MASSARRAY原理.doc

MassARRAY圖1MassARRAY系統(tǒng)由美國Sequenom 公司開發(fā)，在癌癥研究、遺傳學(xué)分析、分子診斷和藥學(xué)等領(lǐng)域已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用，受到全球多個(gè)頂尖研究中心的推崇。應(yīng)用領(lǐng)域飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)搭配不同Sequenom的檢測(cè)和軟件模塊，可以在一個(gè)平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)以下技術(shù)：SNP分型以及SNP位點(diǎn)等位基因頻率計(jì)算體細(xì)胞突變檢測(cè)和分析甲基化定量分析基因表達(dá)定量分析CNV檢測(cè)分析寡核苷酸質(zhì)量控制和檢測(cè)檢測(cè)服務(wù)流程客戶提供DNA或者各類生物樣本以及檢測(cè)位點(diǎn)信息樣本完整性檢測(cè)以及前處理引物設(shè)計(jì)、合成PCR擴(kuò)增、SAP純化、延伸或轉(zhuǎn)錄裂解點(diǎn)樣質(zhì)譜分析分析報(bào)告SNP分型1、技術(shù)名稱Sequenom MassARRAY SNP基因型分析技術(shù)MassARRAY技術(shù)流程：2、技術(shù)原理Sequenom SNP 檢測(cè)系統(tǒng)基本原理為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS) 技術(shù)。主要特點(diǎn)是，PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，加入SNP序列特異延伸引物，在 SNP 位點(diǎn)上，延伸 1個(gè)堿基。然后將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空管 , 而后用瞬時(shí)納秒 (10-9s) 強(qiáng)激光激發(fā)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，核酸分子就會(huì)解吸附并轉(zhuǎn)變?yōu)閬喎€(wěn)態(tài)離子，產(chǎn)生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場中獲得相同的動(dòng)能，進(jìn)而在一非電場漂移區(qū)內(nèi)按照其質(zhì)荷比率加以分離，在真空小管中飛行到達(dá)檢測(cè)器。MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時(shí)間（Time-of-Flight,TOF）檢測(cè)器來檢測(cè)，離子質(zhì)量越小，就越快到達(dá)。理論上講，只要飛行管長度足夠，TOF檢測(cè)器可檢測(cè)分子的質(zhì)量數(shù)是沒有上限的。MASSARRAY SNP 檢測(cè)的質(zhì)譜范圍為5000到8500 Dalton。圖2：飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)SNP進(jìn)行分型的原理示意圖質(zhì)譜檢測(cè)3、技術(shù)特點(diǎn)靈活： 可以自由選擇感興趣的SNP位點(diǎn) 一張芯片上，樣本的數(shù)量和位置可以自由選擇 一張芯片上，樣本和SNP位點(diǎn)的配對(duì)可以自由選擇準(zhǔn)確： 直接檢測(cè)待測(cè)物分子量，準(zhǔn)確度超過99.7% 質(zhì)譜技術(shù)靈活檢測(cè)PCR實(shí)驗(yàn)失敗或三等位基因的存在高通量： 一張芯片上可完成384個(gè)樣品的多重iPLEX GOLD實(shí)驗(yàn) 每個(gè)反應(yīng)孔可實(shí)現(xiàn)多達(dá)40重反應(yīng) 每天最多能進(jìn)行十萬個(gè)基因型分析性價(jià)比高： 無需熒光標(biāo)記，成本大大降低 即便在低通量的情況下每個(gè)基因型分析的成本仍然很低上海楓林醫(yī)藥臨床檢驗(yàn)有限公司 上海楓林醫(yī)藥臨床檢驗(yàn)有限公司作為上海醫(yī)藥臨床研究中心的中心實(shí)驗(yàn)室是該中心技術(shù)支持服務(wù)的核心平臺(tái).