基因工程載體培訓(xùn)課件.ppt

第三章 基因工程載體,生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,基因工程載體的概念,把一個有用的基因（目的基因研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫載體。作為基因工程載體，質(zhì)粒至少應(yīng)該具備復(fù)制的起始區(qū)、選擇標(biāo)記基因區(qū)、多克隆位點等部分。,復(fù)制的起始區(qū)：能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的自我復(fù)制。 選擇標(biāo)記基因區(qū)：可以篩選重組體。 多克隆位點：方便外源基因的插入。,第一節(jié) 質(zhì)粒載體,質(zhì)粒（plasmid）：是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。廣泛存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。,質(zhì)粒,染色體,質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性： 分子大小差異大：1200 kb 編碼基因少：23個中等大小的蛋白質(zhì)。如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外的特性（非必須）。 形狀：雙鏈環(huán)狀DNA；線性雙鏈DNA；超螺旋等。,質(zhì)粒的空間構(gòu)型： 質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率： 同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同，scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。,共價閉合環(huán)狀DNA（Covalent close circular DNA，cccDNA)，呈超螺旋（SC）（super coil） 開環(huán)DNA（open circular，ocDNA），一條鏈上有一至數(shù)個缺口 線形DNA（linear，lDNA）,質(zhì)粒的類型： 在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為： 1、接合型質(zhì)粒（能自我轉(zhuǎn)移）：除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。如：F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F因子）。甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。不符合基因工程的安全要求。 2、非接合型質(zhì)粒（不能自我轉(zhuǎn)移）：雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。如R質(zhì)粒（抗生素抗性質(zhì)粒）和Col質(zhì)粒（大腸桿菌素colicin ）。符合基因工程的安全要求。,大腸桿菌素是大腸桿菌分泌的一類細(xì)菌素（bacteriocin），對于其他不能分泌特異性大腸桿菌素免疫蛋白（Immunity protein）的細(xì)菌具有殺滅作用，現(xiàn)在一般認(rèn)為有調(diào)節(jié)菌群數(shù)量的作用。 大部分大腸桿菌素由質(zhì)粒編碼，其中最著名的沒過于pColE1 。,質(zhì)粒的復(fù)制類型 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent plasmid）：拷貝數(shù)少，只有13份拷貝。（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）。 松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmid）：拷貝數(shù)多，有1060份拷貝。（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。 質(zhì)粒的不相容性 又稱質(zhì)粒的不親和性，在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定共存，這一現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性,又稱質(zhì)粒的不親和性。,質(zhì)粒的復(fù)制過程 質(zhì)粒的復(fù)制主要是通過型復(fù)制和滾環(huán)復(fù)制兩種方式之一進(jìn)行的，其中以型復(fù)制為主。在型復(fù)制中，有單向半保留復(fù)制和雙向半保留復(fù)制。,Ori復(fù)制起點,型復(fù)制,滾環(huán)復(fù)制,在革蘭氏陽性細(xì)菌中大多數(shù)質(zhì)粒是以滾環(huán)方式復(fù)制。,復(fù)制起點(ori)區(qū)的功能 復(fù)制起點是一段特定的DNA序列，長約幾百堿基對，在其相關(guān)的調(diào)控元件中含有由質(zhì)?；蛩拗魅旧w編碼的、參與DNA合成起始調(diào)控因子的結(jié)合位點。 在大多數(shù)質(zhì)粒中，與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)基因位于ori序列附近，因此ori位點周圍的小范圍DNA是質(zhì)粒復(fù)制所必需的。 如果質(zhì)粒DNA的大部分區(qū)域被去掉，而只保留質(zhì)粒的ori序列，而且質(zhì)粒是環(huán)狀的，則質(zhì)粒仍然能進(jìn)行復(fù)制。 將ori區(qū)克隆到一個不能自主復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子上并引入到原核細(xì)胞后，該重組DNA具有自主復(fù)制能力。分子克隆中常用的質(zhì)粒載體就是以這種方法構(gòu)建的，同時用這種方法可以確定哪部分DNA是ori區(qū)并研究ori區(qū)的功能。 ori區(qū)域常決定了質(zhì)粒的許多特性，如質(zhì)粒的寄主范圍和質(zhì)粒的拷貝數(shù)。,質(zhì)粒的命名 用小寫字母p代表質(zhì)粒（plasmid），在p字母后用兩個大寫字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒炇颐Q，再加上質(zhì)粒編號。如：pBR322：p表示一種質(zhì)粒，而“BR”則是分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322為編號。,質(zhì)粒載體的構(gòu)建 天然質(zhì)粒的局限性 1、分子量大，拷貝數(shù)低，第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長 9.1 kb。但只有一個EcoR I切點充當(dāng)克隆位點，Tetr 作為篩選標(biāo)志。EColR I 酶切位點位于Tetr 基因外部，外源基因插入不會引起篩選基因失活，因此無法區(qū)別重組體和野生型質(zhì)粒。 2、天然質(zhì)粒ColE1質(zhì)粒，長度為6.3 kb，唯一的EcoRI酶切位點位于篩選標(biāo)志基因大腸桿菌素E1（colicin E1）內(nèi)部。colicin E1能殺死不含ColE1 質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”?？