基因工程的操作程序培訓(xùn)課件.ppt

復(fù)習(xí)回顧,1、基因工程又稱為？基因工程的原理是? 2、基因工程中用到的工具中，“分子手術(shù)刀”是？來(lái)源是？其作用是？體現(xiàn)了酶的什么特性？作用部位是什么鍵？ 3、限制酶切割之后的結(jié)果是產(chǎn)生？從中軸線兩側(cè)切割得到的是什么末端？從中軸線處切開呢？ 4、獲得目的基因需要切幾個(gè)切口？產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？切割質(zhì)粒呢？ 5、“分子縫合針”是？根據(jù)什么分為兩大類？哪兩大類？這兩類酶的區(qū)別是？ 6、DNA連接酶連接的是？DNA聚合酶連接的是？ 7、DNA連接酶作用于什么鍵？,8、載體主要有哪幾類？其中，最常用的是？它的本質(zhì)是？ 9、載體必須具備的四個(gè)條件是？ 10、寫出限制酶切割后的黏性末端。,基因工程的基本操作程序,原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子,終止子,不編碼蛋白質(zhì)。,：編碼蛋白質(zhì) ,連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),調(diào)控遺傳信息表達(dá),上 游有啟動(dòng)子，下游有終止子,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）,編碼區(qū),與RNA聚合酶 結(jié)合位點(diǎn),內(nèi)含子,外顯子,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測(cè)與鑒定,問(wèn)題1,一：目的基因的獲取,如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。,1.目的基因主要是指_,編碼蛋白質(zhì)的基因,目的基因指的是：,？,也可以是具有調(diào)控作用的因子,獲取目的基因的常用方法有哪些?,1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因 2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 3、人工合成目的基因,反轉(zhuǎn)錄法,化學(xué)合成法,(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù),1.基因文庫(kù)概念,2.基因文庫(kù)類型,（包含一種生物的所有基因）,（包含一種生物的一部分基因）,(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因,3.基因組文庫(kù)的構(gòu)建,提取某種生物的全部DNA,用適當(dāng)?shù)?限制酶,一定大小的DNA片段,將DNA片段 與載體連接,導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存,基因組文庫(kù),4.cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA,單鏈DNA,雙鏈cDNA片段,重組載體,與載體 連接,cDNA文庫(kù),反（逆）轉(zhuǎn)錄酶,DNA 聚合酶,導(dǎo)入受體菌 中儲(chǔ)存,兩種基因文庫(kù)的主要區(qū)別如下表（課本P10）,總結(jié),1、概念：PCR全稱為_，是一項(xiàng)在生 物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù),3、條件：,2、原理：_,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,DNA雙鏈復(fù)制,(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,模板,（目的基因）,原料(脫氧核苷酸),引物（一小段單鏈DNA）,耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）,溫度控制,4、操作前提：,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。,6、結(jié)果 ：,5、擴(kuò)增形式：,指數(shù)形式（2n）,在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因,7、過(guò)程：,a、變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作 用下，_斷裂，形成_,b、復(fù)性（55-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物與 DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從 引物開始進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，合成與 模板互補(bǔ)的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因動(dòng)畫演示,（三）人工合成目的基因,反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,化學(xué)合成法,DNA合成儀,推測(cè),推測(cè),合成,前提：基因比較小、核苷酸序列已知,蛋白質(zhì)的氨基酸順序,mRNA核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,問(wèn)題4,3、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_,獲取目的基因的三種方法應(yīng)用,1、如果有目的基因的核苷酸序列，而且基因比較大，可采用_,2、如果知道目的基因的序列，而且基因比較小，可采用_,PCR技術(shù)擴(kuò)增,化學(xué)合成法,從基因文庫(kù)獲取的方法,復(fù)習(xí)回顧,1、基因工程的基本操作程序的四個(gè)步驟是？核心是？ 2、目的基因指的是什么基因？ 3、獲取目的基因常用的三種方法是？其中人工合成法又包括哪兩種? 4、基因文庫(kù)包括哪兩類？ 5、PCR的原理是？PCR全稱是？PCR擴(kuò)增過(guò)程中的解旋方式是？PCR需要的條件有？ 6、基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的是？ 7、一個(gè)基因表達(dá)載體的組成包括哪幾部分？ 8、標(biāo)記基因的作用是？ 9、啟動(dòng)子，終止子的位置，作用？起始密碼子，終止密碼子呢？,二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心,1,目的： 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄（與終止密碼子區(qū)別） 標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái),3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程,質(zhì)粒,DNA分子,限制酶處理,兩個(gè)切口 四個(gè)黏性末端,DNA連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,同一種,一個(gè)切口 兩個(gè)黏性末端,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法,1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法： （1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力,原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。,三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,構(gòu)建基因表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入,農(nóng)桿菌,植物細(xì)胞,導(dǎo)入,穩(wěn)定維持和表達(dá),過(guò)程：,（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞,基因槍法,（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞, 特點(diǎn):十分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。,例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉（我國(guó)）,（4）、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,方法：顯微注射法,目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動(dòng)物,為什么動(dòng)物細(xì)胞要用受精卵做受體細(xì)胞？,全能性受限制,（5）、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,微生物作受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)： 繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少 常用菌：大腸桿菌 常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞 （改變細(xì)胞壁的通透性） 過(guò)程：,Ca2+處理 大腸桿菌,感受態(tài) 細(xì)胞,感受態(tài)細(xì)胞 吸收DNA,表達(dá)載體 與感受態(tài) 細(xì)胞混合,導(dǎo)入過(guò)程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝 入重組DNA分子嗎？,真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少，且有的會(huì)攝入載體-載體，目的基因-目的基因類型,目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？,不一定，需要檢測(cè),問(wèn)題4,問(wèn)題5,檢查是否成功,分子 水平,個(gè)體水平：,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法、工具：,方法、工具：,方法、工具：,DNA分子雜交、DNA探針,分子雜交、DNA探針,抗原-抗體雜交、抗體,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,方法：,接種實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)基因生 物的DNA,探針,15N,15N,14N,14N,（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了 目的基因,基因探針：,放射性同位素等標(biāo)記的含有目的基因DNA片段,方法,DNA分子雜交技術(shù),變性,變性,知識(shí)延伸DNA分子雜交技術(shù),該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。,變性,方法,分子雜交技術(shù),（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,探針,15N,15N,轉(zhuǎn)基因生物 的mRNA,14N,14N,提取,（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),方法抗原-抗體雜交,Bt毒素蛋白,將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi),從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體,抗體,蛋白質(zhì),出現(xiàn)雜交帶,脫分化,組織培養(yǎng),（4）除上述分子檢測(cè)外，有時(shí)還需進(jìn)行 個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定：如抗性特性,檢查是否成功,分子 水平,個(gè)體水平：,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法、工具：,方法、工具：,方法、工具：,DNA分子雜交、DNA探針,分子雜交、DNA探針,抗原-抗體雜交、抗體,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,方法：,接種實(shí)驗(yàn),歸納: 基因工程的基本操作程序,獲取目的基因 從基因文庫(kù) 利用PCR 化學(xué)方法人工合成 構(gòu)建基因表達(dá)載體 目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因 將目的基因?qū)胧荏w