真核基因表達(dá)調(diào)控.ppt

第12章 真核生物基因表達(dá)調(diào)控,一. 真核生物基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn),1.真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn),（1）結(jié)構(gòu)龐大,（2）單順反子,單順反子(monocistron) 即一個(gè)編碼基因轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA分子，經(jīng)翻譯生成一條多肽鏈。,（3）重復(fù)序列,（4）基因不連續(xù)性,1）與DNA、染色體水平的變化有關(guān),2 .真核基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn),(1)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對基因表達(dá)的調(diào)控作用,(2) DNA拓樸結(jié)構(gòu)變化 天然雙鏈DNA幾乎均以負(fù)性超螺旋構(gòu)象存在。 當(dāng)基因激活后，則轉(zhuǎn)錄區(qū)前方的DNA拓樸結(jié)構(gòu)變?yōu)檎猿菪?，有利于RNA聚合酶向前移動(dòng)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。,(3) DNA甲基化 甲基化影響DNA與蛋白質(zhì)的相互作用。 (4)染色體結(jié)構(gòu)的變化 組蛋白發(fā)生修飾，堿基暴露等原因而引起核小體結(jié)構(gòu)改變，使核小體不穩(wěn)定性增加。,2）有RNA聚合酶對mRNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié) 真核生物有3種RNA聚合酶：RNA pol、。 每種RNA聚合酶有約10個(gè)亞基組成，其中TATA盒結(jié)合蛋白（TBP）為3種酶共有。 RNA pol對催化mRNA的生成起主要作用。轉(zhuǎn)錄前RNA pol必須與TBP、TFD等各種通用轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄前復(fù)合體（PIC），從而激活或抑制RNA的轉(zhuǎn)錄。,3）正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo) 真核基因一般都處于阻遏狀態(tài)，RNA聚合酶對啟動(dòng)子的親和力很低。 通過利用各種轉(zhuǎn)錄因子正性激活RNA聚合酶是真核基因調(diào)控的主要機(jī)制。 采用正性調(diào)節(jié)機(jī)制更有效、經(jīng)濟(jì)、特異； 采用負(fù)性調(diào)節(jié)不經(jīng)濟(jì) 4）轉(zhuǎn)錄和翻譯過程分開進(jìn)行 轉(zhuǎn)錄與翻譯過程分別存在于不同的亞細(xì)胞部位（胞核與胞漿），可分別進(jìn)行調(diào)控。,5) 真核基因表達(dá)調(diào)控能在特定時(shí)間和特定的細(xì)胞中激活特定的基因，從而實(shí)現(xiàn)“預(yù)定“的、有序的、不可逆轉(zhuǎn)的分化、發(fā)育過程，并使生物的組織和器官在一定的環(huán)境條件范圍內(nèi)保持正常功能。,二. 真核生物基因表達(dá)調(diào)控的不同層次,真核生物與原核生物的調(diào)控差異,在細(xì)胞分裂間期的細(xì)胞核中，染色質(zhì)的形態(tài)不均勻。根據(jù)其形態(tài)及染色特點(diǎn)可分為常染色質(zhì)和異染色質(zhì)兩種類型。 常染色質(zhì)：折疊疏松、凝縮程度低，處于伸展?fàn)顟B(tài)，堿性染料染色時(shí)著色淺。 異染色質(zhì)：折疊壓縮程度高，處于凝集狀態(tài)，經(jīng)堿性染料染色著色深。 1）結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)：各類細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)都處于凝集狀態(tài)，多位于著絲粒區(qū)、端粒區(qū)等含有大量高度重復(fù)序列的DNA處。 2）兼性異染色質(zhì)：只在一定的發(fā)育階段或生理?xiàng)l件下由常染色質(zhì)凝聚而成。 真核基因的活躍轉(zhuǎn)錄是在常染色質(zhì)上進(jìn)行,1.異染色質(zhì)化對基因活化的影響,三.染色體水平的調(diào)控,異染色質(zhì)（核內(nèi)深染部分）和常染色質(zhì)（核內(nèi)淺染部分）,電鏡觀察細(xì)胞分裂間期中染色質(zhì)情況,異染色質(zhì)的緊密壓縮堆積，可使調(diào)控蛋白和轉(zhuǎn)錄因子都不能靠近DNA，而使基因組中相當(dāng)大的一部分基因處于休眠狀態(tài)，其中有些基因可以從休眠變成激活，另一些則不能轉(zhuǎn)變。 如哺乳類雌體細(xì)胞2條X染色體，到間期一條變成異染色質(zhì)者，這條X染色體上的基因就全部失活。由此可見，緊密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)阻止基因表達(dá)。,1）染色體結(jié)構(gòu)復(fù)雜 由DNA、組蛋白、非組蛋白等大分子組成。 核小體是染色質(zhì)的基本單位。,2.組蛋白對基因活性的影響,染色質(zhì)結(jié)構(gòu),組蛋白是堿性蛋白質(zhì)，帶正電荷，可與DNA鏈上帶負(fù)電荷的磷酸基相結(jié)合，從而遮蔽了DNA分子，妨礙了轉(zhuǎn)錄，可能扮演了非特異性阻遏蛋白的作用； 進(jìn)行活躍基因轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)區(qū)段常有富含賴氨酸的組蛋白（H1組蛋白）水平降低、H2A、H2B組蛋白二聚體不穩(wěn)定性增加、組蛋白乙酰化（acetylation）和泛素化（obiquitination）、以及H3組蛋白巰基活化等現(xiàn)象，這些都是核小體不穩(wěn)定或解體的因素；,早期體外實(shí)驗(yàn)觀察到組蛋白與DNA結(jié)合阻止DNA上基因的轉(zhuǎn)錄，去除組蛋白基因又能夠轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)錄活躍的區(qū)域也常缺乏核小體的結(jié)構(gòu) 核小體的結(jié)構(gòu)消除或改變，會(huì)使DNA結(jié)構(gòu)由右旋變?yōu)樽笮?