梢酝ㄟ^插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicin E1的細(xì)胞。 質(zhì)粒載體的發(fā)展概況 第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二階段：增大載體容量(降低載體長度)，建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因,如pUC系列載體。 第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。,理想質(zhì)粒載體必須具備的基本條件： 1、具有復(fù)制起點（ORI） 2、具有抗菌素抗性基因：是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。 3、若干限制性內(nèi)切酶的單一位點：用來插入外源DNA片斷。且插入后不影響復(fù)制功能。 4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。,質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理： 抗菌素抗性 絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記. 氨芐青霉素抗性（Ampr）:青霉素的衍生物。氨芐青霉素通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死生長的細(xì)菌。 Ampr基因編碼-內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán)。 卡那霉素抗性（Kanr） :卡那霉素通過與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯讀，從而殺死細(xì)菌。Kanr 編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。 四環(huán)素抗性（Tetr）:四環(huán)素通過于30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌。Tetr 編碼特異性蛋白質(zhì)，對細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，組止四環(huán)素通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。 鏈霉素抗性（Strr） :鏈霉素通過與30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致mRNA錯譯，從而殺死細(xì)菌。Strr 編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對鏈霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體30S亞基結(jié)合作用。 氯霉素抗性（Cmlr）:氯霉素通過與50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌。Cmlr 編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙?；Щ?。,人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型 高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 pColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點。在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個細(xì)胞的拷貝數(shù)10003000個。適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。 低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 由pSC101派生來的載體特點是分子量小，拷貝數(shù)低，不適合大量擴(kuò)增DNA用。但當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時會嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動，導(dǎo)致寄主菌死亡時，就需要低拷貝的載體。如pLG338、pLG339、pHSG415等。 失控的質(zhì)粒載體 溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒，溫度低于37度，拷貝數(shù)很少； 溫度增加，大于40度時，拷貝數(shù)會很快增加到1000個以上。B. E. Uhlin于1979年構(gòu)建的載體如pBEU1、pBEU2等。,插入失活型質(zhì)粒載體 載體的克隆位點位于其某一個選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。如pDF41、pDF42、pBR329。 正選擇的質(zhì)粒載體 直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。如pUR2、pTR262等。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。 表達(dá)型質(zhì)粒載體 主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。注意啟動子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄翻譯信號控制之下。 克隆質(zhì)粒載體 專用于基因和DNA片段無性繁殖的質(zhì)粒載體。純粹的獲取基因和DNA片段。,常用的質(zhì)粒載體,pBR322,1、元件來源 復(fù)制起點 ori pMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點 Ampr基因 pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因 Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。 2、長度 4363bp 3、選擇標(biāo)記 氨芐青霉素和四環(huán)素抗性 4、克隆位點 24個克隆位點，其中9個會導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）； 3個會導(dǎo)致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。,利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程,BamHI片段(Tcr),pBR322,PstI(Apr)片段,重組分子 (Aps Tcr),PstI片段,外源DNA,BamHI片段,重組分子I (Apr Tcs）,分別轉(zhuǎn)化E.coli (ApS TcS),重組分子 (Aps Tcr),影印到Tc平板上,Apr Tcr為原載體 即為非重組子,影印到Ap平板上,重組分子I (Apr Tcs）,涂布Ap平板,Apr轉(zhuǎn)化子,涂布Tc平板,Tcr轉(zhuǎn)化子,Apr TcS為重組子,ApS Tcr為重組子,影印,pBR322的優(yōu)點,雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記 沒有獲得載體的寄主細(xì)胞在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞在Amp或Tet其中之一中死亡。 