中藥安全性質(zhì)量控制技術(shù)研究及應(yīng)用實(shí)例.ppt

第4章中藥安全性質(zhì)量控制技術(shù)研究及應(yīng)用實(shí)例,關(guān)于中藥有毒、無(wú)毒的現(xiàn)代認(rèn)識(shí),一、毒的涵義在本草中是一個(gè)廣義的概念，有毒無(wú)毒是指藥物對(duì)人體有無(wú)毒性而言。周禮謂：“聚毒藥以共醫(yī)事”，這里的毒藥為中藥的總稱。明代張景岳認(rèn)為：“藥以治病，因毒為能，所謂毒者，因氣味之偏也”。,中藥毒性的含義：毒性即為偏性（藥性）以偏糾偏是中藥治療疾病的基本原則用之得當(dāng)即可發(fā)揮治療作用用之不當(dāng)則可毒害機(jī)體,兩種誤解,正確理解,中藥安全無(wú)毒，無(wú)不良反應(yīng),中藥有毒，全面禁用,中藥西藥都有不良反應(yīng),利大于弊者，應(yīng)用,弊大于利者，禁用,二、中藥安全性的觀點(diǎn),國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局公布2009年全國(guó)不良反應(yīng)/事件報(bào)告638996例。,1、不良反應(yīng)病例中：,化學(xué)藥占86.7%，涉及3100多個(gè)品種。,中藥占13.3%，涉及2600多個(gè)品種,化學(xué)藥不良反應(yīng)中，注射劑占61%。,中藥不良反應(yīng)中，注射劑占52%。,2、說(shuō)明：化學(xué)藥（西藥）的不良反應(yīng)超過(guò)中藥。注射劑的不良反應(yīng)超過(guò)口服藥西藥注射劑的不良反應(yīng)超過(guò)中藥注射劑,例1反應(yīng)停,不良反應(yīng)近10000例（海豹兒）死亡近5000例,三、舉例說(shuō)明,例22007年美國(guó)FDA對(duì)十大藥品發(fā)出最嚴(yán)重的“黑框警告”,小柴胡湯“肺炎”馬兜鈴酸“腎衰”魚腥草注射劑“過(guò)敏性休克”雙黃連注射液“中毒死亡”活血破血中藥臟器出血臨床嚴(yán)重毒性報(bào)道頻頻,中藥不良反應(yīng)事件,關(guān)于中藥毒性的熱點(diǎn)問(wèn)題,“馬兜鈴”的震撼“小柴胡湯”事件的反思“魚腥草注射液”的風(fēng)波,“馬兜鈴”的震撼,1993年比利時(shí)學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)2例女性服中草藥減肥治療后，出現(xiàn)進(jìn)行性腎間質(zhì)纖維化，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該減肥藥中加入了防己，患者服用后血肌酐于3個(gè)月內(nèi)升高一倍，腎活檢顯示廣泛間質(zhì)纖維化。經(jīng)藥物成分分析發(fā)現(xiàn)，減肥膠囊中含有馬兜鈴酸。至1998年在比利時(shí)有100人患馬兜鈴酸腎病。,“馬兜鈴”的震撼,比利時(shí)學(xué)者報(bào)告了服用含有馬兜鈴酸的中草藥致急進(jìn)性腎功能衰竭，并稱這種腎臟損害為“中草藥腎病(ChineseHerbNephropathy,CHN)”。此后，有關(guān)馬兜鈴酸引起腎臟損害的問(wèn)題，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注并陸續(xù)發(fā)表有關(guān)研究報(bào)告。,“馬兜鈴”的震撼,國(guó)內(nèi)學(xué)者認(rèn)為，不宜籠統(tǒng)地將馬兜鈴類植物引起的腎臟損害稱作“中草藥腎病”。馬兜鈴酸(aristolochicacid，AA)是引起CHN的一類藥物的主要毒性成分之一，故稱為“馬兜鈴酸腎病”(AAN)較為合適，目前國(guó)外學(xué)者也應(yīng)用了這一病名。,“馬兜鈴”的連鎖反應(yīng),中藥馬兜鈴是馬兜鈴科多年生植物馬兜鈴的成熟果實(shí)?？?、微辛，寒，歸肺、大腸經(jīng)。清肺化痰，止咳平喘。用量不宜過(guò)大，以免引起嘔吐。