，?dǎo)致結(jié)構(gòu)基因暴露，促使轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，誘發(fā)轉(zhuǎn)錄。這些都表明核小體結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄。 染色體重塑實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，組蛋白H1比核心組蛋白（H2A H2B H3 H4）阻遏轉(zhuǎn)錄作用強(qiáng)。 染色質(zhì)中的非組蛋白成分具有組織細(xì)胞特異性，可能消除組蛋白的阻遏，起到特異性的去阻遏促轉(zhuǎn)錄作用。,1）組蛋白對基因活性的影響,（1）染色質(zhì)重塑(chromatin remodeling),在啟動(dòng)子區(qū)域，由于結(jié)合了組蛋白，染色質(zhì)處于非活性狀態(tài)，只有解除對轉(zhuǎn)錄模板的限制才能啟動(dòng)基因的表達(dá)，染色質(zhì)中與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的結(jié)構(gòu)變化稱為染色質(zhì)重塑; 染色質(zhì)重塑涉及許多蛋白復(fù)合物，可與核小體互作，影響核小體結(jié)構(gòu)或改變核小體與DNA結(jié)合位置； 染色質(zhì)重塑復(fù)合物中的許多蛋白質(zhì)對基因的轉(zhuǎn)錄起始非常重要，可與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子互作，或協(xié)助轉(zhuǎn)錄因子一起發(fā)揮作用。如：SWI/SNF復(fù)合物。,酵母交換型轉(zhuǎn)換/蔗糖不發(fā)酵復(fù)合物(Yeast mating-type switching/sucrose non-fermenting, SWI/SNF復(fù)合體)首次在酵母中鑒定，并在酵母、果蠅和哺乳動(dòng)物中具有保守性。SWI/SNF復(fù)合體是一個(gè)分子量為2103 kDa，含有多個(gè)亞單位的DNA依賴性ATP酶，它能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量動(dòng)員核小體,使染色質(zhì)重構(gòu),從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。 SWI/SNF復(fù)合體與基因活化和細(xì)胞增殖的多個(gè)調(diào)控因子密切相關(guān)，這些調(diào)控因子包括糖皮質(zhì)激素受體、雌激素受體和Rb、C-myc原癌基因和HpvE1蛋白能各自與SWI/SNF復(fù)合體相互作用并發(fā)揮功能，進(jìn)一步支持了該復(fù)合體參與細(xì)胞生長調(diào)控。,The SWI/SNF Complex in Saccharomyces cerevisiae,越來越多的研究證實(shí)了SWI/SNF復(fù)合體在腫瘤發(fā)生中的作用,它的幾個(gè)亞單位具有內(nèi)在的腫瘤抑制子活性。染色質(zhì)重塑復(fù)合物在腫瘤發(fā)生、發(fā)育, 核受體所介導(dǎo)的激素應(yīng)答, DNA復(fù)制、修復(fù)和重組等方面也扮演著重要的角色。,染色質(zhì)修飾復(fù)合物類型：,ATP依賴的染色質(zhì)改構(gòu)復(fù)合物 (ATP-dependent chromatin remodeling complex) 利用水解ATP獲得的能量, 改變組蛋白與DNA之間的相互作用 對組蛋白進(jìn)行共價(jià)修飾的組蛋白修飾酶復(fù)合物 (Histone-modifying complex) 對組蛋白的尾部進(jìn)行共價(jià)修飾, 包括賴氨酸的乙?；? 賴氨酸和精氨酸的甲基化, 絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化, 賴氨酸的泛素化等, 破壞核小體之間以及組蛋白尾部與基因組DNA之間的相互作用, 引起染色質(zhì)的重塑,重塑因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)機(jī)制的假設(shè): 1) 1 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子獨(dú)立地與核小體DNA 結(jié)合(DNA 可以是核小體或核小體之間的) , 然后, 這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子再結(jié)合1 個(gè)重塑因子, 導(dǎo)致附近核小體結(jié)構(gòu)發(fā)生穩(wěn)定性的變化, 又導(dǎo)致其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合, 這是一個(gè)串聯(lián)反應(yīng)的過程;,2）重塑因子首先獨(dú)立地與核小體結(jié)合,這些復(fù)合物都具有ATP酶活性，它們依靠水解ATP 所產(chǎn)生的能量來改變核小體的相對位置，但使其松動(dòng)并發(fā)生滑動(dòng), 將DNA 序列暴露出來，使轉(zhuǎn)錄因子能夠與之結(jié)合。這是一個(gè)物理過程，染色質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)并沒有變化，只改變核小體的相對位置。,染色質(zhì)重塑過程中, 核小體滑動(dòng)可能是一種重要機(jī)制, 它不改變核小體結(jié)構(gòu), 但改變核小體與DNA 的結(jié)合位置。