提取及活性比較.doc

鐵椆樹(shù)果與紅菇抗氧化有效成分提取及活性比較開(kāi)智中學(xué)生化教研組謝荃摘要 目的：研究鐵椆樹(shù)果和紅菇多糖、總酚、黃酮等有效成分的含量和體外抗氧化活性，探討鐵椆樹(shù)果替代紅菇研制成天然抗氧化劑的可能性。方法：均于廣西容縣浪水鄉(xiāng)紅菇基地獲取新鮮鐵椆樹(shù)果和紅菇，分別以乙醇抽提法、水浴回流法、水浴加熱抽濾法，獲得多糖、總酚、黃酮粗提取液。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法測(cè)定鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分的含量，采用1，1二苯基2苦肼基自由基(DPPH)法、鐵氰化鉀還原法和鄰苯三酚自氧化法測(cè)定鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分提取液清除DPPH自由基、還原力和清除O2-的能力，比較評(píng)價(jià)鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分的體外抗氧化活性。結(jié)果：鐵椆樹(shù)果多糖、總酚、黃酮含量（mg/g）分別為：14.100、0.022、0.040，紅菇多糖、總酚、黃酮含量（mg/g）分別為：3.000、0.013、0.260，在清除DPPH自由基能力方面，鐵椆樹(shù)果多糖（94.32%）高于紅菇多糖（70.79%），呈極顯著差異（P0.01）；鐵椆樹(shù)果總酚（84.87%）高于紅菇總酚（81.43%），鐵椆樹(shù)果黃酮（93.05%）低于紅菇黃酮（95.64%），都不呈顯著差異（P0.05）。在還原力方面，鐵椆樹(shù)果多糖（1.058）、總酚（1.679）、黃酮（2.366）均高于紅菇多糖（0.201）、總酚（0.415）、黃酮（0.356），都呈極顯著差異（P0.01）。在清除O2-能力方面，鐵椆樹(shù)果多糖（17.86%）、總酚（10.69%）都低于紅菇多糖（70.14%）、總酚（54.85%），呈極顯著差異（P0.01）；鐵椆樹(shù)果黃酮（56.23%）低于紅菇黃酮（62.42%），呈顯著差異（P0.05）。結(jié)論：在清除DPPH自由基能力、還原力方面鐵椆樹(shù)果的抗氧化活性幾乎都強(qiáng)于紅菇，清除O2-能力方面鐵椆樹(shù)果的抗氧化活性弱于紅菇，總之鐵椆樹(shù)果的抗氧化活性略強(qiáng)于紅菇，可在一定程度上作為紅菇的抗氧化活性功能替代物。 關(guān)鍵詞：紅菇、鐵椆樹(shù)果、抗氧化有效成分、活性比較Castanopsis glauca fruit with Russula antioxidant effective components extraction and activity comparisonBiotechnology2009 LuojingyanSupervisor GanyaokunAbstractObjective: To study the content of active ingredients of polysaccharide,total phenol, flavonoids,and in vitro antioxidant activity of castanopsis glauca fruit and russula,and to study the posibility of castanopsis glauca fruit replacing russula as a natural antioxidant.Methods: Drawing fresh castanopsis glauca fruit and russula matierials from russula base in Langshuixiang,Rongxian,Guangxi,respectively by the method of ethanol extraction and water bath circumfluence,water bath heating the suction filter method, obtain polysaccharide,total phenol and flavonoids crude extract.Castanopsis glauca fruit using the standard curve method,and russula content of effective components,using 1,1 diphenyl-2-bitter hydrazo free radical (DPPH) method,potassium ferricyanide reduction method and its adjacent phenyl phenol three autoxidation method,castanopsis glauca fruit and russula extract effective components remove DPPH free radicals,reducing power and the ability to remove O2-,comparative evaluation