,中藥馬兜鈴,“馬兜鈴”的連鎖反應(yīng),AA是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物中所含的共同成分，含有或可能含有馬兜鈴酸的常用中藥品種為馬兜鈴、天仙藤、青木香、廣防己、關(guān)木通、尋骨風(fēng)、朱砂蓮、細(xì)辛等。,“馬兜鈴”的連鎖反應(yīng),含馬兜鈴酸的常見(jiàn)中成藥有：龍膽瀉肝丸、耳聾丸、八正丸、純陽(yáng)正氣丸、大黃清胃丸、當(dāng)歸四逆丸、導(dǎo)赤散、甘露消毒丹、排石顆粒、跌打丸、婦科分清丸、冠心蘇合丸、蘇合丸、辛荑丸、十香返生丸、濟(jì)生桔核丸、止嗽化痰丸等。,“馬兜鈴”的連鎖反應(yīng),我國(guó)發(fā)生了龍膽瀉肝丸的“馬兜鈴酸事件”原因是用關(guān)木通替代木通2003年2月28日國(guó)家藥品監(jiān)管局發(fā)出關(guān)于加強(qiáng)對(duì)龍膽瀉肝丸監(jiān)督管理的通知,木通為木通科植物三葉木通Akebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.的木質(zhì)莖藤。功效：瀉火行水通血脈。,關(guān)木通為馬兜鈴科植物東北馬兜鈴AristolochiamandshuriensisKom.的莖藤。功效：清心火，利小便，通經(jīng)下乳。,“馬兜鈴”的連鎖反應(yīng),2002年6月，美國(guó)食品藥品管理局宣布禁售70多種含馬兜鈴酸的中成藥。香港衛(wèi)生署發(fā)言人宣布：將從2004年6月1日起，停止進(jìn)口和銷售含有馬兜鈴酸的中藥材及其制劑。歐盟、澳洲等國(guó)也禁止含馬兜鈴的中藥材及中成藥進(jìn)口。,“小柴胡湯”事件,“小柴胡湯”事件,小柴胡湯出自張仲景傷寒論組方：柴胡、人參、黃芩、大棗、半夏、生姜、甘草，共七味藥功效：疏暢氣機(jī)、調(diào)和胃腸、和解表里主治：傷寒少陽(yáng)證。往來(lái)寒熱、胸脅苦滿，苔白，脈弦,“小柴胡湯”事件,常用于感冒、慢性肝炎、肝硬化、急慢性膽囊炎、膽結(jié)石、急性胰腺炎、胸膜炎、淋巴腺炎、胃炎、胃潰瘍等國(guó)內(nèi)外研究證明，小柴胡湯對(duì)肝癌、肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤，預(yù)防其惡性轉(zhuǎn)化具有一定作用,“小柴胡湯”曾風(fēng)靡日本,20世紀(jì)70年代初期，日本的津村順天堂制成了小柴胡湯顆粒制劑。1976年，日本京畿大學(xué)東洋醫(yī)學(xué)研究所主任有地滋教授通過(guò)年研究，在和漢藥研討會(huì)上發(fā)表了“津村小柴胡湯顆粒對(duì)慢性肝炎有治療效果”的報(bào)告，在日本引起不同凡響。,“小柴胡湯”曾風(fēng)靡日本,此后有21家漢方廠家加入生產(chǎn)開發(fā)小柴胡湯行列，對(duì)小柴胡湯進(jìn)行多方面的研究，呈現(xiàn)了空前的小柴胡湯熱。20世紀(jì)70-90年代小柴胡湯在日本是使用最多的藥物，廣泛地應(yīng)用于治療慢性肝炎。估計(jì)每年服用小柴胡湯者有100萬(wàn)人，消費(fèi)金額約90億130億日元。,“小柴胡湯”事件,1989年12月日本胸部疾患學(xué)會(huì)雜志首次報(bào)道了小柴胡湯引起藥物性肺炎例，之后其他報(bào)刊也陸續(xù)刊登了小柴胡湯引起肝功損傷之類的報(bào)道，對(duì)間質(zhì)性肺炎尤為重視。至1999年底，因服小柴胡湯造成間質(zhì)性肺炎已升為188例，死亡22例。,“小柴胡湯”事件,1996年3月，日本厚生省在“緊急安全情報(bào)”中發(fā)出了“關(guān)于小柴胡湯嚴(yán)重的副作用間質(zhì)性肺炎的警告”。日本厚生省2000年1月14日發(fā)出“醫(yī)藥品醫(yī)療用具等安全性情報(bào)”通令：全面禁止肝炎、肝硬化、肝癌患者使用小柴胡湯。,“小柴胡湯”事件的反思,藥方無(wú)錯(cuò)辨證有誤。濫用小柴胡湯是造成悲劇的主因。