,染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑存在于基因啟動(dòng)子中, 轉(zhuǎn)錄因子TF 以及染色質(zhì)重塑因子與啟動(dòng)子上特定位點(diǎn)結(jié)合, 引起特定核小體位置的改變(滑動(dòng)) , 或核小體三維結(jié)構(gòu)的改變, 或二者兼有, 它們都能改變?nèi)旧|(zhì)對核酶的敏感性，指染色質(zhì)特定區(qū)域?qū)嗣阜€(wěn)定性的變化。 基因組不同區(qū)域的染色質(zhì)被不同濃度的酶水解的特性定義為基因組DNA對酶的敏感性。,用DNA酶I處理各種組織的染色質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)處于活躍狀態(tài)的基因比非活躍狀態(tài)的DNA更容易被DNA酶I所降解。 原因： 活躍表達(dá)的基因所在染色質(zhì)上包含一個(gè)或數(shù)個(gè)DNase超敏感位點(diǎn) ，常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄基因的5端啟動(dòng)區(qū)，多在調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)的附近 ，該處DNA裸露，易被核酸酶降解,雞成熟紅細(xì)胞（erythroblast）染色質(zhì)中，-血紅蛋白基因比卵清蛋白基因更容易被DNA酶I切割降解。 雞輸卵管細(xì)胞的染色質(zhì)中被DNA酶I優(yōu)先降解的是卵清蛋白基因，而不是-血紅蛋白基因。,（2） 組蛋白的修飾,組蛋白是染色質(zhì)中核小體的主要結(jié)構(gòu)元件。組蛋白的修飾（乙?；⒘姿峄图谆┧鸬慕Y(jié)構(gòu)變化能影響基因的開關(guān)，并且這種變化同樣也調(diào)控著基因的轉(zhuǎn)錄，影響著基因的表達(dá)，是目前表觀遺傳學(xué)（Epigenetic)研究的重要部分。 組蛋白的乙?；^程由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase,HAT)催化，目前已發(fā)現(xiàn)了4種組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和5種去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC),組蛋白的乙?；?去乙酰化生物功能：,（1）乙?；艽龠M(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的活性 在組蛋白特殊氨基酸殘基上的乙酰化，可改變蛋白質(zhì)分子表面的電荷，影響核小體的結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)基因的活性；,乙酰化后組蛋白賴氨酸側(cè)鏈不再帶有正電荷，失去了與DNA的結(jié)合能力，也使相鄰核小體的結(jié)合受阻，同時(shí)也促進(jìn)泛素與組蛋白H2A的結(jié)合，導(dǎo)致組蛋白選擇性降解。組蛋白H3和H4的Arg、Lys的-NH2是修飾的主要位點(diǎn)。,如： 缺乏乙?；苁勾菩詡€(gè)體X染色體關(guān)閉轉(zhuǎn)錄，染色質(zhì)凝聚程度增高。,（2）組蛋白乙酰化與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物裝配 組蛋白的乙?；饔媚軐?dǎo)致組蛋白正電荷減少，削弱了它與DNA結(jié)合的能力，引起核小體解聚，從而使轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶順利結(jié)合到基因DNA上。 組蛋白乙酰化作用還能阻止核小體裝配，使染色質(zhì)處于比較松弛狀態(tài)； 組蛋白乙?；饔眠€參與細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂的調(diào)控。,（3）組蛋白的去乙?；c基因沉默 組蛋白低乙酰化或去乙酰化伴隨著轉(zhuǎn)錄沉默或轉(zhuǎn)錄抑制。,如：失活的X染色體中H4組白完全沒有乙酰化； H4的Lys16殘基的去乙酰化作用對于維持基因沉默十分重要。,組蛋白乙酰化在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用示意圖,3. 非組蛋白對基因活性影響,真核生物的細(xì)胞核除了有構(gòu)成染色質(zhì)的組蛋白組分外，還有大量與染色質(zhì)松散結(jié)合或在某些條件下才結(jié)合的非組蛋白（non-histone protein, NHP)組分。 大部分是酸性蛋白，起蛋白質(zhì)或酶的作用； 具有種屬和組織特異性； 大多數(shù)是磷蛋白，以磷酸化/去磷酸化方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、生長、增殖等。 許多蛋白對染色質(zhì)中基因的轉(zhuǎn)錄起始非常重要。,高遷移率蛋白（ high mobility group, HMG）：相對分子質(zhì)量較小，在聚丙烯酰胺凝膠電泳中有很高的遷移率而得名.幾乎所有的HMG都可以通過修飾、彎曲或改變?nèi)旧|(zhì)/DNA的結(jié)構(gòu),促進(jìn)各種蛋白質(zhì)因子形成大分子復(fù)合物來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄. 根據(jù)其結(jié)構(gòu), HMG超家族可分為HMGA、HMGB、 HMGN三類.,HMGA在早期的胚胎組織中含量很豐富，而在大部分的成體細(xì)胞中含量卻相對的少。 HMGA廣泛參與細(xì)胞的各種生理活動(dòng)，包括可誘導(dǎo)性基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、將反轉(zhuǎn)錄病毒整和到染色體上、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化及促進(jìn)癌細(xì)胞研究等。 HMGB發(fā)現(xiàn)最早，研究最多，在細(xì)胞中的含量也最豐富。