輸血科操作規(guī)程.doc

.目 錄 1、輸血前檢測實驗程序 2、改良低離子聚凝胺法實驗操作規(guī)程 3、ABO 血型鑒定 4、Rh（D）血型鑒定 5、抗體篩選和鑒定試驗 輸血前檢測實驗程序1、實驗要求 血清和血漿都可以用于交叉實驗和抗體檢測，最好是血清標本，標本使用限制在 3 天內，含有肝素等抗凝標本可以用凝血酶或硫酸魚精蛋白處理使其凝集析出血清。允許通過靜脈輸液口采集標本，但必須丟棄受殘留靜脈輸液影響的 5ml標本。一般不允許使用溶血標本，對急性溶血性貧血和燒傷病人的溶血標本，在實驗前后必須做溶血程度的比較。標本和輸血申請單上的所有資料必須填寫清楚并完全符合，否則應重抽標本。對所有用過的獻血員和受血者標本必須在 1-6冰箱至少保存 7 天，所有實驗都必須保證觀察和記錄同時進行，且記錄和資料都必須至少保存 5 年。 2、血型檢測 要求完成病人 ABO 正反定型、Rh（D）。 3、交叉試驗 3.1 受血者交叉配血時所用的標本必須是輸血前 3 天之內的。3.2 配血時要逐項核對輸血申請單、受血者和供血者血樣，復查受血者和供血者ABO 血型（正、反定型），并常規(guī)檢查患者 Rh（D）血型（急診搶救患者緊急輸血時 Rh（D）檢查除外），正確無誤時可進行交叉配血。 3.3 凡是輸注全血、濃縮紅細胞、紅細胞懸液、洗滌紅細胞、冰凍紅細胞、濃縮紅細胞、手工分離濃縮血小板等患者，應該進行交叉配血試驗。機器單采濃縮血小板、冷沉淀、新鮮血漿應與 ABO 血型同型輸注。3.4 按全國臨床檢驗操作規(guī)程要求完成凝聚胺交叉試驗和檢測不完全抗體的交叉試驗（聚凝胺法、抗人球蛋白法） 。除緊急輸血和自身輸血外，所有輸入紅細胞的其他制品均要求做血交叉試驗。 3.5 另外必須開展的試驗有抗人球蛋白試驗，抗體篩選實驗。 改良低離子聚凝胺法實驗操作規(guī)程1、目的：減少交叉配血試驗的假陽性。 2、適用范圍：交叉配血、血型鑒定、抗體篩檢血型血清學試驗。 3、試劑來源：(臺資)珠海貝索生物技術有限公司 4、采集與處理： 4.1 靜脈采血 3-4ml，并觀察是否溶血、乳糜血，如有此現(xiàn)象應再留標本并做記錄。 4.2 檢查留樣試管、標簽、標號、姓名、血型是否齊全，如有遺漏應拒收。 4.3 將血標本試管放 37水浴中 10 分鐘，離心。 5、標準操作： 5.1 主（次）管加入受（供）血者血清 2 滴，加供（受）血者 4%紅細胞鹽水懸液 1 滴。 5.2 各管加 LIM0.8ml，混勻，靜置 1 分鐘，各管加 Polybrene Reagent 1 滴，混勻，3000轉/分離心 15 秒，倒出上清液（殘留約 0.1ml），輕搖，肉眼可見明顯的凝集狀（如無凝集須重做），加假凝集清除液 1 滴于管底，輕搖，凝集 1 分鐘內消失呈均勻混懸液，為陰性，凝集 1 分鐘內不能被消除，即為陽性。 5、 結論： 陽性表示受（供）血者血清中含供（受）者紅細胞血型 Ag 相應的 Ab（IgG、IgM），供受血者不相容，陰性表示供受血者相容。 6、 注意事項： 6.1 操作者須嚴格按照操作說明進行試驗，紅細胞濃度、血清滴量、反應時間、離心速度等均可影響試驗結果。 6.2 若為弱凝集結果，本試劑盒按下述試驗操作方法，還可進一步提高試驗靈敏度。試驗操作方法如下： 6.2.1 檢測管中加試驗血清 2 滴，4%紅細胞鹽水懸液 1 滴。 