楓林檢驗(yàn)作為一個(gè)獨(dú)立的臨床實(shí)驗(yàn)室服務(wù)提供者可以為各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)提供廣泛而專業(yè)化的外包檢驗(yàn)服務(wù)也可以為國內(nèi)外各醫(yī)藥研究機(jī)構(gòu)提供“獨(dú)立第三方” 形式的臨床研究檢測(cè)服務(wù)。實(shí)驗(yàn)室以美國病理家協(xié)會(huì)（CAP）和ISO15189的質(zhì)量認(rèn)證體系為框架進(jìn)行建設(shè)，并構(gòu)建了與國際接軌的自動(dòng)化信息系統(tǒng)。具體業(yè)務(wù)包括藥物分析、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)等藥物臨床研究服務(wù)；血液、生化、微生物、免疫、分子生物學(xué)和病理等常規(guī)檢驗(yàn)服務(wù)；以及生物基因分析、生物標(biāo)志物檢測(cè)等技術(shù)服務(wù)。 . 4、優(yōu)勢(shì)：（1）質(zhì)譜儀檢測(cè)的是分子最本質(zhì)的特征之一分子量，不涉及熒光標(biāo)記、凝膠電泳等，就能檢測(cè)一個(gè)堿基的差異，準(zhǔn)確性高，機(jī)器本身出錯(cuò)的概率非常低；（2）質(zhì)譜儀的靈敏度非常高，檢測(cè)窗口內(nèi)，任何pmol級(jí)別的物質(zhì)都能被檢測(cè)出來；（3）通量高：幾秒就能檢測(cè)完一個(gè)反應(yīng)孔；（4）操作簡單，儀器要求簡單，除質(zhì)譜儀外，都是常規(guī)PCR儀器；（5）靈活：每天可以完成幾個(gè)反應(yīng)至上萬個(gè)反應(yīng)；（6）便宜：引物不帶熒光標(biāo)記，普通長度（3條引物總長80bp左右），此外在一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)能完成4個(gè)或更多的反應(yīng)，即通常所說的4重反應(yīng)；（7）兼容性強(qiáng)：質(zhì)譜儀還能在核酸的其它方向，以及蛋白質(zhì)組學(xué)、微生物鑒定等領(lǐng)域也能應(yīng)用。（8）質(zhì)譜技術(shù)是“一管式操作”，即反應(yīng)體系在生化學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中始終在一個(gè)試管內(nèi)反應(yīng)，沒有多次轉(zhuǎn)移，這樣就減少被污染的概率。甲基化研究DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用。MassARRAY 分子量陣列基因分析系統(tǒng)EpiTYPER DNA甲基化分析技術(shù)結(jié)合了堿基特異性酶切反應(yīng)和MALDI-TOF測(cè)序原理。兩者的完美結(jié)合使得該技術(shù)成為高準(zhǔn)確性、高通量及高靈敏度的DNA甲基化定量分析手段。MassARRAY分子量陣列基因分析系統(tǒng)EpiTYPER DNA甲基化分析技術(shù)是高通量DNA甲基化定量技術(shù)。實(shí)現(xiàn)多重CpG的甲基化位點(diǎn)的定位定量檢測(cè)。配套的EpiTYPER軟件為用戶提供便捷的數(shù)據(jù)分析和報(bào)告工具。實(shí)驗(yàn)原理：堿基特異性酶切（MassCLEAVE）實(shí)驗(yàn)從亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA開始。經(jīng)過亞硫酸鹽處理DNA中的未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），由此在DNA模板中產(chǎn)生了甲基化特異的序列變化。利用5末端帶有T7-啟動(dòng)子的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)蝦堿性磷酸酶（SAP）處理后用于堿基特異性的酶切反應(yīng)。酶切后DNA片段的大小和分子量取決于亞硫酸鹽處理后的堿基變化。配套軟件EpiTYPER則能自動(dòng)報(bào)告每個(gè)相應(yīng)片段的甲基化程度。圖原理流程數(shù)據(jù)處理與輸出EpiTYPER軟件系統(tǒng)提供先進(jìn)方便的DNA甲基化定量分析手段。該軟件系統(tǒng)提供數(shù)字和圖像注釋工具，并能將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與客戶提供的DNA序列相吻合。作為內(nèi)在的質(zhì)量控制機(jī)制，該系統(tǒng)還包括了基本統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法及數(shù)據(jù)可靠程度的評(píng)估手段。