分子小，克隆能力大 載體越小越好。 10kb的DNA在純化過程中容易斷裂。 高拷貝數(shù) 氯霉素擴(kuò)增之后，每個細(xì)胞可達(dá)10003000copy。 安全 失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。,pBR322的缺點,保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點。能夠被pColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識別，如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！,pBR322的改良,刪除mob識別位點 如pAT153，pBR322的改造衍生質(zhì)粒，除去了mob識別位點，同時增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。 改造EcoR I 位點 如pBR325，使EcoRI 也成為插入失活型位點。在pBR322位點上接入一段來自噬菌體PICm的HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因cmlr）。 cmlr上也帶一個EcoRI位點。,cmlr,常用的質(zhì)粒載體,pUC系列,University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。,1、元件來源 復(fù)制起點ori-pBR322的 ori Ampr 基因-pBR322的Ampr基因 大腸桿菌-半乳糖基因（lacZ基因） 多克隆位點（MCS）區(qū)段-位于lacZ基因中的靠近5-端。 2、長度 約2.7kb,3、克隆位點 10個連續(xù)的單一限制酶切位點，位于lacZ基因的5端。 4、選擇標(biāo)記 PUC系列質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記是Ampicillin 抗性和 lacZ的a肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。,乳糖操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制,乳糖操縱子(lac operon)的結(jié)構(gòu),-半乳糖苷酶,-半乳糖苷酶和Xgal的顯色反應(yīng),-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸），也叫-肽（ lacZ ） 。,Xgal是一種人工工合成的、無色的乳糖類似物； -半乳糖苷酶能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)。,lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能.,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,4聚體,大腸桿菌-半乳糖基因（lacZ基因）-藍(lán)白斑選擇原理,1、b-半乳糖苷酶能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)； 2、 a-肽，也叫l(wèi)acZ ，是b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷，lacZ只有在a-肽形成4聚體的狀態(tài)下才有功能。若受體菌lacZ突變，受體菌本身的b-半乳糖苷酶失效，不能分解Xgal 。 3、pUC載體上LacZ的5端有一段多克隆位點(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合成，但插入外源基因就會阻止LacZ的合成。 4、IPTG的誘導(dǎo)作用：IPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ的C端部分和載體的lacZ都表達(dá)。 5、IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：MCS無插入時，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑；MCS有插入時，不互補(bǔ)，白菌斑。,1、更小的分子量。如pUC18為2682bp，pUC8為2750bp。 2、選擇方便。Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。 3、克隆便利。具有多克隆位點 4、測序方便。 現(xiàn)在最常用的pUC載體是pUC18，它的分子量小，具有多克隆位點和易于選擇的分子標(biāo)記，并且是松弛型復(fù)制，在正常情況下，它的拷貝數(shù)可達(dá)上千個，所以不需要用氯霉素進(jìn)行擴(kuò)增。,pUC系列載體的優(yōu)點,PCR產(chǎn)物克隆載體-T載體,1pMD系列載體：Takara公司開發(fā)的一種高效克隆PCR產(chǎn)物 (TA Cloning)的專用載體。 它由pUC18載體改建而成。在pUC18載體的多克隆位點處的Xba I 和Sal I識別位點之間插入了EcoR V 識別位點，用 EcoR V進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3端添加“T”而成。,pUC18載體,EcoR V的酶切位點：,常用的質(zhì)粒載體,穿梭質(zhì)粒載體,人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。 常用的穿梭質(zhì)粒載體有： 大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體 大腸桿菌-釀酒酵母穿梭載體 大腸桿菌-動物細(xì)胞穿梭載體。,穿梭載體的優(yōu)點： 利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)； 也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)； 可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來回轉(zhuǎn)移基因。,f1 origin是f1噬菌體基因組DNA的復(fù)制區(qū)序列，可引導(dǎo)單鏈DNA復(fù)制過程。 pUC origin是大腸桿菌復(fù)制區(qū)序列，可引導(dǎo)雙鏈DNA復(fù)制過程。 2u origin是酵母菌的復(fù)制區(qū)序列，可引導(dǎo)雙鏈DNA復(fù)制過程。,大腸桿菌和釀酒酵母的穿梭表達(dá)載體,pcDNA3.1(+)質(zhì)粒譜圖及其用戶實驗手冊講解,Important Information,Methods Overview,Cloning into pcDNA3.1,Multiple Cloning Site of pcDNA3.1(+),多克隆位點,Multiple Cloning Site of pcDNA3.1(-),pcDNA3.1 Vectors Map,pcDNA3.1 Vectors MapFeatures,常用的質(zhì)粒載體,表達(dá)載體,原核表達(dá)載體：適用于在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。 