不僅存在于細(xì)胞核內(nèi)，還存在于胞漿內(nèi)或分泌到胞外，近幾年還發(fā)現(xiàn)了膜相關(guān)的HMGB。最新一項(xiàng)研究表明（nature,2009)，染色體HMGB 蛋白HMGB1、 HMGB2 和HMGB3是所有由核酸受體調(diào)控的先天免疫反應(yīng)的激發(fā)所必不可少的，編碼免疫球蛋白可變區(qū)的V、D、J基因片段重組、分化和發(fā)展等。,HMGN是一組與核小體結(jié)合的核蛋白，它們能夠改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)染色質(zhì)模板的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，HMGN家族包括HMGN1和HMGN2 (原HMG-14和HMG-17)，它們在幾乎所有哺乳動(dòng)物和多數(shù)脊椎動(dòng)物的細(xì)胞核中廣泛存在。,4. 核基質(zhì)對基因活性的影響,在真核生物的細(xì)胞核內(nèi)，存在一種主要由非組蛋白的纖維蛋白和大分子RNA組成的三維網(wǎng)架體系，這就是核基質(zhì)。 真核基因組的DNA序列中，能特異性地與核基質(zhì)緊密結(jié)合的區(qū)域即為核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)。它廣泛存在于酵母到人類的所有真核生物基因組中。 MAR位于DNA上各轉(zhuǎn)錄單位的交界處，是DNA在核基質(zhì)或染色體支架上的附著點(diǎn)。這是通過一些特異的MAR結(jié)合蛋白與核基質(zhì)結(jié)合，從而將染色質(zhì)錨定在核基質(zhì)上，以防其自由轉(zhuǎn)動(dòng)，并使DNA發(fā)生解鏈。同時(shí)還將DNA隔離成許多拓?fù)鋵W(xué)限制性的功能區(qū)域，每個(gè)功能區(qū)域就形成一個(gè)拓?fù)鋵W(xué)解旋的環(huán)，每個(gè)環(huán)就是一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。,核基質(zhì)結(jié)合區(qū)約為200個(gè)富含AT的核苷酸區(qū)段，較為保守。通過氫鍵、疏水作用或共價(jià)鍵與核基質(zhì)結(jié)合。,核基質(zhì)蛋白包括： 不溶性的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 核纖層核孔復(fù)合物 核仁 非組蛋白,核基質(zhì)的特點(diǎn) 1限定DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)域的大小，使環(huán)狀結(jié)構(gòu)域成為相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域與功能域，該功能域中包括一系列的轉(zhuǎn)錄單位及各種特異的順式作用元件。如：限定子或絕緣子； 絕緣子是一類新近發(fā)現(xiàn)的邊界序列，它能阻止鄰近調(diào)控元件對其所界定的基因啟動(dòng)子起增強(qiáng)和抑制作用。 2.各種核基質(zhì)蛋白之間相互作用，控制染色質(zhì)組裝的疏密程度，從而調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄； 3.可能存在著基因的某種增強(qiáng)子元件； 4.可能有DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)識(shí)別元件,5. 基因丟失,在細(xì)胞分化過程中，通過丟掉某些基因而去除其活性。例如某些原生動(dòng)物，線蟲、昆蟲、甲殼類動(dòng)物，體細(xì)胞常丟掉部分或整條染色體，只保留將來分化產(chǎn)生生殖細(xì)胞的那套染色體。 例如在蛔蟲胚胎發(fā)育過程中，有27DNA丟失。在高等動(dòng)植物中，尚未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。 還有許多生物各類不同的細(xì)胞或細(xì)胞核都具有全能性。,6.基因擴(kuò)增,基因擴(kuò)增(gene amplification) : 在沒有發(fā)生細(xì)胞分裂，整條染色體幾乎沒有復(fù)制的情況下，細(xì)胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專一性增加的現(xiàn)象。 1) 為滿足正常的生長發(fā)育需要 如兩棲類和昆蟲卵母細(xì)胞rRNA基因的擴(kuò)增: 卵母細(xì)胞中的rDNA拷貝數(shù)比體細(xì)胞中增加了4000倍。 在果蠅濾泡細(xì)胞中，編碼卵殼蛋白的卵殼基因的擴(kuò)增。 2) 外界環(huán)境因素引起基因擴(kuò)增 基因擴(kuò)增與腫瘤形成及細(xì)胞衰老有關(guān)。在原發(fā)性的視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤中，含myc 原癌基因的DNA區(qū)段擴(kuò)增10-200倍。許多致癌劑可誘導(dǎo)DNA擴(kuò)增。,7. 基因重排,將一個(gè)基因從遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的地方移到距它很近的位點(diǎn)從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，這種方式被稱為基因重排。,通過基因重排調(diào)節(jié)基因活性的典型例子 免疫球蛋白結(jié)構(gòu)基因（由B淋巴細(xì)胞合成的） 酵母結(jié)合型轉(zhuǎn)換,抗體分子IgG由4條（兩對）多肽鏈組成，包括兩條相同的輕鏈（L-chain）和兩條相同的重鏈（H-chain）。輕鏈和重鏈在相對分子質(zhì)量上有較大差別，前者約2.3x104，后者則介于5.3x104-7.0x104之間。,免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白的肽鏈主要由可變區(qū)（V區(qū)）、恒定區(qū)（C區(qū)）以及兩者之間的連接區(qū)（J區(qū)）組成,免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼重鏈。