引物設(shè)計(jì)的一般原則.ppt

引物設(shè)計(jì)的一般原則 郭大偉,引物設(shè)計(jì)的一般原則,1.引物長(zhǎng)度 7.發(fā)卡結(jié)構(gòu) 2.GC% 8.二聚體 3.Tm值 9.錯(cuò)配 4.3端堿基要求 10.交叉二聚體 5.5端堿基要求 11.產(chǎn)物長(zhǎng)度 6.G 值 12.評(píng)分,引物長(zhǎng)度,引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不應(yīng)大于38。 引物過(guò)短又同時(shí)會(huì)引起錯(cuò)配現(xiàn)象，一般來(lái)說(shuō)引物長(zhǎng)度大于16bp是必要的（不容易引起錯(cuò)配）。 例如：一個(gè)長(zhǎng)度為12bp的引物在人類基因組上存在200個(gè)潛在的退火位點(diǎn)(3 x 109/412=200 ).而一個(gè)長(zhǎng)度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點(diǎn)只有1/400個(gè). 較長(zhǎng)的引物（28-35bp) 一般是用來(lái)區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點(diǎn),GC%,引物序列的GC 含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。,Tm值,Tm DNA溶解溫度，即DNA的雙鏈?zhǔn)ヒ话霑r(shí)的溫度。 Tm 值計(jì)算的經(jīng)驗(yàn)公式 Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 退火溫度一般低于Tm，退火溫度越高，特異性越高，但雜交率越低。PCR退火溫度一般是55，變性溫度94， Tm一般在58-70 之間比較合適。 兩個(gè)引物之間的Tm值應(yīng)盡可能接近，不應(yīng)超過(guò)4,3端堿基要求,引物3端的末位堿基對(duì)Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A 的錯(cuò)配效率明顯高于其他3 個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基A。 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3端出現(xiàn)3 個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加,3端堿基要求,5端堿基要求,5端序列對(duì)PCR 影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。,G 值,G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3端G 值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），而5端和中間G 值相對(duì)較高的引物。引物的3端的G 值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合） G高于4.5時(shí)易引發(fā)產(chǎn)生引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu),發(fā)卡結(jié)構(gòu),Hairpin 一條引物自身堿基之間發(fā)生配對(duì),二聚體,Dimer 同一條引物的兩條連之間發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì),錯(cuò)配,Fals priming 引物與模板的發(fā)生配對(duì)的位置不止一個(gè)。盡管只有某一處可以與引物完全配對(duì)吻合，但是其它位置也可與引物之間發(fā)生不完全配對(duì)，影響延伸。,交叉二聚體,Cross dimer 兩條引物之間發(fā)生堿基配對(duì),產(chǎn)物長(zhǎng)度,Product