of castanopsis glauca fruit and russula effective components in vitro antioxidant activity.Results:Castanopsis glauca fruit polysaccharide,total phenol and flavonoids content (mg/g),respectively:14.100,0.022, 0.040,and russula polysaccharide, total phenol and flavonoids content (mg/g), respectively: 3.000,0.013,0.260,in terms of removal ability of DPPH free radical,castanopsis glauca fruit polysaccharide (94.32%) than russula polysaccharides (70.79%),show very significant difference (P 0.05).In terms of reducing power,castanopsis glauca fruit polysaccharide (1.058),total phenol 1.679), flavonoids (2.366) are higher than russula polysaccharide (0.201), total phenol (0.415) and flavonoids (0.356),show very significant difference (P 0.01).In removing O2- ability, castanopsis glauca fruit polysaccharide (17.86%),total phenol (10.69%) is below russula polysaccharides (70.14%),total phenol (54.85%),with a very significant difference (P 0.01);Castanopsis glauca fruit flavones (56.23%) is lower than russula flavonoids (62.42%),show a significant difference (P 0.05).Conclusion:On the removing ability of DPPH free radicals and reducing power ,the antioxidant activity of castanopsis glauca fruit is stronger than the russula.On removing O2- the ability of castanopsis glauca is weaker than russula,In a word,the antioxidant activity of castanopsis glauca fruit is slightly better than russula, it can,to some extent, act as substitution for the antioxidant activity function of russula. Key words：Russula,Castanopsis glauca fruit,Antioxidant active ingredients, Activity comparison 目錄1.前言11.1紅菇簡(jiǎn)介及其研究現(xiàn)狀11.2 鐵椆樹(shù)簡(jiǎn)介及其研究現(xiàn)狀11.3 選題意義12.材料與方法22.1實(shí)驗(yàn)材料22.2主要儀器22.3主要試劑22.4試劑配制22.5實(shí)驗(yàn)方法32.5.1鐵椆樹(shù)果和紅菇多糖的提取與含量測(cè)定12,1332.5.2鐵椆樹(shù)果和紅菇總酚的提取和含量測(cè)定42.5.3鐵椆樹(shù)果和紅菇黃酮的提取及含量測(cè)定52.5.4 鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分清除DPPH自由基作用18的能力62.5.5 鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分還原力的能力72.5.6 鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分清除超氧陰離子自由基的能力72.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析83.結(jié)果與分析83.1鐵椆樹(shù)果和紅菇各有效成分含量83.2鐵椆樹(shù)果和紅菇各有效成分清除DPPH自由基能力的測(cè)定83.3鐵椆樹(shù)果和紅菇各有效成分還原力的測(cè)定93.4鐵椆樹(shù)果和紅菇各有效成分清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定104.討論與結(jié)論124.1鐵椆樹(shù)果和紅菇各有效成分含量與抗氧化指標(biāo)討論124.2小結(jié)125.