,輕鏈的基因片段：,重鏈的基因片段：,所有Ig分子都含有兩類輕鏈中的一類，即型或型。 型和型輕鏈的恒定區(qū)和可變區(qū)的氨基酸序列是不同的。 在小鼠中，95%的抗體輕鏈?zhǔn)切?，而人類抗體輕鏈中，型和型各占50%左右。,H鏈和L鏈可能的組合數(shù)預(yù)計(jì)可達(dá)1011以上。小鼠每天生成的淋巴細(xì)胞為108個(gè)，可見動(dòng)物一生中還不可能使全部可能產(chǎn)生的基因組合得到表達(dá)。,四. DNA水平上的調(diào)控,DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，可能存在于所有高等生物中。 DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，而去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化與表達(dá)。 DNA甲基化會(huì)導(dǎo)致某些區(qū)域DNA構(gòu)象變化，影響DNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，進(jìn)而控制基因的表達(dá)。,1. DNA甲基化,如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常發(fā)育而死亡。 CpG二核苷酸中C的甲基化導(dǎo)致了1/3以上由于堿基轉(zhuǎn)換引起的遺傳病。,DNA甲基化的主要形式 主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)，少量N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)和7-甲基鳥嘌呤(7-mG)。在真核生物DNA中，胞嘧啶約有5%被甲基化，5-甲基胞嘧啶主要出現(xiàn)在CpG和CpXpG等序列中。,CpG二核苷酸序列通常成串出現(xiàn)并零散地分布于基因組中，此段序列被稱為CpG島。 大約50%的CpG島與看家基因有關(guān)，另一半CpG島存在于組織特異性調(diào)控基因的啟動(dòng)子中。,真核生物中的CpG島與甲基化,如：哺乳類基因組中約存在4萬個(gè)CpG 島，它們大多位于結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，其中有60% 90% 的CpG 被甲基化， CpG島在基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用。,不同結(jié)構(gòu)基因上的CG島,二氫葉酸還原酶,次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,核糖體蛋白,DNA甲基化會(huì)導(dǎo)致某些區(qū)域DNA構(gòu)象改變，包括甲基化后染色質(zhì)對于核酸酶或限制性內(nèi)切酶的敏感度下降，更容易與組蛋白H1相結(jié)合 ，DNase超敏感位點(diǎn)丟失，使染色質(zhì)高度螺旋化, 凝縮成團(tuán), 直接影響了轉(zhuǎn)錄因子于啟動(dòng)區(qū)DNA的結(jié)合效率的結(jié)合活性，不能啟始基因轉(zhuǎn)錄。 DNA的甲基化不利于模板與RNA聚合酶的結(jié)合，降低了轉(zhuǎn)錄活性。 甲基化的CpG 可以與甲基化CpG結(jié)合蛋白因子MeCP1（methylCpG-binding protein1）的結(jié)合，間接影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合。,2.DNA甲基化對轉(zhuǎn)錄活性的影響,1）DNA甲基化可引起基因失活,甲基化對基因轉(zhuǎn)錄的影響,2）基因印記（遺傳印記）,在生殖細(xì)胞形成早期，來自父方和母方的印記將全部被消除，父方等位基因在精母細(xì)胞形成精子時(shí)產(chǎn)生新的甲基化模式，但在受精時(shí)這種甲基化模式還將發(fā)生改變；因此在受精后來自父方和母方的等位基因具有不同的甲基化模式。,基因印記是指來自父方和母方的等位基因在通過精子和卵子傳遞給子代時(shí)發(fā)生了修飾，使帶有親代印記的等位基因表達(dá)不對稱的現(xiàn)象。,印記基因的存在反映了性別的競爭，親代通過印記基因來影響其下一代，使它們具有性別行為特異性以保證本方基因在遺傳中的優(yōu)勢。 印記基因的異常表達(dá)引發(fā)伴有復(fù)雜突變和表型缺陷的多種人類疾病。研究發(fā)現(xiàn)許多印記基因?qū)ε咛ズ吞撼錾蟮纳L發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用，對行為和大腦的功能也有很大的影響，印記基因的異常同樣可誘發(fā)癌癥。,基因印記常為DNA甲基化修飾，也包括組蛋白乙酰化、甲基化等修飾。通常在啟動(dòng)子區(qū)等位基因有差異的甲基化修飾造成該基因表達(dá)量降低。,五 真核基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)控制,真核基因調(diào)控主要也是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，受大量特定的順式作用元件（cis-acting element）和反式作用因子（transacting factor）的相互作用來實(shí)現(xiàn)的。 真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是整個(gè)基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)之一,1. 真核與原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的區(qū)別,與原核生物比較的相同點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控+轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，以轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控為重要 在真核生物結(jié)構(gòu)基因的上游和下游（甚至內(nèi)部）也存在著許多特異的調(diào)控成份。