圖 EpiTYPER軟件分析示意圖圖：甲基化程度質(zhì)譜原始圖平臺(tái)優(yōu)勢(shì)：高性能能夠分析覆蓋長達(dá)600bp內(nèi)的多個(gè)CpG位點(diǎn)，能夠分析福爾馬林處理的石蠟組織，無需任何熒光標(biāo)記。高精度和高準(zhǔn)確性準(zhǔn)確地進(jìn)行甲基化定量從10%到90%，標(biāo)準(zhǔn)差只有5% ，不同實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性強(qiáng)、可重復(fù)性高。高性價(jià)比用384孔板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)容積小節(jié)省試劑，一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物可以進(jìn)行多個(gè)CpG位點(diǎn)分析。操作簡單無需設(shè)計(jì)CpG位點(diǎn)特異性引物，無需進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，研究幾個(gè)到幾百個(gè)甲基化位點(diǎn)的理想手段，全自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化軟件和數(shù)據(jù)報(bào)告形式使不同樣本的比較簡便易行。CNV定量檢測(cè)基因拷貝數(shù)多態(tài)(CNV)是造成個(gè)體差異的重要遺傳基礎(chǔ)，也是近來基因組學(xué)的研究熱點(diǎn)。目前已有超過160萬個(gè)專為基因組拷貝數(shù)變異或更小的基因組區(qū)域變異檢測(cè)而優(yōu)化設(shè)計(jì)的TaqMan CNV預(yù)制試劑盒，結(jié)合 ABI 7900實(shí)時(shí)定量PCR，可對(duì)檢測(cè)樣本進(jìn)行目標(biāo)基因（具有拷貝數(shù)多態(tài)）以及參照基因（沒有拷貝數(shù)多態(tài)）拷貝數(shù)定量分析，通過比較兩個(gè)檢測(cè)值的比值可以檢測(cè)樣本的候選基因的拷貝數(shù)。檢測(cè)原理實(shí)驗(yàn)流程 CNV檢測(cè)的重要性：與遺傳病，如癌癥，免疫疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等基因組水平的異常相關(guān)基因計(jì)量效應(yīng)具有相應(yīng)的表型CYP2D6基因的拷貝數(shù)多態(tài)性與藥物代謝表型關(guān)聯(lián)CCL3L1基因的拷貝數(shù)多態(tài)性影響人對(duì)HIV/AIDS病毒的易感性檢測(cè)方法：技術(shù)優(yōu)勢(shì) 具有高度特異性和高重復(fù)性的TaqMan CNV分析技術(shù)。 超過160萬預(yù)合成的CNV檢測(cè)試劑盒，可用于檢測(cè)已知基因、已知拷貝數(shù)變化區(qū)域和非編碼基因區(qū)域。 可根據(jù)客戶需求采用ABI成熟的算法靈活設(shè)計(jì)CNV檢測(cè)試劑盒。參考文獻(xiàn)1. Gonzalez, E., et al., The Influence of CCL3L1 Gene-Containing Segmental Duplications on HIV-1/AIDS Susceptibility, Science. 2005, 307(5714): 1434-14402. Rose-Zerilli MJ, et al., Copy-number variation genotyping of GSTT1 and GSTM1 gene deletions by real-time PCR, Clin Chem. 2009 55(9): 1680-1685知名用戶Sequenom MassARRAY 平臺(tái)應(yīng)用先進(jìn)的質(zhì)譜技術(shù)，為基因組學(xué)的研究提供了無與倫比的靈敏度和特異性，被認(rèn)為是行業(yè)內(nèi)的金標(biāo)準(zhǔn)，該平臺(tái)已在全球賣出300多臺(tái)，被廣泛應(yīng)用于全球頂尖的基因研究機(jī)構(gòu)，例如：美國國立衛(wèi)生研究院，哥倫比亞大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，英國Sanger中心，日本東京大學(xué)，香港大學(xué)，香港中文大學(xué)，臺(tái)灣中央研究院，上海瑞金醫(yī)院血液病研究所，中科院北京基因組所，等等。 