展望13致謝13參考文獻(xiàn)141.前言1.1紅菇簡(jiǎn)介及其研究現(xiàn)狀紅菇(Russula)是一種外生菌根真菌，屬于擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、紅菇目、紅菇科、紅菇屬1。紅菇呈單生，散生或小區(qū)域群生于鐵椆樹(shù)林間腐殖層地帶，菇柄基部著生多條白色索狀菌絲，向下延伸，成為菌與根之間的外生菌根2。紅菇具有多種生物活性功能，如抗氧化、抗衰老、降血糖降血脂、抗菌、抗腫瘤等。甘耀坤等采用紅菇水提取液灌胃小鼠模型方法，檢測(cè)小鼠血清中超氧化物的活性和谷胱甘肽、丙二醛的含量，研究證明紅菇水提取液中存在抗氧化成分3。Tumay等對(duì)紅菇的乙醇提取物進(jìn)行清除DPPH自由基和螯合二價(jià)鐵離子（Fe2+）能力測(cè)定，結(jié)果表明10mg/L的紅菇乙醇提取物清除DPPH自由基達(dá)到26%，5mg/L的紅菇乙醇提取物螯合二價(jià)鐵離子（Fe2+）達(dá)到58%，從而也證明了紅菇提取液中抗氧化成分的抗氧化能力很強(qiáng)4。1.2 鐵椆樹(shù)簡(jiǎn)介及其研究現(xiàn)狀鐵椆樹(shù)（Cyclobalanopsis glauca）是殼斗科、青岡屬植物，別名青岡櫟、青栲等，為構(gòu)成我國(guó)亞熱帶森林的主要成分之一。具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，喜陽(yáng)性，喜生于微堿性、中性至微酸性土壤中。鐵椆樹(shù)中含有大量的生物活性物質(zhì)，包括單寧、多糖、生物堿、多酚、VB2、VB1、VC、脂類(lèi)等，其主要活性成分單寧等具有抗疲勞、抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、抑菌、止血消炎、抗心血管疾病等多項(xiàng)生理功能。近年來(lái)，我國(guó)學(xué)者對(duì)鐵椆樹(shù)提取物進(jìn)行抗癌、抗疲勞、抗氧化、抑菌和降血脂等方面進(jìn)行了深入的研究，并取得了一定的成果5-9。甘耀坤等人通過(guò)建立高糖高脂動(dòng)物模型的方法，飼喂含有鐵椆樹(shù)葉粉的加富高糖高脂飲料21天后，測(cè)定大鼠腎臟超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，結(jié)果表明大鼠腎臟SOD活性顯著提高，而MDA含量下降明顯，從而證明鐵椆樹(shù)對(duì)高糖高脂癥大鼠具有抗氧化活性作用10。1.3 選題意義 經(jīng)研究證明，紅菇和鐵椆樹(shù)果提取物具有抗氧化作用，卻尚未清楚起抗氧化作用的具體化學(xué)成分。然而許多學(xué)者對(duì)其他植物已進(jìn)行深入研究，明確了起抗氧化主要作用的具體物質(zhì)有多糖、總酚、單寧酸、黃酮等。劉平懷等通過(guò)DPPH體外清除實(shí)驗(yàn)研究蘿芙木水溶性生物堿抗氧化活性，證明蘿芙木水溶性生物堿具有抗氧化活性，可以開(kāi)發(fā)為天然抗氧化劑11。紅菇提取物也具有抗氧化作用，若將其有效成分研發(fā)為新藥或保健品,將具有廣闊的市場(chǎng)和前景。但由于目前紅菇尚未能進(jìn)行大規(guī)模栽培，且野生紅菇資源日益稀少。為此我們采取逆向思維，把研究注意力轉(zhuǎn)移到其共生植物鐵椆樹(shù)，期待能找到具有紅菇類(lèi)似抗氧化活性功能替代物。本實(shí)驗(yàn)采用DPPH法、鐵氰化鉀還原法和鄰苯三酚自氧化法測(cè)定和評(píng)價(jià)紅菇和鐵椆樹(shù)果有效成分提取液體外抗氧化的效果，比較紅菇和鐵椆樹(shù)果有效成分的體外抗氧化能力，以求能否用資源豐富的鐵椆樹(shù)果替代稀少昂貴的紅菇資源，對(duì)其資源的開(kāi)發(fā)提供更為有力的依據(jù)。2.材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料鐵椆樹(shù)果和紅菇（均于7月16日采于廣西容縣浪水鄉(xiāng)紅菇基地）。2.2主要儀器TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、索氏提取器（天津玻璃儀器廠(chǎng)）、RE-52D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海青浦滬西儀器廠(chǎng)）、SHB-III循環(huán)水式真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）、BCD-215KS冰箱（青島海爾有限公司）、FA1104型電子分析天平（上海精密儀器有限公司）、202-LA型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱（上海瀘越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、L420臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、YP102N電子天平（上海精密科學(xué)有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)）、FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。