,與原核生物比較的不同點(diǎn) 1）原核生物的基因表達(dá)與調(diào)控是通過操縱子機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。 真核生物基因不組成操縱子，每個(gè)基因都有其自身的基本啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)元件，單獨(dú)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，但在相關(guān)基因之間也存在著協(xié)同調(diào)節(jié)。,2）原核生物的調(diào)節(jié)元件種類較少，主要包括上游的啟動(dòng)區(qū)域調(diào)控元件和激活蛋白、阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)； 真核生物的調(diào)節(jié)元件種類很多，如：組成性元件、可誘導(dǎo)元件、應(yīng)答元件、增強(qiáng)子和沉默子以及反式作用因子、阻遏因子等。,3）原核生物中有正調(diào)控（乳糖操縱子）和負(fù)調(diào)控。 真核生物迄今已知的主要是正調(diào)控，而且一個(gè)真核基因通常都有多個(gè)調(diào)控序列，必須有多個(gè)激活物同時(shí)特異地結(jié)合才能啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。 4）原核染色體是裸露的DNA，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對基因的表達(dá)沒有明顯的調(diào)控。 真核的染色質(zhì)DNA與組蛋白緊密結(jié)合形成的核小體，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對基因的調(diào)控是明顯的。,真核基因一般構(gòu)造示意圖,由若干可以區(qū)分的DNA序列組成，并與特定的功能基因相連，組成基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控區(qū)，通過與相應(yīng)的反式作用因子結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。,2 順式作用元件,一般情況下按功能分兩類： 核心啟動(dòng)子：保證轉(zhuǎn)錄起始所必需的、最少的DNA序列。核心元件包括上游2530bp處的TATA盒和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的啟始子（initiator，Inr），它能確定轉(zhuǎn)錄方向、起始位點(diǎn)并產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。,1）啟動(dòng)子 概念： 存在于結(jié)構(gòu)基因上游，與基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)有關(guān)的一段特殊的DNA序列。,TATA框又稱Hogness框，Goldberg-Hogness框，俚語稱為金磚（Goldbrick），其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50，常在起始位點(diǎn)的上游-25左右，相當(dāng)于原核的-10序列。（但原核生物-10序列不可缺少的，而真核啟動(dòng)中有的可缺乏TATA框。） TATA框作用： (1) 選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，保證精確起始，故也稱為選擇子（selector），當(dāng)有的基因缺少TATA框時(shí)，可能由Inr（initiator）來替代它的這一作用，如鼠的脫氨核苷轉(zhuǎn)移酶（Tdt）基因就沒有TATA框，但有17bp的Inr； (2) 影響轉(zhuǎn)錄的速率。TATA框的8bp的保守序列一般都是由A，T對組成，較容易打開。當(dāng)它的序列因發(fā)生突變和缺失而改變時(shí)就會(huì)影響它和酶的結(jié)合能力，從而影響轉(zhuǎn)錄的能力。,sextama box, 上游啟動(dòng)子元件： 在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游存在CAAT盒和GC盒，它們基本不參與起始位點(diǎn)的確定，起調(diào)節(jié)起始的頻率，提高轉(zhuǎn)錄效率的作用。 CAAT box的保守序列是GGCTCAATCT，一般位于上游-75bp左右緊靠-80，其功能是控制轉(zhuǎn)錄效率。能和CTF（識(shí)別CATT的轉(zhuǎn)錄因子）相結(jié)合。 GC box的保守序列是GTGGGCGGGGCAAT，常以多拷貝形式存在-90處。在真生物和病毒的一些啟動(dòng)子中常存在GC框，可被轉(zhuǎn)錄因子SP1所識(shí)別。它的作用也是控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。如鼠二氫酸葉酸還原酶啟動(dòng)子，猴基因組中的雙向啟動(dòng)子，SV40，皰疹病毒等基因的啟動(dòng)子中。 還有其它的一些UPE，如八聚體（Octamer），KB，ATF等。 有些缺失TATA的基因不含UPE，但常有下游啟動(dòng)子元件。,不同基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)圖,胸腺嘧啶激酶,-珠蛋白,SV40早期基因,組蛋白H2B,2）增強(qiáng)子,Enhancer,Gene,5,3,direction of transcription,Enhancer,Enhancer,增強(qiáng)子（Enhance)是指能使和它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA序列。