1、普通載體元件 復(fù)制起始點ORI 選擇標(biāo)記 多克隆位點MCS 2、大腸桿菌操縱子元件 阻遏基因 I 操縱基因O 啟動基因P 核糖體結(jié)合位點序列（SD） 轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū),如果在大腸桿菌里表達(dá)蛋白，必須把所克隆的目的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄翻譯信號控制之下。,1) 特點: a. 基因的啟動子序列和終止子序列； b. 一般無檢測標(biāo)記基因； c. 克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）； d. 重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。 2) 結(jié)構(gòu): a. 轉(zhuǎn)化單元-宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化 b. 表達(dá)單元-外源基因表達(dá) 3) 類型: 型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列+啟動子）+ 終止子 型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+ 翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子）+ 終止子 型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū) + 翻譯起始區(qū) + 信號肽鏈編碼區(qū) + 終止子（常稱之為表達(dá)分泌型載體）,表達(dá)載體（expression vector）,顯然，不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。換言之，被表達(dá)的外源基因一旦確定，表達(dá)載體的類型也就確定了。 例子： pET-43和pPIC9K 4) 用途: a. 表達(dá)外源基因以產(chǎn)生大量外源基因產(chǎn)物 b. 用于構(gòu)建cDNA文庫 5) 注意事項: a. 啟動子來源 b. 終止子來源 c. 啟動子的啟動效率 d.信號肽來源與結(jié)構(gòu) e. 調(diào)控類型,1. 質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個條件： （1）每個世代、每個質(zhì)粒至少要復(fù)制一次； （2）在細(xì)胞分裂時，復(fù)制過的質(zhì)粒必須分配到兩個子細(xì)胞中。,六、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性,2. 質(zhì)粒分配方式： 有主動分配和隨機(jī)分配兩種假說。 （1）主動分配。天然質(zhì)粒具有一個控制質(zhì)?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)（Par），能以主動分配的方式確保質(zhì)粒能正確分配到兩個子細(xì)胞中。 （2）隨機(jī)分配。人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了par區(qū)，只能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳，但在一定條件下會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。,3. 質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性（segregation instability） 在寄主菌細(xì)胞分裂的過程中，有一個細(xì)胞沒有獲得質(zhì)?？截悾⒆罱K繁殖成無質(zhì)粒的優(yōu)勢群體。,4. 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性（structural instability） 寄主基因組的IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。,IS,dimer,重組,5. 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素,（1）新陳代謝負(fù)荷： a、復(fù)制負(fù)荷 b、轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷 使寄主細(xì)胞生長減緩：質(zhì)粒載體使寄主的世代時間延長約15%。減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會成為優(yōu)勢群體！ （2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù) 質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)是產(chǎn)生無質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。 差度（variance）：每個菌體中所擁有的質(zhì)?？截悢?shù)不完全相同，稱差度。 低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。 （3）寄主菌的重組體系 含有大分子量插入片斷的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒二聚體。 二聚體災(zāi)難（dimer catastrophe）：質(zhì)粒在寄主的重組酶作用下會發(fā)生重組形成二聚體質(zhì)粒。二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)致質(zhì)粒失控。,第二節(jié) 噬菌體載體,一、噬菌體的一般特性 噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌病毒（Bacteriophage）。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。 噬菌體的蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著的DNA，DNA有雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀等結(jié)構(gòu)。,二、噬菌體的生活周期 1. 溶菌周期 烈性噬菌體感染細(xì)菌后，立即在菌體內(nèi)復(fù)制DNA和合成外殼蛋白質(zhì)，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。 2. 溶原周期 溫和噬菌體感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中, 這一過程稱為溶源化。整合到細(xì)菌染色體上的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。,噬菌斑,三、噬菌體載體,噬菌體是線性雙鏈DNA病毒，具有末端互補(bǔ)的12nt的5-突起末端（5-GGGCGGCGACCT-3），該末端稱為cos位點，可被編碼的末端酶所識別感染細(xì)菌后粘端互補(bǔ)成雙鏈環(huán)狀。