科研成果Sequenom以其卓越的解決方案贏得了全世界科學(xué)家的認(rèn)可。利用sequenom優(yōu)秀的技術(shù)平臺(tái)和解決方案，科學(xué)家們?cè)谝韵赂鱾€(gè)領(lǐng)域已經(jīng)或即將取得矚目的進(jìn)展和應(yīng)用。醫(yī)學(xué)SNP是繼人類基因組測(cè)序完成后人類基因組研究的又一重要研究領(lǐng)域。大量優(yōu)秀的文章和研究成果獲得。尤其是在SNP與疾病發(fā)病的關(guān)聯(lián)性方面取得很大的進(jìn)展。我國科學(xué)家也取得了優(yōu)秀的成績。如協(xié)和醫(yī)科院的林東欣教授在肺癌研究的成果和安徽醫(yī)科大學(xué)張學(xué)軍教授在銀屑病方面的研究成果均發(fā)表在nature genetics雜志上。1、腫瘤發(fā)病及其相關(guān)SNP研究和腫瘤的診斷。腫瘤的發(fā)生是多種因素的共同作用。既有環(huán)境因素的影響，又有個(gè)體內(nèi)在的易感性。這些易感性尤其體現(xiàn)在SNP上。眾多研究成果都日益證明SNP與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Sequenom系統(tǒng)在GWAS后的大樣本量的驗(yàn)證方面發(fā)生了重要作用。如Tong Sun et al. NATURE GENETICS 2007，39（5）：605-613中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院的林東欣教授實(shí)驗(yàn)室和北京基因研究所的曾長青教授實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合研究了肺癌發(fā)病與SNP相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在CASP8啟動(dòng)子上存在的6堿基缺失與肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性。采用sequenom系統(tǒng)4995例病人樣本和4972例對(duì)照樣本進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該變異與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)。Wei Zhenget al. Nature Genetics 2009, 42(2), 324 - 328美國范德比特藥學(xué)院和上海腫瘤研究所的研究者通過對(duì)中國婦女GWAS研究以發(fā)現(xiàn)乳腺癌相關(guān)變異。通過1505例病人和對(duì)照樣本的分析獲得29個(gè)候選SNPs，經(jīng)sequenom iplex系統(tǒng)在1554例病人和1576對(duì)照進(jìn)行驗(yàn)證。后經(jīng)3472例病例和900對(duì)照對(duì)四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步研究。發(fā)現(xiàn)位于ESR1基因上游的6q25.1上SNP rs2046210位點(diǎn)同乳腺癌相關(guān)聯(lián)。幾年來，采用GWAS和各種SNP驗(yàn)證方法發(fā)現(xiàn)了各種腫瘤的易感SNP位點(diǎn)。這些位點(diǎn)是否具有廣泛的代表性，是否能夠?yàn)槟[瘤的預(yù)防、治療和個(gè)體化治療所用，對(duì)SNP檢測(cè)的方法學(xué)要求十分嚴(yán)格，即要求檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，又要去檢測(cè)的高通量且價(jià)格合適。Sequenom系統(tǒng)是一個(gè)十分合適的系統(tǒng)，通量高，準(zhǔn)確度和靈敏度好，且單位檢測(cè)價(jià)格低廉。非常適合臨床應(yīng)用。2、各種重要疾病目前，糖尿病、心臟病、帕金森、銀屑病等各種流行性和重點(diǎn)疾病都證明有SNP變異有關(guān)聯(lián)。Xue-Jun Zhang et al. NATURE GENETICS 2009，42（2）：205-210安徽醫(yī)科大學(xué)張學(xué)軍教授領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室研究了銀屑病和SNP的關(guān)聯(lián)性。