作為基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)元件，增強(qiáng)子通常具有下列性質(zhì)： 1、具有遠(yuǎn)距離效應(yīng)。增強(qiáng)效應(yīng)十分明顯，一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10-200倍。 2、增強(qiáng)效應(yīng)與其位置和取向無關(guān)，不論增強(qiáng)子以什么方向排列（53或35），甚至和基因相距30kb，或在基因下游，均表現(xiàn)出增強(qiáng)效應(yīng)；,3、大多為重復(fù)序列，一般長約50bp，適合與某些蛋白因子結(jié)合。 4、其內(nèi)部常含有一個(gè)核心序列，是產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)時(shí)所必需的； 5、 增強(qiáng)效應(yīng)有嚴(yán)密的組織和細(xì)胞特異性，說明只有特定的蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子）參與才能發(fā)揮其功能； 6、 沒有基因?qū)Ｒ恍?，可以在不同的基因組合上表現(xiàn)增強(qiáng)效應(yīng)； 7、 許多增強(qiáng)子還受外部信號的調(diào)控，如金屬硫蛋白的基因啟動(dòng)區(qū)上游所帶的增強(qiáng)子，就可以對環(huán)境中的鋅、鎘濃度做出反應(yīng)。,增強(qiáng)子可能有如下3種作用機(jī)制 影響模板附近的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA雙螺旋彎折或在反式因子的參與下，以蛋白質(zhì)之間的相互作用為媒介形成增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間“成環(huán)”連接，活化基因轉(zhuǎn)錄； 將模板固定在細(xì)胞核內(nèi)特定位置，如連接在核基質(zhì)上，有利于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的張力，促進(jìn)RNA聚合酶II在DNA鏈上的結(jié)合和滑動(dòng)； 增強(qiáng)子區(qū)可以作為反式作用因子或RNA聚合酶II進(jìn)入染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的“入口”。,增強(qiáng)子的作用機(jī)制,為真核生物中負(fù)調(diào)控元件，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時(shí)，對基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。 最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，可不受序列方向的影響，也能遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用。,3）沉默子,沉默子的作用特點(diǎn)： 不受序列方向的影響， 能遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用， 并可對異源基因的表達(dá)起作用。,4）基因座控制區(qū),基因座控制區(qū)(locus control region, LCR)是染色體DNA上一種順式作用元件，結(jié)構(gòu)域中含有多種反式作用因子的結(jié)合序列，可能參與蛋白質(zhì)因子的協(xié)同作用，使啟動(dòng)子處于無組蛋白狀態(tài)。,絕緣子(insulator)長約幾百個(gè)核苷酸對，是通常位于啟動(dòng)子同正調(diào)控元件(增強(qiáng)子)或負(fù)調(diào)控因子之間的一種調(diào)控序列。 絕緣子本身對基因的表達(dá)既沒有正效應(yīng)，也沒有負(fù)效應(yīng)，其作用能阻止正調(diào)控或者負(fù)調(diào)控信號在染色體上的傳遞，阻斷包括增強(qiáng)子、沉默子和LCR的作用，使染色體活性限制在一定結(jié)構(gòu)域內(nèi)，即：不讓其他調(diào)控元件對基因的活化效應(yīng)或失活效應(yīng)發(fā)生作用。,5）絕緣子,3.反式作用因子,反式作用因子是參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白因子，能直接地或間接地識(shí)別或結(jié)合在各類順式作用元件上，與順式作用元件一起對轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。通過蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是其發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。 以反式作用影響轉(zhuǎn)錄的因子可統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TF）。,（1）反式作用因子的類型,a.通用反式作用因子 和RNA聚合酶一起結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和TATA盒； b.上游激活元件 特異性識(shí)別短共有序列元件的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)合于啟動(dòng)子或增強(qiáng)子位點(diǎn)上。通過增加基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(basal apparatus) 結(jié)合于啟動(dòng)子的效率而起作用； c.輔助激活因子 連接激活因子和基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合體； d.