6.2.2 加 LIM0.8ml，混勻，靜置 1 分鐘，各管加Polybrene 2 滴混勻，3000 轉/分離心 15 秒，倒出上清液（殘留約 01ml） ，輕搖，肉眼可見明顯的凝集狀（如無凝集須重做） ，加假凝集清除液 1 滴于管底，輕搖，凝集 1 分鐘內消失呈均勻混懸液，為陰性，凝集1分鐘內不能被消除，即為陽性。 6.3 檢測標本應為非抗凝血，如標本中含抗凝成分的含量過高明顯干擾凝集反應，可適當調加 Promoter 的滴量，以中和抗凝成分的干擾。 6.4 試驗溫度以 20-30為宜，若為寒冷凝集，37水浴5分鐘，在此溫下觀察，凝集消失，說明冷凝集素存在。 6.5 肉眼直觀判斷的結果應確保與顯微鏡下觀察結果一致，直觀不能明確判斷的可疑結果須鏡檢，鏡下：陰性結果應該是單個 RBC 均勻分布，有 RBC 凝集狀散在的即為弱陽性。 6.6 試驗質量檢驗：取自身血清與自身紅細胞用本試劑盒試驗方法作自身陰性對照試驗，取 IgG 抗 D 血清與 RhD（+）RBC 用本試劑盒試驗方法作陽性對照實驗，對照實驗符合，試劑有效。 6.7 疑難結果以抗人球蛋白實驗（AGT）作最終判斷試驗，試驗操作參照經典AGT（在AGT中，加入本試劑盒中的LIM0.8ml 37孵育時間可縮短至 10 分鐘）。 6.8 本試劑盒適宜大多數(shù)血型抗體的檢測，但對 kell 血型系統(tǒng)抗體（主要存在白種人群）檢測效果較差，由于我國黃種人群中 kell 血型系統(tǒng)抗體陽性者罕見，因此適合在國內推廣。可補充抗人球蛋白試驗，以提高對 kell 血型系統(tǒng)抗體的檢出率?？删庉嬓薷腁BO 血型鑒定1、測定原理 根據(jù)紅細胞上有或無 A 抗原或和 B 抗原，將血型分為 A 型、B 型、AB 型及O 型 4 種?？衫眉t細胞凝集試驗，通過正、反定型準確鑒定 ABO 血型。所謂正定型，是用已知抗A 和抗B 分型血清來測定紅細胞上有無相應的 A 抗原或和 B 抗原；所謂反定型，是用已知 A 細胞和 B 細胞來測定血清中有無相應的抗A或和抗B。 2、標本種類及收集要求 2.1 受檢者血清； 2.2 枸緣酸鈉抗凝血或未稍取血，受檢者血液制成 5 紅細胞鹽水懸液使用。 2.3 標本出現(xiàn)中度溶血者，為不合格標本，不能用于檢測。 3、操作步驟 3.1、試管法 3.1.1 取潔凈小試管(內徑 10mm60mm)3 支，分別標明抗A、抗B 和抗A十 B，用滴管分別加抗A、抗B 和抗A 十 B 分型血清各 l 滴（約 50 ul）于試管底部，再以滴管分別加入受檢者 5紅細胞鹽水懸液 1 滴，混和。 3.1.2 另取潔凈小試管(內徑 10mm60mm)3 支，分別標明 A、B 和 O 細胞。用滴管分別加入受檢者血清 l 滴于試管底部，再分別以滴管加入 A、B和O型5試劑紅細胞懸 液 l 滴，混和。 3.1.3 立即以 1000rmin 離心 3 min。 3.1.4 將試管輕輕搖動，使沉于管底的紅細胞浮起，先以內眼觀察有無凝集(或溶血)現(xiàn)象。如內眼不見凝集，應將反應物倒于玻片上，再以低倍鏡檢查。 3.1.5 觀察結果時既要看有無凝集，更要注意凝集強度，此有助于 A、B 亞型、類 B 或 cisAB 的發(fā)現(xiàn)。 3.1.6 凝集強度判斷標準 4+ 紅細胞凝集成一大塊，血清清晰透明。 3+ 紅細胞凝集成數(shù)小塊，血清尚清晰。 2+ 紅細胞凝塊分散成許多小塊，見到游離紅細胞。 1+ 肉眼可見大顆粒，周圍有較多游離紅細胞。 鏡下可見數(shù)個紅細胞凝集在一起，周圍有很多游離紅細胞。 