中醫(yī)治病強(qiáng)調(diào)辨證論治。不根據(jù)癥狀反應(yīng)使用小柴胡湯，又長(zhǎng)期服用一個(gè)方藥，脫離了中醫(yī)辨證論治理論。,“小柴胡湯”事件的反思,中藥必須在中醫(yī)理論指導(dǎo)下應(yīng)用。日本的“小柴胡湯副作用死亡事件”實(shí)質(zhì)，是違反了中醫(yī)辨證論治的原則，違反了中醫(yī)治病必辨方證的原則。,“魚腥草注射液”風(fēng)波,目前上市的含魚腥草的注射劑,魚腥草注射液新魚腥草素鈉氯化鈉注射液新魚腥草素鈉注射液注射用新魚腥草素鈉復(fù)方蒲公英注射液炎毒清注射液魚金注射液目前在我國(guó)有100多家生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)這類產(chǎn)品臨床使用主要是抗感染治療,魚腥草注射液不良反應(yīng),魚腥草注射液等7個(gè)注射劑在臨床應(yīng)用中出現(xiàn)了過(guò)敏性休克、全身過(guò)敏反應(yīng)、胸悶、心急、呼吸困難和重癥藥疹等嚴(yán)重不良反應(yīng)，甚至有引起死亡病例報(bào)告。,魚腥草注射液不良反應(yīng),從目前收到的病例報(bào)告和文獻(xiàn)資料分析表明，含魚腥草的注射劑與其所引起的過(guò)敏性不良反應(yīng)，存在較明確的關(guān)聯(lián)性。過(guò)敏性休克的病例報(bào)告來(lái)源和涉及企業(yè)、批號(hào)無(wú)明顯集中現(xiàn)象，說(shuō)明過(guò)敏反應(yīng)可能是該類品種的共性問(wèn)題。,2006年6月6日，國(guó)家食品藥品監(jiān)管局發(fā)出的關(guān)于暫停使用和審批魚腥草注射液等7個(gè)注射劑的通告2006年9月：國(guó)家藥監(jiān)局發(fā)出關(guān)于肌注用魚腥草注射液等注射劑恢復(fù)使用申報(bào)資料和程序的通知（急件）（國(guó)食藥監(jiān)辦2006461號(hào)）,常見(jiàn)中藥中毒原因1.劑量過(guò)大或長(zhǎng)期持續(xù)服用。2.用法不當(dāng)，沒(méi)有按中藥的正確用法使用。3.炮制不充分，有毒成分含量過(guò)高。4.患者不遵醫(yī)囑，自行服藥。5.中藥品種混亂、有毒藥物管理不善。,四、中藥中的有害物質(zhì)（一）外源性污染：包括重金屬和農(nóng)藥殘留；（二）內(nèi)源性毒性物質(zhì)：一般是指中藥自身的一些毒性次生代謝產(chǎn)物。,（一）中藥材中重金屬元素含量測(cè)定技術(shù)中國(guó)藥典2010年版（一部）要求，在中藥中通常監(jiān)控的有害重金屬主要包括鉛、鎘、汞、銅、砷等。1.前處理方法1.1濕法消解所謂濕法，是指借助化學(xué)反應(yīng)使固體試樣轉(zhuǎn)化為溶液的分解方法。通常是采用單一或混合強(qiáng)酸，在適當(dāng)?shù)臏囟认?，將樣品中的有機(jī)成分氧化破壞，使金屬化合物轉(zhuǎn)變?yōu)殡x子狀態(tài)。,1.2干法消解（灰化法）該法是通過(guò)高溫方法將試樣中的重金屬元素游離。一般是將樣品先于小火炭化至無(wú)煙，再移入馬弗爐中高溫灰化完全，冷卻，用稀酸溶解灰分，定量轉(zhuǎn)移至量瓶中。,1.3壓力消解罐消解法（高壓密封溶樣法）樣品仍采用強(qiáng)酸消解，與濕法消解不同的是樣品要置于聚四氟乙烯罐內(nèi)密封，置于烘箱內(nèi)在一定溫度下保持一定時(shí)間。,1.4微波消解法將樣品和相應(yīng)的試劑放置于高溫，高壓密閉樣品罐或敞口容器中。利用微波加熱容器中的消解液，使各樣品快速溶解的濕法消化。,2.測(cè)定方法2.1原子吸收光譜法（AAS）該法已被中國(guó)藥典2010年版收載為測(cè)定中藥材中重金屬的法定方法之一。根據(jù)各種元素的性質(zhì)及原子化的方法不同，該法又可分為火焰原子化法、非火焰原子化法和低溫原子化法。（1）火焰原子化法：該法是利用化學(xué)火焰使物質(zhì)分解并原子化的方法。