2.3主要試劑無(wú)水乙醇、95%乙醇、去離子水、鄰苯三酚、氯化鐵、三氯乙酸（TCA）、DPPH(1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl)(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、鐵氰化鉀K3Fe(CN)6、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉。以上試劑均為分析純。2.4試劑配制0.1mmol/L DPPH的溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.00395gDPPH，用95%乙醇溶解并定容至100mL。0.2mol/L，PH=6.6磷酸鹽緩沖液：0.2mol/LNa2HPO4溶液37.5mL與0.2mol/L NaH2PO4溶液62.5mL的混合液。5mmol/L鄰苯三酚：稱(chēng)取0.073g鄰苯三酚，用10mmol/L HCl溶解并定容至100mL。50mmol/L PH8.2 Tris-HCl緩沖液：50mL 0.1mol/L Tris與22.9mL 0.1mol/L鹽酸混勻并稀釋至200mL。2.5實(shí)驗(yàn)方法2.5.1鐵椆樹(shù)果和紅菇多糖的提取與含量測(cè)定12,132.5.1.1樣品溶液配制準(zhǔn)確稱(chēng)取各種樣品5.0g，分別置于索氏提取器濾紙筒中，用200mL無(wú)水乙醇抽提2h除去脂溶性成分，揮干乙醇后再用200mL蒸餾水索氏提取3h，抽濾，濾液在容量瓶中定容至250mL，再吸取上述溶液2.5mL稀釋至25mL，備用14。2.5.1.2多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0. 1000g于一個(gè)干凈的小燒杯中，用蒸餾水溶解并定量轉(zhuǎn)移至100mL的容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻。此溶液濃度為1.0mg/mL。分別吸取1. 0mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL于6個(gè)50mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻。再分別吸取上述溶液各2mL于6支具塞刻度試管中，另準(zhǔn)備1支試管加2mL蒸餾水作為空白管，往以上7支試管中再各加蒽酮硫酸試劑6mL，搖勻后置于沸水浴中加熱15min，冷卻后于625nm波長(zhǎng)處用1cm吸收池測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并求出標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)性方程：y=2.8929x-0.0144，R2=0.9940。其中Y表示吸光度（A625），X表示葡萄糖濃度（mg/mL）。圖2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2.1 Standard curve of soluble sugar2.5.1.3含量測(cè)定分別吸取稀釋后的樣品溶液1mL于具塞刻度試管中，各加1mL水，再各加蒽酮硫酸試劑6mL，搖勻后置于沸水浴中加熱15min，冷卻后于625nm 波長(zhǎng)處用1cm吸收池測(cè)定吸光度，樣品均平行測(cè)定3次，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算出多糖含量。2.5.2鐵椆樹(shù)果和紅菇總酚的提取和含量測(cè)定2.5.2.1總酚的提取稱(chēng)取5.000g樣品粉末，置于250mL錐形瓶中，在料液比120、30%乙醇、60的條件下水浴回流提取1h，趁熱過(guò)濾、洗滌，收集濾液，濾液40旋轉(zhuǎn)真空濃縮，濃縮液加水定容至100mL，得到樣品多酚物質(zhì)粗提液15。2.5.2.2總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.0110g，用蒸餾水溶解并定容至100mL，得濃度為0.11mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL置于25mL的棕色容量瓶中，加蒸餾水至6.0mL，然后分別加入福林試劑0.5mL，混勻，在0.5-8min內(nèi)加入1.5mL 20%的Na2CO3溶液，充分混合后定容，30避光放置0.5h，以不加標(biāo)準(zhǔn)液的6.0mL蒸餾水為空白對(duì)照，760nm下測(cè)定吸光值，每個(gè)樣品平行測(cè)定三次。以沒(méi)食子酸在反應(yīng)體系中的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后計(jì)算得出回歸方程：y=0.618x+0.0538，R2=0.9909。