全長48531bp，含50多個基因。,噬菌體基因大致分為4個區(qū)： 編碼頭、 尾部蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)區(qū)，AJ共19個基因組成；重組區(qū)為 att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission）等組成；調(diào)控區(qū)由啟動子、終止子等基因組成；O-R 為裂解區(qū)。,結(jié)構(gòu)區(qū),重組區(qū),調(diào)控區(qū),裂解區(qū),噬菌體及其組件的應(yīng)用,噬菌體可以容納較大的目的基因。例如用置換法可去掉長達(dá)20kb的DNA，換入相應(yīng)長度的目的基因。,CIts857,噬菌體從溶原轉(zhuǎn)為裂解是一種可誘導(dǎo)過程。誘導(dǎo)的因素很多，實驗室常用的是熱誘導(dǎo)。 如分離得到某些噬菌體clts857 ，在低溫時（30）建立溶原，用高溫（420C）則出現(xiàn)裂解。這些噬菌體的cl基因是溫度敏感突變型的，稱為c1ts。 clts1857可作為組件插入質(zhì)粒DNA內(nèi)。目的基因插在clts857下游，重組體的目的基因在42表達(dá)，30不表達(dá)。這種方法稱為熱誘導(dǎo)表達(dá)，使用的是溫敏開關(guān)。,PL和 PR,PL和PR是噬菌體上2個主要的啟動子，都是啟動能力相當(dāng)強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄構(gòu)件。把啟動子連同其附屬成分，將pBR322的tetr基因進(jìn)行替換，成為以啟動子為組件的質(zhì)粒。, -DNA載體的構(gòu)建,噬菌體的缺陷： 1、基因組太大（49kb）； 2、酶切點太多，它有5個BamH1位點（GGATCC），6個Bg位點（AGATCT），5個EcoR位點（GAATTC）。 3、野生型只能接納一定長度的DNA。 噬菌體的改造： 1、切去非必須區(qū)段，在切去的同時，加載目的基因（2.5kb或更大）； 2、去掉太多的酶位點，每種酶只留1-2個切口； 3、增加標(biāo)記基因； 4、引入無義突變。 載體類型： 1、插入型載體：通過特定的酶切位點允許外源DNA片斷插入的載體（0-11kb) 。 2、置換型載體：允許外源DNA片斷替換非必需DNA片斷的載體(9-23kb)。,-DNA載體的選擇標(biāo)記,1、lacZ 基因 ：IPTG/X-gal 2、基因 c 失活 （熱敏感） 3、Spi 篩選 ：野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細(xì)菌中繁殖（Spi+），這種生長抑制表型受-DNA上的red和gam兩個基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑。,代表性噬菌體載體 1、插入型載體 -gt10 載體 2、置換型載體 -EMBL3,基因 c被一段來自 434 噬菌體的片段 imm434替換了，其中內(nèi)有一個 EcoR 位點。,在填充片段兩端帶有對稱的多克隆位點 。,四、單鏈?zhǔn)删w載體 1 M13 噬菌體的生物學(xué) M13 噬菌體顆粒是絲狀的，只感染革蘭氏陽性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長和分裂。 M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA （+DNA），由 6407 的堿基組成?；蚪M 90% 以上的序列可編碼蛋白質(zhì)，共有 11 個編碼基因，基因之間的間隔區(qū)多為幾個堿基。較大的間隔位于基因 和基因 以及基因 和基因 之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和 DNA 合成的元件。 M13 噬菌體基因組可編碼 3 類蛋白質(zhì)，包括復(fù)制蛋白，形態(tài)發(fā)生蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白。,M13沒有包裝限制：,2、單鏈?zhǔn)删w的特點： （1）存在兩種類型，ssDNA和RF dsDNA； （2）+DNA（ssDNA）； （3）復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA； （4）RF dsDNA和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌，并產(chǎn)生噬菌斑； （5）不存在包裝限制； （6）可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片斷的單鏈分子，便于作探針或測序。,J. Messing證明，IG區(qū)存在M13的復(fù)制起點，可以插入外源DNA而不影響M13噬菌體的活力。,M13的生活周期,雄性細(xì)菌的F性菌毛：僅見于少數(shù)革蘭陰性菌，比普通菌毛略微稍粗，一個菌體只有14根，通常由質(zhì)粒編碼。帶有性菌毛的細(xì)菌具有致育能力，稱為F+菌或者雄性菌。雄性菌的遺傳物質(zhì)能通過性菌毛傳遞給F-菌，這個過程稱為接合。細(xì)菌可以通過這個方式傳遞耐藥性以及毒力。此外，性菌毛還是某些噬菌體感染宿主菌的受體。,3. M13載體的構(gòu)建 單鏈 DNA 的酶切和連接是比較困難的，因此 M13 噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈 RF DNA。RF DNA 很容易從感染細(xì)胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。 1）載體的插入位點 在 M13 噬菌體基因組中絕大多數(shù)為必需基因，只有兩個間隔區(qū)可用來插入外源 DNA?；?和基因 之間的 508bp 間隔區(qū)是主要的外源片段插入位點。在基因 和基因 之間的小間隔區(qū)也可用來插入外源片段，但是在操作過程中，需要獲得感染細(xì)胞的菌落進(jìn)行影印篩選，比利用可見的噬菌斑方法更慢更麻煩。 2）M13 噬菌體載體組成 現(xiàn)在所使用的 M13 噬菌體載體是 Messing 及其同事建立的 mp 系列載體，以基因 和基因 之間的區(qū)域作為外源 DNA 插入?yún)^(qū)。 mp 載體系列都是從同一個重組 M13 噬菌體 （M13mpl） 改造而來的。在 M13mpl 載體中，間隔區(qū)內(nèi)的 Hae 位點插入了一小段大腸桿菌 DNA ，引入laz的 互補(bǔ)篩選。,3）M13載體系列 M13載體系列的命名：M13mpn，n代表系列數(shù)字。 對M13mp1的改進(jìn)：加上常用的酶切位點。如B. Gronenborn和J. Messing1978年把LacZ 5端的第13個核苷酸G突變成A，產(chǎn)生了一個EcoR I切點，構(gòu)建成M13mp2。 對M13mp2的進(jìn)一步改進(jìn)產(chǎn)生了M13mp系列載體。在M13mp2的LacZ的5端加上一段人工合成的多克隆位點（MCS）。如M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19。 4）M13mpl8 和 M13mpl9 M13mpl8 和 M13mpl9 這兩個載體含有 13 個不同的酶切位點，可供插入由多種各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段。 