可用于銅、鐵、鋅、錳、鈣等常量元素的檢測(cè)，缺點(diǎn)是原子化效率不高，火焰中自由原子濃度很低，靈敏度低。,（2）非火焰原子化法該法是利用石墨管高溫下使樣品原子化通過(guò)爐內(nèi)光路產(chǎn)生吸收的原理來(lái)測(cè)定的。與火焰原子化法相比，石墨爐原子化法樣品消耗少，特別適用于分析非常少量的試樣，靈敏度高；缺點(diǎn)是石墨管昂貴，不能同時(shí)測(cè)定多個(gè)元素。該法可用于除汞以外的重金屬元素測(cè)定。,（3）低溫原子化法該法是利用化學(xué)反應(yīng)方法預(yù)處理試樣，在室溫至攝氏幾百度的條件下使其原子化，因此又稱為化學(xué)原子化法。冷原子化法：該法專用于汞元素的測(cè)定。將樣品消解后還原生成汞，在汞蒸氣發(fā)生器中，用載氣將汞蒸氣吹出，通過(guò)石英吸收池的汞蒸氣對(duì)汞空心陰極燈的輻射產(chǎn)生吸收，從而進(jìn)行定量分析。氫化物原子化法：一般用于鉛、砷、汞等元素的測(cè)定。將氣態(tài)分析物引入石英爐內(nèi)在較低溫度下實(shí)現(xiàn)原子化的一種方法。它主要是與蒸氣發(fā)生法配合使用。,2.2原子熒光光譜法（AFS）原子熒光光譜是介于原子發(fā)射光譜和原子吸收光譜之間的光譜分析技術(shù)。它的基本原理是基態(tài)原子（一般蒸汽狀態(tài)）吸收合適的特定頻率的輻射而被激發(fā)至高能態(tài)，而后激發(fā)過(guò)程中以光輻射的形式發(fā)射出特征波長(zhǎng)的熒光，通過(guò)測(cè)定原子熒光的強(qiáng)度即可求得樣品中該待測(cè)元素的含量。,2.3電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）本法為中國(guó)藥典2010年版附錄新收載的方法。基本原理是樣品由載氣引入霧化系統(tǒng)進(jìn)行霧化后，以氣溶膠形式進(jìn)入等離子體的中心通道，在高溫和惰性氣氛中被充分蒸發(fā)、原子化、電離和激發(fā)，使所含元素發(fā)射各自的特征譜線。根據(jù)各元素特征譜線的存在與否，鑒別樣品中是否含有某種元素（定性分析）；由特征譜線的強(qiáng)度測(cè)定樣品中相應(yīng)元素的含量（定量分析）。,2.4電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）與ICP-AES相比，該法最大的優(yōu)點(diǎn)是檢出限極低，達(dá)到了pg.ml-1級(jí)的水平。其次分析精密度高、分析速度快、可同時(shí)測(cè)定含量差別較大的各組分，可用于絕大多數(shù)重金屬元素的定性分析和定量分析，同時(shí)進(jìn)行多種元素及同位素的測(cè)定，是目前痕量元素分析領(lǐng)域中最先進(jìn)的方法。,2.5其他方法（1）比色法：主要用于重金屬總量和總砷的測(cè)定。（2）紫外分光光度法：該法是利用重金屬元素與試劑反應(yīng)后顯色，在紫外光下有吸收的原理來(lái)測(cè)定重金屬的含量。多用于鉛、汞的測(cè)定。（3）高效液相色譜法（4）極譜法（5）免疫學(xué)方法（6）激光誘導(dǎo)擊穿光譜法,第二節(jié)中藥中農(nóng)藥殘留測(cè)定技術(shù),一.前處理技術(shù)中藥材的提取與凈化：目的是將中藥材中殘留的微量農(nóng)藥殘留物提取出來(lái)，又不能引入新的溶劑污染。實(shí)際上是分離與凈化技術(shù)的綜合應(yīng)用。1.超臨界流體萃取技術(shù)（SFE）超臨界流體，是指溫度和壓力處于臨界溫度和臨界壓力之上的流體。常用的萃取劑是二氧化碳，適宜非極性和極性較小的物質(zhì)的提取。若要提取極性大的成分，可以加入適宜的夾帶劑（如甲醇、乙醇和水等）。,2.固相萃取（SPE）和固相微萃取技術(shù)（SPME）固相萃?。菏抢霉腆w吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，使其與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。