其中Y表示吸光度（A760），X表示沒(méi)食子酸濃度（ug/mL）。 圖2.2 總酚測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2.2 Standard curve of protein2.5.2.3含量的測(cè)定準(zhǔn)確量取制備好的乙醇粗提液0.5mL于50mL容量瓶中，加入9.5mL蒸餾水，搖勻，再加入0.5mL福林試劑，混勻，在0.5-8min內(nèi)加入1.5mL20%的Na2CO3溶液，充分混合后定容，30避光放置0.5h，以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液為空白對(duì)照，760nm下測(cè)定吸光值，每個(gè)樣品平行測(cè)定6次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算樣品中總酚的含量。2.5.3鐵椆樹(shù)果和紅菇黃酮的提取及含量測(cè)定2.5.3.1黃酮的提取稱(chēng)取樣品粉末5.0g，加20倍體積60%乙醇溶液，于70恒溫水浴中加熱2h。提取物經(jīng)抽濾后30%乙醇溶液定容在100mL容量瓶中16。2.5.3.2黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作精密吸取0、2、4、6、8、10mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液至于25mL容量瓶中，加30%乙醇溶液至10mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.7mL，搖勻，靜置5min，再加入5%硝酸鋁溶液0.7mL，搖勻，靜置5min，加入1mol/L氫氧化鈉溶液5.0mL，最后用30%乙醇溶液定容到刻度線(xiàn)，搖勻，靜置5min后，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后計(jì)算得出回歸方程：y=5.5800x+0.0110，R2=0.9952。其中Y表示吸光度（A510），X表示蘆丁溶液濃度（mg/mL）。圖2.3 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2.3 Standard curve of flavone2.5.3.3含量的測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法17。準(zhǔn)確吸取0.5mL提取液，加入25mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.7mL，搖勻，靜置5min，再加入5%硝酸鋁溶液0.7mL，搖勻，靜置5min，加入1mol/L氫氧化鈉溶液5.0mL，最后用30%乙醇溶液定容到刻度線(xiàn)，搖勻，靜置5min后，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算提取物總黃酮的含量。2.5.4 鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分清除DPPH自由基作用18的能力 照周瑋婧19略有修改，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.00395gDPPH，用95%乙醇溶解并定溶至100mL，配制成0.1mmol/LDPPH的溶液。取不同有效成分的樣品液2 mL與2 mL DPPH溶液混合搖勻，室溫下放置30min后測(cè)定517nm處的吸光值，所有測(cè)定均為三次平均值，由公式（2.1）計(jì)算DPPH自由基的清除率。DPPH清除率（%）= (2.1) A樣=2mL樣品+ 2mLDPPH； A對(duì)照= 2mL樣品+ 2mL95%乙醇；A空=2mLDPPH+ 2mL70%乙醇。計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率，并繪制DPPH自由基清除率與不同濃度樣品的曲線(xiàn)。2.5.5 鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分還原力的能力依照文獻(xiàn)20,21的方法，略有修改。取2 mL不同濃度的樣品液分別加到磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，PH=6.6）和鐵氰化鉀K3Fe(CN)6（1%，w/v）溶液各2mL，混合物在50保溫20min，然后在反應(yīng)混合物中加入2 mL三氯乙酸（10%，w/v），于3000r/min離心10min，然后取上清液2 mL與2 mL蒸餾水及0.4 mL氯化鐵（0.1%，w/v）在試管中反應(yīng)，10 min后測(cè)定其在波長(zhǎng)700nm處吸光值計(jì)為提取物的還原力，以不加FeCl3作空白調(diào)零，陰性不加樣。吸光度的大小反映了樣品還原力的強(qiáng)弱，從而反映其抗氧化能力的大小，吸光度值越大，則樣品的還原能力越強(qiáng)，抗氧化能力也就越強(qiáng)。