GWAS分析發(fā)現(xiàn)了9個(gè)位點(diǎn)的顯著差異，利用sequenom massarray系統(tǒng)在5182例病人和6516對(duì)照的研究發(fā)現(xiàn)了三個(gè)差異顯著的SNP位點(diǎn)，其中兩個(gè)位點(diǎn)為已有報(bào)道位點(diǎn)，位于LCE基因簇上的rs4085613位點(diǎn)為新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)。Robert Sladek et al. Nature 2007，445, 881-885加拿大的Constantin Polychronakos實(shí)驗(yàn)室采用GWAS分析發(fā)現(xiàn)了四個(gè)位點(diǎn)與二型糖尿病相關(guān)，并經(jīng)sequenom系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。Minerva M Carrasquilloet al. Nature Genetics 2008，41(2), 192 - 198美國Steven G Younkin團(tuán)隊(duì)通過分析844例晚期AD病例和1255例的WGAS研究獲得了25個(gè)顯著相關(guān)的位點(diǎn)，利用sequenom iplex進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證工作，發(fā)現(xiàn)在Xq21.3上的PCDH11X傷的SNP (rs5984894)與晚期AD相關(guān)3、流行病學(xué)和病源微生物檢測(cè)Sequenom系統(tǒng)和SNP同樣在流行病學(xué)和病源微生物的分型檢測(cè)上具有光明的應(yīng)用前景。目前針對(duì)于HPV分型的檢測(cè)、乙肝耐藥性的檢測(cè)、結(jié)核病耐壓性的檢測(cè)研究都在飛速進(jìn)展。H. YangPNAS 2005, 102:7683-7688HPV已經(jīng)被證明與宮頸癌、食管癌等腫瘤的發(fā)生相關(guān)。但由于HPV分型繁多，只有高危型HPV才有致病風(fēng)險(xiǎn)。因此，HPV的檢測(cè)不僅是檢測(cè)HPV的存在與否，更重要的是檢測(cè)HPV分型。利用Sequenom系統(tǒng)，D. M. Kurnita實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)了在人血清中進(jìn)行HPV分型，靈敏度由于RT-qPCR，且特異性得到保證。后續(xù)的研究不僅實(shí)現(xiàn)了HPV的分型檢測(cè)，且可以一次反應(yīng)進(jìn)行20中HPV分型。研究者可以把所有已報(bào)道的高危型HPV都包括進(jìn)來。一次反應(yīng)，多種分型檢測(cè)。M Jallow et al. Nature Genetics 41, 657 - 665 (2009)瘧疾一致肆虐非洲，來自岡比亞和牛津大學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)2500兒童進(jìn)行了SGWA分析，驗(yàn)證研究利用了3400例兒童，研究發(fā)現(xiàn)瘧疾的易感性可能同SNP相關(guān)聯(lián)。4、法醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用SNP在個(gè)體識(shí)別、人種識(shí)別以及外形推斷方面具有巨大潛力。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域, SNP 也越來越受到大家的重視。第一, SNP 大都表現(xiàn)為二等位基因標(biāo)記, 即人群中只有二個(gè)等位基因, 易于分型和確定基因頻率, 適于混合樣品的分析。第二, 突變率非常低, 在父權(quán)鑒定中非常有利。第三,適合高通量技術(shù)分析, 有利于數(shù)據(jù)庫的建立和實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。特別有意義的是, 由于擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小對(duì)于分析降解檢材的成功與否至關(guān)重要, SNP 基因座的片段更短,識(shí)別序列可以為45-55bp, 因而引物可以設(shè)計(jì)得距SNP位點(diǎn)很近, 更適合分析降解DNA。當(dāng)然, SNP 也有一些局限性。經(jīng)專家估計(jì)要達(dá)到與目前所用STR 試劑盒一樣的識(shí)別率, 至少要50 個(gè)SNP 位點(diǎn), sequenom