,固相微萃取法：根據(jù)吸附-解吸原理，在進(jìn)樣器的針頭部分涂一層固定液或鍵合一層固定相，直接將其插入液體樣品或樣品的頂空，萃取、濃縮有機(jī)化合物后，將進(jìn)樣器直接插入GC進(jìn)樣口加熱，使被測(cè)物質(zhì)進(jìn)入分析器進(jìn)行測(cè)定。主要和氣相色譜以及液相色譜聯(lián)用。,3.加速溶劑萃?。ˋSE）加速溶劑萃取是在較高的溫度（50200）和壓力（10003000psi或10.320.6MPa）下用溶劑萃取固體或半固體樣品的新穎樣品前處理方法。優(yōu)點(diǎn)：有機(jī)溶劑用量少，10g樣品一般僅需15ml溶劑；快速，完成一次萃取全過(guò)程的時(shí)間一般僅需15min；基體影響??；萃取效率高，選擇性好，已進(jìn)入美國(guó)EPA標(biāo)準(zhǔn)方法；且使用方便、安全性好，自動(dòng)化程度高。,4.凝膠滲透色譜（GPC）凝膠滲透色譜基于體積排阻的分離機(jī)制，是利用有機(jī)溶劑和疏水凝膠大分子從樣品中提取分離不同分子量干擾物的一種常用有效分離技術(shù)。被測(cè)量的高聚物溶液通過(guò)一根內(nèi)裝不同孔徑的色譜柱，柱中可供分子通行的路徑有粒子間的間隙（較大）和粒子內(nèi)的通孔（較?。?。當(dāng)聚合物溶液流經(jīng)色譜柱時(shí)，較大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能從粒子間的間隙通過(guò)，速率較快；而較小的分子可以進(jìn)入粒子中的小孔，通過(guò)的速率要慢得多。經(jīng)過(guò)一定長(zhǎng)度的色譜柱，分子根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量被分開，相對(duì)分子質(zhì)量大的在前面（即淋洗時(shí)間短），相對(duì)分子質(zhì)量小的在后面（即淋洗時(shí)間長(zhǎng)）。,二、定量技術(shù)氣相色譜法定義：以惰性氣體為流動(dòng)相，以固定液或固體吸附劑作為固定相的色譜法稱為氣相色譜法。以固定液作為固定相的色譜稱為氣液色譜，以固體吸附劑作為固定相的色譜稱為氣固色譜。原理：使混合物中各組分在兩相間進(jìn)行分配,其中一相是不動(dòng)的(固定相),另一相(流動(dòng)相)攜帶混合物流過(guò)此固定相,與固定相發(fā)生作用,在同一推動(dòng)力下,不同組分在固定相中滯留的時(shí)間不同,依次從固定相中流出。通常采用的檢測(cè)器有：熱導(dǎo)檢測(cè)器，火焰離子化檢測(cè)器，氦離子化檢測(cè)器，超聲波檢測(cè)器，光離子化檢測(cè)器，電子捕獲檢測(cè)器，火焰光度檢測(cè)器，電化學(xué)檢測(cè)器，質(zhì)譜檢測(cè)器等。,中國(guó)藥典2010年版一部附錄收載氣相色譜法用來(lái)測(cè)定農(nóng)藥殘留量，包含了3中有機(jī)氯類、12種有機(jī)磷類和3種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。,定量分析與方法學(xué)驗(yàn)證,生藥中化學(xué)成分的定量分析是評(píng)價(jià)生藥質(zhì)量的重要手段。常用：分光光度法和色譜法。用于生藥定量分析的方法必須進(jìn)行驗(yàn)證，以證明采用的含量測(cè)定符合相應(yīng)的分析要求。驗(yàn)證內(nèi)容：準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、檢測(cè)限、定量限、線性、范圍和耐用性。,（一）準(zhǔn)確度指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般用回收率表示。應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)試。