MF 混合凝集外觀(mixed field)是指鏡下可見少數(shù)紅細胞凝集，而極大多數(shù)紅細胞仍呈分散分布。 - 表示陰性，鏡下未見凝集，紅細胞均勻分布。 3.2 玻片法 3.2.1 取清潔玻片 1 張(或白瓷板 1 塊)，用蠟筆劃成方格，標明抗-A、抗-B和抗-A 十 B，分別用滴管滴加抗-A、抗-B 和抗-A 十 B 分型血清 l 滴于標明的方格內，再各加受檢者 2紅細胞懸液 1 滴，混和。 3.2.2 另取潔凈玻片一張(或白瓷板 1 塊)，用蠟筆劃成方格，標明 A 細胞、B細胞和 O 細胞，用滴管各加受檢者血清 1 滴，再分別用滴管滴加 A、B和O型試劑紅細胞懸液 1 滴。 3.2.3 將玻片(或白瓷板)不斷輕輕轉動，使血清與細胞充分混勻，連續(xù)約 15 min，先以肉眼觀察有無凝集(或溶血)反應；再在低倍鏡下觀察結果。 4、結果判定 ABO 血型正反定型結果分型血清+受檢者紅細胞 受檢者血型 受檢者血清+試劑紅細胞抗-A 抗-B 抗-A 十 B A 細胞 B 細胞 O 細胞+ - + A - + - + + B + - - - - O + + -+ + + AB - - - 注：+為凝集；-為不凝集。 5、注意事項： 5.1 分型血清必須為批批檢試劑，且在有效期內使用；質量性能符合要求。試劑開封后必須貼上開封日期、開封人標簽，用畢后應放置冰箱保存，以免細菌污染。試劑開封后有效期為一周。 5.2 試劑紅細胞以 3 個健康者同型新鮮紅細胞混和，用生理鹽水洗滌 1 次，以除卻存在于血清中的抗體及可溶性抗原?；蚴褂煤细竦纳唐吩\斷紅細胞。試劑紅細胞有效期：自制的為 15 天，商品的為試劑有效期。試劑開封后必須貼上開封日期、開封人標簽，用畢后應放置冰箱保存，以免細菌污染。試劑開封后有效期為一周。 5.3 生理鹽水啟用后，有效期為二周。 5.4 所有試劑在開封或使用時，必須檢查是否有變質；凡可疑者，必須更換新的試劑進行檢測工作。 5.5 試管、滴管和玻片必須清潔干燥，防止溶血。 5.6 操作方法應按規(guī)定，一般應先加血清，然后再加紅細胞懸液，以便容易核實是否漏加血清。 5.7 按理 IgM 抗-A 和抗-B 與相應紅細胞的反應溫度以 4為最強，但為了防止冷凝集現(xiàn)象的干擾，一般仍在室溫(2024)內進行試驗，37可使反應減弱。 5.8 離心時間不宜過長或過短，速度不宜過快或過慢，以防假陽性或假陰性結果。 5.9 觀察時應注意紅細胞呈特異性凝集、繼發(fā)性凝固以及緡錢狀排列的區(qū)別。 5.10 判斷結果后應仔細核對、記錄，避免筆誤。 5.11 對于可能存在不完全抗原的時候，應在各反應方加入凝聚胺試劑，以檢驗不完全抗原的存在。 512 對于可疑結果，必須更換所用的試劑，重新檢測。 5.13 5%紅細胞懸液的配制：用生理鹽水洗滌紅細胞 3 次。根據(jù)下表進行紅細胞懸液的配制 懸液濃度（%） 壓積紅細胞（滴） 鹽水（滴）2 1 2ml(40)5 1 0.8ml(16)Rh（D）血型鑒定1、實驗原理 紅細胞與抗 D 抗體發(fā)生凝集反應表明該細胞有 D 抗原，反之，無凝集現(xiàn)象表明試驗的紅細胞缺少正常強度的 D 抗原。 2、標本收集和制備 無菌操作收集血液標本,收集后盡可能立即進行實驗。如果不能立即實驗,應將樣品貯存于 2-8。收集在 ACD、CPD、CPD2A 液中的血液標本,不超過 21天仍可進行實驗，但是加 EDTA、肝素和凝集的血液標本，實驗應在 2 天內進行。 