M13mpl8 和 M13mpl9 DNA 的全序列已經(jīng)測定完成，這兩種載體只是在 lacZ 區(qū)內(nèi)不對稱的多克隆區(qū)的方向上有所不同。 M13mpl8 和 M13mpl9 輕易不能重新環(huán)化。僅當(dāng)連接混合液中含有帶匹配末端的外源雙鏈 DNA片段時，方可閉合成環(huán)。這一片段在 M13mpl8 和 M13mpl9 中將以兩個互為相反的方向插入。這樣一來，在 M13mpl8 重組體的子代噬菌體內(nèi)含有外源 DNA 的一條鏈， M13mpl9 重組體的子代噬菌體內(nèi)則含有它的互補(bǔ)鏈。故用 M13mpl8 和 M13mpl9 作為一對載體，就可能用一個引物 ，從所插入 DNA 片段的任一端開始，測定互為相反的兩條鏈的 DNA 序列，并可制備只與外源 DNA 的任意一條鏈互補(bǔ)的 DNA 探針。,M13mp1,M13 RF,BsuI不完全消化,各種長度的線性片斷,（其中應(yīng)有只在IG上切開的線性全長M13）,E.coli lac基因的HindII片斷(lacI、lacP、lacO、lacZ）,JM101宿主,只有在IG區(qū)插入lacZ才能存活并在Xgal上出現(xiàn)互補(bǔ)的藍(lán)噬菌斑,4. M13系列載體的優(yōu)點： （1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段。 （2） Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇。 （3）無包裝限制，克隆能力大。 （4）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈（子代M13噬菌體中包含的是單連+DNA）。 5. M13載體的缺點： （1） 插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降。 （2）實際克隆能力小于1500bp（雖無包裝限制，并非無限包裝）。,五、 COS質(zhì)粒載體,cosmid 是英文 cos site-carrying plasmid 的縮寫, 也稱粘粒、柯斯載體。本意是帶有粘性末端位點的質(zhì)粒, 因此, 柯斯質(zhì)粒是人工建造的的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。 1. 結(jié)構(gòu)特點：在普通質(zhì)粒載體中插入一個或兩個來自的cos位點片段，雙cos載體比單cos載體易于重組，cos結(jié)構(gòu)長200 bp，由以下幾個亞單位組成： a. cosN末端酶的gpA亞基識別和切割，產(chǎn)生5-12 nt突起； b. cosB分別位于cosN的兩側(cè)，稱之為cosBL（左側(cè)）和cosBR（右側(cè)），為末端酶的結(jié)合位點。,優(yōu)點： 1、容量大（可達(dá)45 kb），用于基因簇的克??； 2、形成的重組DNA分子可進(jìn)行體外包裝，并能感染E.coli細(xì)胞（在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒，因而不能形成噬菌斑）； 3、操作簡便，可直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞； 4、對重組DNA分子長度具有選擇性包裝； 遺傳標(biāo)記：與質(zhì)粒載體相同，利用抗生素抗性選擇轉(zhuǎn)化子，例子: pJB8和C2XB,六、噬菌粒載體（phagemid vectors） 噬菌粒（phagemid）實際上是帶有絲狀噬菌體大間隔區(qū)的質(zhì)粒載體，是集質(zhì)粒和絲狀噬菌體的有利特征于一身的載體，具有 ColE1 復(fù)制起點及抗生素抗性選擇標(biāo)記的質(zhì)粒，以及絲狀體噬菌體的間隔區(qū)。此間隔區(qū)含噬菌體 DNA 合成的起始與終止及噬菌體顆粒形態(tài)發(fā)生所必需的全部順式作用序列。含噬菌粒的細(xì)菌被噬菌體感染后，基因 蛋白可作用于噬菌粒的間隔區(qū)，啟動滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生 ssDNA 并進(jìn)行包裝。 噬菌粒具有以下特征： 雙鏈 DNA 既穩(wěn)定，又高產(chǎn)，具有常規(guī)質(zhì)粒的特征； 免卻了將外源 DNA 片段從質(zhì)粒亞克隆于噬菌體載體這一既繁瑣又費(fèi)時的步驟； 由于載體足夠小，故可得到長達(dá) 10kb 的外源 DNA 區(qū)段的單鏈； 兩種復(fù)制形式：既具有質(zhì)粒的復(fù)制起點，又具有噬菌體的復(fù)制起點。因此，既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，又能在噬菌體內(nèi)進(jìn)行單鏈復(fù)制。 噬菌粒的主要優(yōu)點在于它可以產(chǎn)生大段外源 DNA 的適量單鏈拷貝，又不必?fù)?dān)心發(fā)生缺失突變，而這些外源 DNA 區(qū)段常常由于太大而不能克隆于常規(guī) M13 載體。但許多噬菌粒都有一個主要缺點，即輔助噬菌體感染后，有時候單鏈 DNA 的產(chǎn)量較低且重復(fù)性較差。,第三節(jié) 人工染色體載體,酵母人工染色體（yeast artificial chromosome, YAC)：YAC人工染色體載體是利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，其工作環(huán)境也是在釀酒酵母中。A.W.Murray 1983年形成YAC構(gòu)建理論, D.T.Burke等1987年變?yōu)楝F(xiàn)實。釀酒酵母的形態(tài)為扁圓形和卵形，生長的代時為 90 分鐘；含 16 條染色體，每條的大小為 225-1900kb；具真核mRNA 的加工活性。,（1）DNA復(fù)制起始點（ori） （2）著絲粒（centromere，cen） （3）兩個端粒（telomeres，tel）,染色體復(fù)制和遺傳的三個基本組件：,TEL,TEL,CEN,ORI,（1）著絲粒區(qū)（CEN）,A A GTCACGTG,T TGTTTCTGNTTTCCGAAA,酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列:,I,II,III,78-86bp,酵母第3、4、6、11號染色體的著絲粒區(qū)序列,YAC的組成結(jié)構(gòu),（2）端粒（TEL）,兩個端粒保守序列是(G4T2)n 重復(fù)序列。如人是TTAGGG重復(fù)序列; 四膜蟲是 GGGTTG重復(fù)序列。,（3）復(fù)制起點（ORI）,約100bp的自主復(fù)制序列（ARS）。,（4）克隆位點,克隆位點位于 SUP4 基因內(nèi)部。插入外源基因?qū)е耂UP4酶失活，酵母菌落呈紅色；不失活的菌落是白色。,（5）在酵母中的標(biāo)記基因,TRP1（色氨酸缺陷）、URA3（尿嘧啶缺陷），分別位于兩臂。,（6）在細(xì)菌中操作,細(xì)菌的復(fù)制起點 ori和抗生素標(biāo)記Ampr,（一）YAC人工染色體載體的復(fù)制元件 （ 1）兩個端粒重復(fù)序列（telomeric repeat，TEL）：定位于染色體末端一段序列，用于保護(hù)線狀的 DNA 不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。 （2）著絲粒（centromere，CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。在 YAC 中起到保證一個細(xì)胞內(nèi)只有一個人工染色體的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。 （3）自主復(fù)制序列（autonomously replication sequences，ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的信號。 （二）YAC的特點 （1）只能在酵母細(xì)胞中擴(kuò)增。 （2）克隆容量大，為230kb-1700kb。 （3）構(gòu)建原理是按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建。,（三）YAC的組成結(jié)構(gòu) （1）著絲粒區(qū)（CEN）：酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列由三個區(qū)組成。 （2）端粒（TEL）：兩個端粒序列Tel。酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重復(fù)序列。（人是TTAGGG重復(fù)序列; 四膜蟲是 GGGTTG重復(fù)序列） （3）自主復(fù)制序列（ARS）： 約100bp的自主復(fù)制序列（ARS）。（真核生物中只有酵母菌有ARS） （4）克隆位點：位于 SUP4 基因內(nèi)部。 （5）選擇標(biāo)記：YAC 載體的選擇標(biāo)記主要采用營養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突變抑制基因 sup4 。與 YAC 載體配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變 ade 2-1。帶有這個突變的酵母菌在基本培養(yǎng)基上形成紅色菌落，當(dāng)帶有赭石突變抑制基因 sup4 的載體存在于細(xì)胞中時，可抑制 ade 2-1基因的突變效應(yīng)，形成正常的白色菌落。利用這一菌落顏色轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，可用于篩選載體中含有外源 DNA 片段插入的重組子。 （6）在細(xì)菌中操作：細(xì)菌的復(fù)制起點 ori和抗生素標(biāo)記Amp r 。,（三）YAC的組成結(jié)構(gòu) （1）著絲粒區(qū)（CEN）：酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列由三個區(qū)組成。 （2）端粒（TEL）：兩個端粒序列Tel。酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重復(fù)序列。（人是TTAGGG重復(fù)序列; 四膜蟲是 GGGTTG重復(fù)序列） （3）自主復(fù)制序列（ARS）： 約100bp的自主復(fù)制序列（ARS）。（真核生物中只有酵母菌有ARS） （4）克隆位點：位于 SUP4 基因內(nèi)部。 （5）選擇標(biāo)記：YAC 載體的選擇標(biāo)記主要采用營養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突變抑制基因 sup4 。與 YAC 載體配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變 ade 2-1。帶有這個突變的酵母菌在基本培養(yǎng)基上形成紅色菌落，當(dāng)帶有赭石突變抑制基因 sup4 的載體存在于細(xì)胞中時，可抑制 ade 2-1基因的突變效應(yīng)，形成正常的白色菌落。利用這一菌落顏色轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，可用于篩選載體中含有外源 DNA 片段插入的重組子。 （6）在細(xì)菌中操作：細(xì)菌的復(fù)制起點 ori和抗生素標(biāo)記Amp r 。,（四）YAC克隆外源DNA 主要是用來構(gòu)建大片段 DNA 文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。 當(dāng)用內(nèi)切酶切割YAC 載體成線狀后，就形成了一個微型酵母染色體，包含染色體復(fù)制的必要順式元件，如自主復(fù)制序列、著絲粒和位于兩端的端粒。這些元件在酵母菌中可以驅(qū)動染色體的復(fù)制和分配，決定這個微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的 DNA 片段。 對于線形化的微型酵母染色體，當(dāng)切割抑制基因 sup4 內(nèi)部的位點后形成染色體的兩條臂，與外源大片段 DNA 在該切點相連就形成一個大型人工酵母染色體，通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入到酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂分配到子細(xì)胞中，達(dá)到克隆大片段DNA 的目的。 裝載了外源 DNA 片段的重組子導(dǎo)致抑制基因 sup4 插入失活，從而形成紅色菌落； 而載體自身連接后轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)胞后形成白色菌落。 這些紅色的裝載了不同外源 DNA 片段的重組酵母菌菌落的群體就構(gòu)成了 YAC 文庫。 YAC 文庫裝載的 DNA 片段的大小一般可達(dá) 200-500kb，有的可達(dá) 1Mb 以上，甚至達(dá)到 2Mb 。,（五）YAC轉(zhuǎn)化過程,（1）宿主酵母菌： trp- 和 ura-。如AB1380。 （2）選擇方式：只有同時得到Y(jié)AC的兩個臂（色氨酸，尿嘧啶），才能在基本培養(yǎng)基（不加TRP和URA）上生長。,釀酒酵母各種人工染色體載體的特征,a. 每次細(xì)胞分裂仍有約1%的載體DNA從染色體上脫落下來 b. 在選擇培養(yǎng)基中15-20代后，10-30%的轉(zhuǎn)化子丟失載體DNA c. 非孟德爾式分離，主要是4+：0- d. 無絲分裂時有3-14%轉(zhuǎn)化體丟失質(zhì)粒，有絲分裂時有3%轉(zhuǎn)化體質(zhì)粒不發(fā)生分離 在選擇培養(yǎng)基上丟失質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體低于1%,第四節(jié) 動物病毒載體,質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細(xì)胞的載體。由于動物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)也較多，因而病毒載體構(gòu)建時一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。目前病毒載體常用者有改造來自猴腎病毒SV40（Simian Virus 40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動物細(xì)胞中表達(dá)或作基因治療等。,一、反轉(zhuǎn)錄病毒載體,屬于正鏈RNA病毒，顯著的特點是具有2倍體基因組。兩個相同的RNA分子在5端附近經(jīng)氫鍵連接形成70S RNA，這種結(jié)構(gòu)可能在逆轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)節(jié)作用。,反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu),類似于真核細(xì)胞mRNA。 LTR是長末端重復(fù)序列。