測(cè)定方法的準(zhǔn)確度用已知純度的對(duì)照品做加樣回收率測(cè)定，加入對(duì)照品的量要適當(dāng)對(duì)照品的加入量與供試品中已知含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)。數(shù)據(jù)要求同一濃度供試品溶液，6個(gè)測(cè)定結(jié)果或3不同濃度分別制備3份不同溶液。一般中間濃度為所取供試品含量的100%水平，80%120%,（二）精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。重復(fù)性（批內(nèi)精密度）系指同一分析人員在同一條件下對(duì)同一批樣品至少制備6份以上或3個(gè)不同濃度分別制備3粉供試品溶液（9份），進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD值一般要求不大于5。中間精密度系指在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，在不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果之間的精密度?？疾祀S機(jī)變動(dòng)因素對(duì)精密度的影響。,3.重現(xiàn)性系指在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果之間的精密度。（三）專屬性又稱為選擇性。通常以不含被測(cè)成分的供試品作為空白樣品進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)說(shuō)明。（四）檢測(cè)限供試品中被測(cè)成分能被檢出的最低濃度或最小量，無(wú)需準(zhǔn)備定量。,（五）定量限指供試品中被測(cè)成分能被定量測(cè)定的最低量，反應(yīng)分析方法是否具備靈敏的定量檢測(cè)能力。（六）線性范圍（八）耐用性系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度。,二、定量技術(shù)2.高效液相色譜法（HPLC）定義：高效液相色譜是以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。特點(diǎn)：高壓、高效、高速。尤其適合于高沸點(diǎn)、受熱不穩(wěn)定易分解的農(nóng)藥殘留檢測(cè)，如取代脲、氨基甲酸酯、黃酰脲類農(nóng)藥。,2019/11/20,根據(jù)流動(dòng)相和固定相的相對(duì)極性的不同可以將HPLC分為2種類型，即正相和反相色譜。在正相液相色譜中，流動(dòng)相的極性小，通常為非極性的烷烴，固定相的極性大，通常為硅膠、纖維素等；在反相液相色譜中，流動(dòng)相的極性大，通常為水一甲醇溶液、水一乙氰溶液等，固定相通常為鍵合的C18、C4等,極性較弱。反相液相色譜的應(yīng)用相對(duì)廣泛。,2019/11/20,液相色譜的定性依據(jù)是保留時(shí)間的相對(duì)性，通常相對(duì)誤差不能大于5。定量參數(shù)常常采用峰高、峰面積、相對(duì)峰高、相對(duì)峰面積等。定量方法通常采用外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法和面積歸一化法。外標(biāo)法可分為外標(biāo)一點(diǎn)法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法等。,2019/11/20,l、外標(biāo)一點(diǎn)法(直接比較法)用與樣品類似的濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，等量進(jìn)樣，比較它們的峰高或峰面積。