PCR擴(kuò)增與細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制有何異同.doc

PCR擴(kuò)增與細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制有何異同有關(guān)PCRPCR是高溫解旋體內(nèi)用的是DNA解旋酶 DNA復(fù)制是以自身為模板，邊解旋，邊復(fù)制，邊折疊的。自身DNA復(fù)制有一個(gè)變構(gòu)問(wèn)題。PCR是一個(gè)一個(gè)核苷酸或脫氧核苷酸用酶接上去，再洗脫再接下一個(gè)的。形成的是單鏈，而且沒(méi)有包裹的蛋白。 PCR 是一個(gè)體外過(guò)程，他們的酶不同，反應(yīng)條件也不同，復(fù)制產(chǎn)物可以是雙鏈，也可以是單鏈！ PCR是體外擴(kuò)增DNA的過(guò)程所需溫度較高,分三個(gè)階段:高溫解鏈,低溫復(fù)性,中溫合成,都在50度到95度之間.所需的酶不一樣:PCR用耐熱的TAQ酶.PCR擴(kuò)增的是特定的序列位于兩個(gè)引物之間的那一段DNA.另外,PCR可以復(fù)制DNApcr 全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。其基本原理和生物復(fù)制一樣，都要引物等。PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 也可復(fù)制RNA呢 單的說(shuō),PCR是將少量DNA在細(xì)胞外(首先要將DNA從細(xì)胞中取出)快速擴(kuò)增的方法,能在數(shù)小時(shí)內(nèi)將DNA擴(kuò)增百萬(wàn)倍.樣品的量即使非常少,也能被放大很多倍.DNA復(fù)制是在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的.像細(xì)菌數(shù)小時(shí)DNA復(fù)制幾次差不多了(復(fù)制時(shí)間同環(huán)境有關(guān),比如有沒(méi)有足夠的養(yǎng)料).既然學(xué)的就是這個(gè)專業(yè),看看專業(yè)的涉及PCR的文章不就了解了,從概念上說(shuō)PCR和生物自身的DNA復(fù)制的區(qū)別很簡(jiǎn)單,具體的細(xì)節(jié)就復(fù)雜了,PCR也不止一種PCR技術(shù) DNA生物復(fù)制環(huán)境 體外復(fù)制， 加熱，90攝氏度左右 體內(nèi)，溫和的環(huán)境模板 DNA單鏈 DNA單鏈原料 4種脫氧核糖核苷酸 4種脫氧核糖核苷酸酶 主要是DNA聚合酶 DNA解旋酶，DNA聚合酶， DNA連接酶等各種酶 引物 需要人工合成的引物 自己合成引物成分步驟 變性-退火-延伸 解旋-起始-延伸-結(jié)束原則 堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 堿基互補(bǔ)配對(duì)原則PCR是DNA的體外擴(kuò)增技術(shù). DNA復(fù)制是有生命力的細(xì)胞在體內(nèi) 自我復(fù)制的過(guò)程 ,屬于體內(nèi)擴(kuò)增.PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))原理 PCR是體外酶促合成特異DNA片段的方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成： 即在高溫（95）下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫（3755）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72）下，以引物3端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過(guò)一次解鏈、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進(jìn)行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)2530個(gè)循環(huán)后，理論上可使基因擴(kuò)增109倍以上，實(shí)際上一般可達(dá)106107倍。DNA復(fù)制過(guò)程:(一)復(fù)制的起始 1.螺旋的松弛與解鏈拓?fù)洚悩?gòu)酶-能改變DNA空間構(gòu)像的酶 作用：DNA復(fù)制時(shí)松弛超螺旋，以利復(fù)制叉的行進(jìn)及DNA合成，合成后再引向超螺旋。功能：不清楚，可催化體外拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)，拓?fù)洚悩?gòu)酶分兩型。 拓?fù)洚悩?gòu)酶I （topoisomerase- I ）作用：松弛超螺旋，不需ATP, 作用機(jī)制：切開(kāi)環(huán)狀一條鏈、打結(jié)與解結(jié)原核：拓?fù)洚悩?gòu)酶I對(duì)負(fù)超螺旋作用正超螺旋 真核：拓?fù)洚悩?gòu)酶I對(duì)正、負(fù)超螺旋均有作用。 拓?fù)洚悩?gòu)酶-旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）作用：松弛超螺旋，作用機(jī)制： 切開(kāi)環(huán)狀兩條鏈、打結(jié)與解結(jié)、環(huán)連與解環(huán)連 解鏈酶 （helicase）-復(fù)制蛋白rep 作用：ATP供能時(shí)，解開(kāi)DNA雙鏈。 原核：編碼解鏈酶的基因是dnaB。前導(dǎo)鏈結(jié)合rep蛋白，隨從鏈結(jié)合解鏈酶II、 單鏈結(jié)合蛋白（SSB）作用：SSB與解開(kāi)DNA單鏈結(jié)合，保護(hù)穩(wěn)定DNA。與新復(fù)制DNA單鏈結(jié)合，以防其降解。 螺旋松弛與解鏈過(guò)程如圖所示 2.引發(fā) 引物酶（primase） 作用：以DNA為模板，自53合成RNA小片段約十幾到幾十個(gè)核苷酸， 3末端為-OH。 原核：dnaG基因編碼DnaG蛋白即引物酶。 引發(fā)前體（preprimosome） 由多種蛋白因子組成復(fù)合物。 作用：合成RNA引物，沿隨從鏈復(fù)制叉的行進(jìn)方向移動(dòng)，在不同部位，合成RNA引物。 小結(jié)：合成RNA引物，在引物3-OH末段進(jìn)行DNA片段合成。 二 DNA鏈的延長(zhǎng) 反應(yīng)體系：DNA模板，DNA聚合酶，dNTP，引物，Mg2+ 反應(yīng)式：DNA+dNTP（DNA）n+1+ppi 真核與原核中DNA聚合酶（DNA polymorase-DNApol）： 有幾種類型，作用方式相同，但各具特性及功能。 1.大腸桿菌DNA聚合酶（3種） pol I：催化53的聚合作用，合成20個(gè)核苷酸即離開(kāi)模板，填充空隙。 35外切酶活性，去除錯(cuò)誤堿基，有校對(duì)作用。 53外切酶活性，去除RNA引物及修正錯(cuò)誤堿基。 pol II：催化53 DNA合成并具有35外切酶活性，體內(nèi)功能不清楚。 pol : DNA鏈延長(zhǎng)起主要作用，細(xì)菌中以1000dNTP/秒進(jìn)行聚合反應(yīng)。 35外切酶活性，校對(duì)作用，與pol I配合使錯(cuò)誤率降至10-6。如圖所示 DNA復(fù)制的保真性：遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律。-聚合酶對(duì)堿基的選擇功能。聚合酶對(duì)錯(cuò)誤堿基的校讀作用。以上三種作用確保了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。 2、真核生物DNA聚合酶 特性與大腸桿菌相似，共五種：、 pol：催化前導(dǎo)鏈及隨從鏈的合成，需增殖細(xì)胞核抗原蛋白PCNA的參與。 pol：與引發(fā)酶配合，參與隨從鏈的合成。 RFA（replication factor A）