在病毒基因組整合中至關(guān)重要。整合時，整合酶在U5-U3連接處切開雙鏈DNA，隨機(jī)插入到宿主基因組里。LTR本身還具有啟動子和polyA加尾信號的功能。 U5、U3：5段或3端獨(dú)特序列。 y+：組裝時必需的非編碼序列。 env：外殼蛋白。 pol：反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。 gag：核心蛋白。,（三）反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建 （1）刪除pol、env和gag基因。 （2）插入標(biāo)記基因（如neor） （3）外源基因和啟動子插入到y(tǒng)+下游。 （四）反轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝 （1）包裝細(xì)胞系的構(gòu)建 反轉(zhuǎn)錄病毒DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞的效率很低，必須包裝成病毒顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用兩個缺失了y+的反轉(zhuǎn)錄病毒染色體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以制造病毒外殼蛋白。 （2）載體RNA的包裝 用載體DNA轉(zhuǎn)化包裝細(xì)胞系。轉(zhuǎn)入的載體DNA上帶有y+，轉(zhuǎn)錄成的載體RNA就會被包裝細(xì)胞中原有的病毒外殼蛋白識別包裝成重組病毒顆粒。 （五）反轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)點 （1）將DNA插入宿主基因組的隨機(jī)位點上。 （2）侵染范圍廣、感染率高。 （3）整合的原病毒在宿主基因中比較穩(wěn)定， 拷貝數(shù)目較低。 （4）包裝的外源DNA可達(dá)10kb。 （5）反轉(zhuǎn)錄病毒感染哺乳動物細(xì)胞，對宿主細(xì)胞沒有毒性。（反轉(zhuǎn)錄病毒一般只感染處在分裂狀態(tài)的細(xì)胞）,DNA病毒載體腺病毒載體,（一）腺病毒的基因組：是線狀雙鏈DNA病毒，基因組中有14個基因。共同特點是都帶有倒置的末端重復(fù)（ITR），在病毒的復(fù)制過程中起非常重要的作用。 （二）腺病毒的優(yōu)點： （1）比較安全，無致病、致癌、致畸作用。 （2）宿主范圍廣：不僅能感染有分裂能力的細(xì)胞，也能感染不能分裂的細(xì)胞。 （3）可以在呼吸道和腸道中繁殖，可以通過口服或噴霧的方式感染。 （4）載體中的插入片斷可達(dá)7.5kb （有包裝容量限制）。 （5）腺病毒容易制備、純化。 （6）基因組結(jié)構(gòu)和功能了解得清楚。,（三）腺病毒載體 目前最常用的基因治療載體之一。 腺病毒載體的構(gòu)建:用同源重組的方法插入外源基因。 （1）刪除腺病毒DNA一些非必需區(qū)。如E1或E3區(qū)，增加插入能力。 （2）構(gòu)建質(zhì)粒載體。含有E1或E3區(qū)兩側(cè)的同源序列，并在同源序列之間插入外源基因和選擇標(biāo)記基因。 （3）把質(zhì)粒切成線性 （4）共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 在細(xì)胞中發(fā)生同源重組，把外源DNA加到病毒基因組中，并包裝成重組病毒顆粒。 （四）重組腺病毒DNA在細(xì)胞中的生存 （1）以游離的附加體形式存在于細(xì)胞中。不能整合到細(xì)胞基因組中?；虮磉_(dá)時間短。 （2）E1是腺病毒繁殖的必需區(qū)。缺失E1的重組腺病毒必須在已經(jīng)被腺病毒（輔助病毒）感染的細(xì)胞中繁殖。 （3）E3區(qū)對腺病毒的繁殖不是必需的。缺失E3的重組腺病毒不需要輔助病毒。,宿主系統(tǒng),E.coli DH5a菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時，可與載體編碼的-半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)-互補(bǔ)?？捎糜谒{(lán)白斑篩選鑒別重組菌株?；蛐停篎-，80dlacZM15，(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，-，thi-1，gyrA96，relA1 E.coli BL21(DE3)菌株用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達(dá)載體（如pET系列）的基因。該菌適合表達(dá)非毒性蛋白?；蛐停篎-，ompT， hsdS（rBB-mB），gal， dcm（DE3） E.coli JM109菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化或用M13 phage載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多肽和JM09編碼的LacZM15進(jìn)行-互補(bǔ)，從而顯示-半乳糖苷酶活性，由此很容易鑒別重組體菌株。基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi1，hsdR17，supE44，relA1，（lacproAB）/FtraD36，proAB+，lacIq，lacZM15 E.coli TOP10菌株適用于高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增，能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳?；蛐停篎- ，mcrA(mrr-hsd RMS-mcrBC)， 80 ，lacZM15，lac74， recA1 ，ara139(ara-leu)7697， galU ，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG,基因工程中常用的工程菌,1、基因重組相關(guān)的基因型 recA(Recombination)表達(dá)ATP依賴型DNA重組酶，具有對DNA放射性損傷的修復(fù)功能。Del-recA說明此菌株的表現(xiàn)型是重組缺陷的。 recB(Recombination)表達(dá)ATP依賴型DNase和核酸外切酶V的一個亞基，對recA的DNA重組酶起輔助和促進(jìn)作用。DNase催化雙鏈DNA的解旋和解鏈，核酸外切酶V催化單鏈DNA的 裂解，在DNA的重組和損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。 recC(Recombination)表達(dá)核酸外切酶V、ATP依賴型的核酸內(nèi)切酶、解旋酶和ATP酶，它們和recA, recB所表達(dá)的酶相互協(xié)調(diào)作用，在DNA的重組及放射性損傷的修復(fù)中發(fā)揮作用。,大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（1）,2、甲基化相關(guān)的基因型 dam(DNA adenine methylase)表達(dá)DNA腺嘌呤甲基化酶，它能催化特異序列GATC中A的甲基化，保證DNA免受限制性核酸內(nèi)切酶MboI的切斷，同時在 DNA復(fù)制時也起一定的輔助作用。 dcm(DNA cytosine methylase)表達(dá)DNA胞嘧啶甲基化酶，它能特異性識別DNA雙鏈上的CCWGG序列，并使第二個C甲基化，即CmCWGG,