Cx一未知樣濃度Cd標(biāo)樣濃度Ax未知樣峰面積A標(biāo)樣峰面積,2019/11/20,2、外標(biāo)法(工作曲線法)Cx一未知樣濃度Ax未知樣峰面積Kx一直接斜率,（1）柱切換高效液相色譜技術(shù)柱切換技術(shù)是指用閥來(lái)改變流動(dòng)相走向和流動(dòng)相系統(tǒng)，從而使洗脫液在一特定時(shí)間內(nèi)從預(yù)處理柱進(jìn)入到分析柱的在線固相分離技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：提高色譜系統(tǒng)的分辨率和選擇性；使待測(cè)組分富集，提高靈敏度；在一個(gè)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)多個(gè)分離目標(biāo)；在線衍生化，提高靈敏度和重現(xiàn)性；在線凈化樣品，樣本不需預(yù)處理或預(yù)處理大大簡(jiǎn)化，可直接進(jìn)樣分析。,（2）高效液相色譜柱后衍生熒光法該方法主要是針對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥。衍生化是藥物分析中常用的一種分析手段。其原理是待測(cè)樣品與衍生化試劑定量快速反應(yīng)，并加入特定的功能的基團(tuán)生成符合檢測(cè)要求的衍生化物，通過(guò)檢測(cè)生成衍生化物的量間接測(cè)定待測(cè)樣品的量。,通過(guò)合適的化學(xué)反應(yīng),生成特殊衍生化物，1.改變待測(cè)物的色譜保留特性以改善分離度；2.改變待測(cè)物的檢測(cè)特性，以增加其對(duì)檢測(cè)器的響應(yīng)（例：紫外標(biāo)記、熒光標(biāo)記、電化學(xué)標(biāo)記）；3.生成穩(wěn)定的衍生化物，改善待測(cè)物的不穩(wěn)定性（例：-SH基團(tuán)易氧化的問(wèn)題可通過(guò)?；瘉?lái)解決）。,化學(xué)衍生化的目的:,HPLC化學(xué)衍生化分類在線化學(xué)衍生化是否與HPLC系統(tǒng)聯(lián)機(jī)離線化學(xué)衍生化柱前衍生化發(fā)生衍生化發(fā)應(yīng)的先后柱后衍生化,柱前衍生化在色譜分離前，預(yù)先將樣品制成適當(dāng)?shù)难苌?，然后再進(jìn)入色譜柱進(jìn)行分離檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：（1）對(duì)用作流動(dòng)相的溶劑體系沒(méi)有限制；（2）反應(yīng)條件，反應(yīng)速率不受限制；（3）通過(guò)選擇合適的試劑以及萃取方法，可以消除許多干擾；（4）過(guò)量溶劑、試劑容易除去；（5）轉(zhuǎn)變成合適的衍生物，可使分離度改進(jìn)。,缺點(diǎn):（1）操作過(guò)程繁瑣，容易影響定量準(zhǔn)確性。（2）當(dāng)一個(gè)復(fù)雜組分樣品經(jīng)過(guò)衍生化反應(yīng)后，有可能產(chǎn)生多種衍生化產(chǎn)物給色譜分離帶來(lái)困難。,柱后衍生化,將樣品先注入色譜柱，按選定的色譜條件使樣品組分得以分離，當(dāng)各個(gè)組分從色譜柱流出后，分別與衍生化試劑相遇，在一定的反應(yīng)條件下，生成具有某種檢測(cè)特性的衍生化產(chǎn)物再進(jìn)入檢測(cè)器。,要求：（1）對(duì)流動(dòng)相的選擇更嚴(yán)格，必須考慮衍生化試劑、反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度，以及它們與流動(dòng)相可能發(fā)生的副反應(yīng)；（2）由于在高效液相色譜中采用高流速，因此反應(yīng)速率必須很快（小于30s）；（3）檢測(cè)器對(duì)衍生化試劑不能有響應(yīng)。,柱后衍生流程圖如下：,泵,進(jìn)樣閥,色譜柱,衍生化試劑泵,反應(yīng)器,檢測(cè)器,記錄儀,紫外衍生化熒光衍生化電化學(xué)衍生化手性衍生化固定化酶反應(yīng)器（IMER）,衍生化反應(yīng)類別：,熒光衍生反應(yīng)在液相色譜法中，熒光檢測(cè)器是一種高靈敏度、高選擇性的檢測(cè)器