2.5.6 鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分清除超氧陰離子自由基的能力采用改良的鄰苯三酚自氧化法22產(chǎn)生O2-，鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)為325nm，O2-清除劑能使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在A325受到抑制。通過(guò)A325值的變化可判斷O2-清除劑的清除能力及抑制能力。反應(yīng)體系：分別加入以下試劑，4.5mLpH8.2的Tris-HCl緩沖液(50mmol/L)，1mL樣品稀釋液（稀釋10倍）(對(duì)照管不加提取物)，0.2mL鄰苯三酚(5mmol/L)，總體積5.7mL。常溫下，反應(yīng)體系啟動(dòng)后，每隔30s讀取一次A325值，至240s止。(各加樣管以不加鄰苯三酚管作對(duì)照，即A空白)。以Tris-HCl緩沖液作空白調(diào)零用，O2-清除率及抑制率按公式（2.2）計(jì)算。O2-清除率（%）= （2.2） A空白：為不加鄰苯三酚時(shí)體系溶液的吸光度(消除粗提物本身顏色對(duì)測(cè)定的干擾)；A對(duì)照：為某時(shí)刻不加樣品時(shí)體系溶液的吸光度；A樣：為某時(shí)刻加入樣品時(shí)體系溶液的吸光度。計(jì)算樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率，并繪制清除率與不同濃度樣品曲線(xiàn)。2.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析所有實(shí)驗(yàn)均做三組重復(fù)，采用spss18.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，差異顯著性采用單因素方差法分析，顯著性水平取=0.05和=0.01，使用Excel軟件作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示。3.結(jié)果與分析3.1鐵椆樹(shù)果和紅菇各有效成分含量鐵椆樹(shù)果和紅菇各有效成分含量如表所示：表3.1 鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分含量Table3.1 Castanopsis glauca fruit and the Russula effective component content成分紅菇多糖（mg/g）果多糖（mg/g）紅菇總酚（mg/g）果總酚（mg/g）紅菇黃酮（mg/g）果黃酮（mg/g）含量3.00014.1000.0130.0220.2600.0403.2鐵椆樹(shù)果和紅菇各有效成分清除DPPH自由基能力的測(cè)定二苯基苦基苯肼(DP-PH)是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，它的結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)苯環(huán)，1個(gè)N原子上有1個(gè)孤對(duì)電子，其醇溶液呈紫色的特性，在517 nm處有強(qiáng)吸收峰。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與孤對(duì)電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速定量分23。由表3.2和圖3.1可以看出，從紅菇中提取的多糖、總酚、黃酮三種有效成分都具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力（清除率都在70%以上），鐵椆樹(shù)果中提取的多糖、總酚、黃酮也具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力（清除率都在80%以上）。鐵椆樹(shù)果多糖與紅菇多糖比較，其清除率都較高且呈極顯著差異（P0.01），表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力；鐵椆樹(shù)果總酚清除率高于紅菇總酚，不呈顯著差異（P0.05）；鐵椆樹(shù)果黃酮低于紅菇黃酮，不呈顯著差異（P0.05）。結(jié)果表明：在原材料含量相同的情況下，鐵椆樹(shù)果中多糖、總酚比紅菇的多糖、總酚的DPPH自由基清除能力強(qiáng)，鐵椆樹(shù)果黃酮比紅菇黃酮的DPPH自由基清除能力弱。表3.2 鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分清除DPPH自由基能力Table3.2 The clear DPPH free radical ability of Castanopsis glauca fruit and the Russula effective component紅菇清除率鐵椆樹(shù)果清除率多糖70.792.6194.321.74*總酚81.431.9484.870.49黃酮95.640.9193.050.98注：*：P0.05，* *：P0.01與紅菇比較。