3、儀器、試劑、校準品、質控品、培養(yǎng)基、以及其他所需物品： RhD(IgM)血型定型試劑（單克隆抗體）：上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，產品注冊號：國藥準字 S20060018,包裝、規(guī)格：每盒內裝有 1 支試劑，10ml/支，儲存要求：存放 28，有效期內使用。 4、操作步驟 4.1 玻片法：4.1.1 干凈玻片上加 1 滴抗 D。 4.1.2 再加入1滴4%-5%的被檢紅細胞懸液。該紅細胞懸液可以是鹽水懸液，也可以是懸浮于自身血漿或血清中的紅細胞。 4.1.3 在圓形的玻片區(qū)域中混勻，前后緩慢搖晃玻片。2 分鐘左右肉眼判讀結果。不要將試劑的干燥與凝集相混淆。 4.1.4 如果是陰性，需要試管法重做一遍實驗。 4.2 鹽水試管法 4.2.1 加一滴抗 D 試劑于預先標記好的試管中 4.2.2 再加 1 滴約 3%5%紅細胞生理鹽水懸液于試管中?；靹颉?4.2.3 離心，速度和時間可選擇以下二種之一： 轉速 1000rpm，時間1 分鐘或 3400rpm，時間 15 秒。 4.2.4 檢查是否溶血（溶血可能是陽性結果，或者是細菌污染） ，然后輕輕搖晃，使細胞再懸浮起來。 4.2.5 觀察凝集狀況，并立即記錄結果。必要時可借助顯微鏡。 4.2.6 若是陰性結果，需在 37孵育 15 分鐘-30 分鐘，然后再離心觀察結果。結果若呈陰性需進一步確認是否是弱 D。 5、參考值范圍 陽性反應：出現(xiàn)紅細胞凝集，為 RhD 陽性。 陰性反應：紅細胞不出現(xiàn)凝集，為 RhD 陰性。 6、 方法的局限性 本實驗不能凝集CategoryDVI細胞，對于陰性和弱陽性結果，按有關安全輸血規(guī)范進行確認實驗，必要時送血型參比實驗室進行確認。 7、注意事項7.1 試劑含有 0.1%W/V 疊氮鈉，如果攝入會中毒。 7.2 試劑如出現(xiàn)混濁則不能使用，若開瓶使用時間較長后，最好用已知 RhD 陰性、RhD 陽性紅細胞檢查結果是否符合，以防制品污染、變質失效，而造成錯誤。及時貼上開封時間標簽，在效期內使用。 7.3 由于人紅細胞的 D 抗原往往表現(xiàn)較弱，故必要時進行顯微鏡鏡檢，以免錯判結果，特別是陰性結果時。 7.4 Rh 血型鑒定應嚴格控制溫度與時間，因 Rh 抗原、抗體及反應凝塊比較脆弱，觀察反應結果時，應輕輕側動試管，不可用力振搖。 7.5 對于結果可疑的，必須洗滌紅細胞后重新檢驗。 抗體篩選和鑒定試驗1、 原理 紅細胞血型抗體分子的物理特性與血清學的反應性之間有著直接的關系?？煞譃?IgM和 IgG球蛋白抗體 IgM 為天然抗體，在鹽水介質中能直接凝集相應的紅細胞，使之發(fā)生肉眼可見的凝集反應。 IgG為免疫抗體，常經妊娠或輸血等免疫產生。在鹽水介質中不能凝集而只能致敏抗原的紅細胞，且必須通過特定的方法使致敏紅細胞發(fā)生凝集。如牛血清白蛋白、酶、抗球蛋白、凝聚胺、凝膠（或玻璃）等方法。 2、 方法 待檢血清需要使用多種方法進行鑒定。一般使用鹽水法、酶方法、抗球蛋白法、凝聚胺法或凝膠卡法檢測抗體。在檢測到弱抗體時，可以利用適當增加血清的細胞比例、適當增加孵育時間、加入低離子強度溶液增效劑或 PEG 聚氧乙烯乙二醇等方法增加反應的敏感性。不同的抗體在不同的方法和條件下可以有不同的表現(xiàn)。這些特性為判定抗體特異性提供了參考信息。 3、 試劑 3.1、 紅細胞：