Note: *:P0.05,*:P0.01compare with Russula .圖3.1 鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分清除DPPH自由基能力（s，n=3）Fig.3.1 The clear DPPH free radical ability of Castanopsis glauca fruit and the Russula effective component3.3鐵椆樹(shù)果和紅菇各有效成分還原力的測(cè)定還原力的測(cè)定是以普魯士藍(lán)Fe4(Fe(CN)6)3的生成量作為指標(biāo)，將鐵氰化鉀K3Fe(CN)6還原成K4Fe(CN)6，K4Fe(CN)6再利用Fe3+形成普魯士藍(lán)24，在此反應(yīng)過(guò)程中，供應(yīng)的電子可使Fe3+還原為Fe2+，使反應(yīng)溶液的顏色逐漸變深，吸光度也變大。還原力強(qiáng)的樣品除了可使Fe3+還原為Fe2+外，也可與自由基反應(yīng)，使自由基成為更穩(wěn)定的物質(zhì)，樣品的吸光度也更大。即樣品的吸光度與還原力之間呈正相關(guān)，因此，可以用700 nm處吸光值的變化測(cè)定還原力大小，吸光度值越大，則樣品的還原能力越強(qiáng)，抗氧化能力也就越強(qiáng)。由表3.3和圖3.2可以看出，紅菇三種有效成分還原力都較低（吸光值均小于1）。鐵椆樹(shù)果多糖、總酚、黃酮的吸光值都比紅菇的三種對(duì)應(yīng)成分高，都具有極顯著性差異（P0.01）。實(shí)驗(yàn)表明：在原材料含量相同的情況下，鐵椆樹(shù)果三種有效成分還原力都優(yōu)于紅菇。表3.3鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分的還原力Table3.3 Castanopsis glauca fruit and the Russula effective component, s reduction force紅菇清除率鐵椆樹(shù)果清除率多糖0.2010.0141.0580.034*總酚0.4150.0521.6790.035*黃酮0.3560.0062.3660.056*注：*：P0.05，* *：P0.01與紅菇比較。Note: *:P0.05,*:P0.01compare with Russula . 圖3.2鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分的還原力（s，n=3） Fig3.2 Castanopsis glauca fruit and the Russula effective component, s reduction force3.4鐵椆樹(shù)果和紅菇各有效成分清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定鄰苯三酚在自氧化過(guò)程中,會(huì)產(chǎn)生O2-自由基和其他有色中間物質(zhì)，如果加入O2-自由基清除劑，便可抑制鄰苯三酚的自氧化，同時(shí)也抑制了有色中間物質(zhì)的產(chǎn)生，通過(guò)比色便可得出O2-自由基清除劑對(duì)O2-自由基的清除效力25。由表3.4和圖3.3可以看出，紅菇多糖、總酚的清除O2-自由基清除能力比鐵椆樹(shù)果的多糖、總酚強(qiáng)，且具有極顯著性差異（P0.01），紅菇黃酮的清除O2-自由基清除能力顯著大于鐵椆樹(shù)果黃酮的清除能力（P0.05）。實(shí)驗(yàn)表明：在原材料含量相同的情況下，紅菇多糖、總酚、黃酮的清除O2-自由基的能力明顯比鐵椆樹(shù)果多糖、總酚、黃酮的清除O2-自由基的能力強(qiáng)。表3.4 鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分清除O2-自由基能力Table3.4 Remove O2- free radicals ability of Castanopsis glauca fruit and the Russula effective component紅菇清除率鐵椆樹(shù)果清除率多糖70.140.2317.860.87*總酚54.851.1310.691.20*黃酮62.422.9756.231.05*注：*：P0.05，* *：P0.01與紅菇比較。Note: *:P0.05,*:P0.01compare with Russula .圖3.3 鐵椆樹(shù)果和紅菇有效成分清除O2-自由基能力（s，n=3）Fig.3.3 Remove O2- free radicals ability of Castanopsis glauca fruit and the Russula effective component4.討論與結(jié)論4.1鐵椆樹(shù)果和紅菇各有效成分含量與抗氧化指標(biāo)討論研究鐵椆樹(shù)果和紅菇多糖、總酚、黃酮等有效成分的含量和體外抗氧化活性，探討鐵椆樹(shù)果替代紅菇研制成天然抗氧化劑的可能性。由實(shí)驗(yàn)可知，鐵椆樹(shù)果多糖、總酚、黃酮含量（mg/g）分別為：14.100、0.022、0.040，紅菇多糖、總酚、黃酮含量（mg/g）分別為：3.000、0.013、0.260，在清除DPPH自由基能力方面，鐵椆樹(shù)果多糖（94.32%）高于紅菇多糖（70.79%），呈極顯著差異（P0.01）；鐵椆樹(shù)果總酚（84.87%）高于紅菇總酚（81.43%），鐵椆樹(shù)果黃酮（93.05%）低于紅菇黃酮（95.64%），都不呈顯著差異（P0.05）；在還原力方面，鐵椆樹(shù)果多糖（1.058）、總酚1.679）、黃酮（2.366）均高于紅菇多糖（0.201）、總酚（0.415）、黃酮（0.356），都呈極顯著差異（P0.01）。在清除O2-能力方面，鐵椆樹(shù)果多糖（17.86%）、總酚（10.69%）都低于紅菇多糖（70.14%）、總酚（54.85%），呈極顯著差異（P0.01）；鐵椆樹(shù)果黃酮（56.23%）低于紅菇黃酮（62.42%），呈顯著差異（P0.05）。4.2小結(jié)從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，清除DPPH自由基能力依次為：鐵椆樹(shù)果三成分幾乎都高于紅菇三成分。還原力大小依次為：鐵椆樹(shù)果三成分均高于紅菇三成分。清除超氧陰離子自由基能力依次為：鐵椆樹(shù)果三成分均低于紅菇三成分。結(jié)果說(shuō)明鐵椆樹(shù)果多糖、總酚的含量、DPPH自由基清除能力和還原力都高于紅菇多糖、總酚，超氧陰離子清除能力低于紅菇多糖、總酚，表明鐵椆樹(shù)果多糖、總酚的抗氧化能力在一定程度上強(qiáng)于紅菇多糖、總酚；鐵椆樹(shù)果黃酮的含量、DPPH自由基清除能力和超氧陰離子清除能力低于紅菇黃酮，還原力高于紅菇黃酮，表明紅菇黃酮抗氧化能力在一定程度上優(yōu)于鐵椆樹(shù)果黃酮。在清除DPPH自由基能力、還原力方面鐵椆樹(shù)果的抗氧化活性幾乎都強(qiáng)于紅菇，清除O2-能力方面鐵椆樹(shù)果的抗氧化活性弱于紅菇，總之鐵椆樹(shù)果的抗氧化活性略強(qiáng)于紅菇，可在一定程度上作為紅菇的抗氧化活性功能替代物。5.展望研究植物和中草藥中的抗氧化成分，不僅具有重要的理論意義，更重要的是抗氧化劑在藥用和保健品等方面具有很高的實(shí)用價(jià)值。鐵椆樹(shù)是紅菇的共生樹(shù)，資源十分豐富，具有巨大的開(kāi)發(fā)和利用潛力。本文通過(guò)測(cè)定紅菇和鐵椆樹(shù)果各有效成分提取液的DPPH、還原力和O2-的清除能力，并比較其抗氧化能力大小，以求能用更加實(shí)惠的鐵椆樹(shù)資源替代昂貴的紅菇走向藥用與保健品市場(chǎng)。本實(shí)驗(yàn)表明鐵椆樹(shù)果的抗氧化活性略強(qiáng)于紅菇，可在一定程度上作為紅菇的抗氧化活性功能替代物。由于時(shí)間有限，對(duì)于紅菇和鐵椆樹(shù)果在其它方面的生物活性如抗菌、抗腫瘤、抗衰老作用的比較有待進(jìn)一步研究。致謝一路走來(lái)，非常感謝在這兩年的教學(xué)和生活中給予我深切支持、幫助和關(guān)懷的老師和同學(xué)們。我的論文設(shè)計(jì)從一開(kāi)始的選題、策劃方案、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)儀器藥品、開(kāi)始實(shí)驗(yàn)分析數(shù)據(jù)、直至論文撰寫(xiě)的整個(gè)過(guò)程，忙碌了許久時(shí)間終于接近尾聲。由于經(jīng)驗(yàn)的匱乏，在整個(gè)設(shè)計(jì)過(guò)程中難免有許多考慮不周全的地方，如果沒(méi)有導(dǎo)師的指導(dǎo)，以及一起工作的同學(xué)們的支持，想要完成這個(gè)設(shè)計(jì)是難以想象的。首先我特別感謝組長(zhǎng)林芳老師的指導(dǎo)，林芳老師嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的治學(xué)態(tài)度、積極進(jìn)取的科研精神、非常淵博的知識(shí)、敏銳的學(xué)術(shù)思維、孜孜以求的工作作風(fēng)和誨人不倦的師者風(fēng)范對(duì)我產(chǎn)生重要影響。非常感謝林老師給我提供良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)各方面的指導(dǎo)。從論文的選題到做實(shí)驗(yàn)的過(guò)程，林老師給予具體的指導(dǎo)和幫助，讓我能夠順利完成本次畢業(yè)論文。在此，請(qǐng)?jiān)试S我再次向尊敬的林老師表示真摯的謝意！其次，我還要感謝我的好友兼同事岑敏姬老師、楊振玉老師、黃桂文主任、王麗丹老師等，他們?yōu)槲彝瓿蓪?shí)驗(yàn)提供了巨大的幫助。非常感謝大家！參考文獻(xiàn)1陳旭健,甘耀坤,王名光等.紅菇的分離培養(yǎng)研究初探J.玉林師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)),2005,26(5):64-65,77.2甘耀坤,陳旭健,馮槐全等.廣西容縣的紅菇資源及開(kāi)發(fā)與保護(hù)J.食用菌,2005(6):11-12.3甘耀坤,婁小華,李巖. 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