與應(yīng)答元件相結(jié)合的反式作用因子/一些調(diào)節(jié)因子(Some regulators) 可使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變。,1）反式作用因子概述,（2）反式作用因子中的結(jié)構(gòu)域 a.DNA識(shí)別結(jié)合域(DNA-binding domain) 反式作用因子結(jié)構(gòu)中用來同順式作用元件結(jié)合的結(jié)構(gòu)區(qū)域，主要起結(jié)合DNA作用。 b.轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(transcriptional activation domain） 反式作用因子結(jié)構(gòu)中用來同其他蛋白因子結(jié)合，參與募集啟動(dòng)子結(jié)合蛋白形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體，控制基因轉(zhuǎn)錄活化的結(jié)構(gòu)區(qū)域。 c.二聚化結(jié)構(gòu)域（dimerization domain) 反式作用因子含有介導(dǎo)蛋白質(zhì)二聚化的位點(diǎn)，二聚體的形成對它們行使功能具有重要作用。,轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和活化結(jié)構(gòu)域是獨(dú)立發(fā)揮作用的，DNA結(jié)合域的功能只是把活化結(jié)構(gòu)域“拴在”起始復(fù)合體附近，使之能夠發(fā)揮活化轉(zhuǎn)錄的作用。 DNA結(jié)合域把活化結(jié)構(gòu)域帶到轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的附近，而DNA結(jié)合域和活化結(jié)構(gòu)域之間的聯(lián)結(jié)區(qū)域(connector)是具有足夠柔性的，這樣，不論DNA結(jié)合域所結(jié)合的具體位點(diǎn)在哪里，都能使活化結(jié)構(gòu)域找到其靶蛋白 （轉(zhuǎn)錄因子）。,轉(zhuǎn)錄因子對特定DNA序列的識(shí)別和結(jié)合，很多情況下都是轉(zhuǎn)錄因子的某些氨基酸殘基形成的-螺旋結(jié)構(gòu)侵入到雙鏈DNA的大溝中，通過氫鍵、靜電荷作用等方式形成較穩(wěn)定的結(jié)合方式。,2）反式作用因子中的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, DB),每一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域有一個(gè)與DNA序列相互作用的基序（motif),多數(shù)基序含有一個(gè)插入DNA大溝的片段，能識(shí)別大溝的堿基序列。 常見有： 螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（ Helix-turn-helix ，H-T-H） 鋅指結(jié)構(gòu)（ Zinc finger ） 亮氨酸拉鏈（ Leucine zippers ） 螺旋-環(huán)-螺旋（ helix-loop-helix） 同源異形結(jié)構(gòu)域 （homeodomain, HD),（1）螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋 (H-T-H)結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)域長約20個(gè)氨基酸，包含兩個(gè)-螺旋區(qū)和螺旋區(qū)中間的轉(zhuǎn)折區(qū)，主要通過一個(gè)靠C端的-螺旋與DNA雙螺旋大溝結(jié)合。,（2）鋅指（ Zinc finger ）結(jié)構(gòu),A.鋅指蛋白（經(jīng)典的鋅指結(jié)構(gòu)）：包括二個(gè)半胱氨酸(Cys)及二個(gè)組氨酸(His)族，其保守重復(fù)序列為Cys- X2-4- Cys-X3-Phe- X5 -Leu- X2 -His- X3 -His。其中的Cys和His殘基與鋅離子(Zn+)形成的配位鍵，使氨基酸折疊成環(huán)，形成類似手指的構(gòu)型。此結(jié)構(gòu)被稱為Cys2/ His2鋅指。,該名稱來源于它的結(jié)構(gòu)，它由一小組保守的氨基酸和鋅離子結(jié)合，在蛋白質(zhì)中形成了相對獨(dú)立的功能域，像一根根手指伸向DNA的大溝。常見兩種類型，一類是鋅指蛋白，另一類是固醇類受體。,經(jīng)典鋅指結(jié)構(gòu)示意圖,經(jīng)典鋅指結(jié)構(gòu)示意圖,具有Cys2/ His2鋅指結(jié)構(gòu)域的一些轉(zhuǎn)錄因子,344aa，N端與DNA結(jié)合,有9個(gè)鋅指，共結(jié)合45個(gè)堿基,與5s rRNA基因啟動(dòng)子區(qū)C框結(jié)合。,TFA結(jié)構(gòu)域示意圖,B.固醇類受體: 具有Cys- X2- Cys-X13Cys- X2- Cys樣的保守序列，Zn+與4個(gè)Cys結(jié)合稱為Cys2/Cys2鋅指，這些蛋白一般無大量重復(fù)性鋅指，其DNA結(jié)合序列較短且對稱。這種結(jié)構(gòu)域常出現(xiàn)在類固醇激素受體蛋白，酵母的GAL4轉(zhuǎn)錄因子也具有一個(gè)這樣的鋅指結(jié)構(gòu)。Cys2/Cys2鋅指與Cys2/His2鋅指結(jié)構(gòu)不同，Cys與His是不能互換的。,類固醇激素受體是以二聚體形式發(fā)揮其促進(jìn)轉(zhuǎn)錄作用的。它們的兩個(gè)鋅指的功能不同。第1個(gè)鋅指的右側(cè)控制與DNA結(jié)合，第2個(gè)鋅指的左側(cè)則是控制形成二聚體的能力的。,糖皮質(zhì)激素特異性,雌激素特異性,（3）亮氨酸拉鏈（ Leucine zippers ）,結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為蛋白形成的-螺旋結(jié)構(gòu)上每隔7個(gè)氨基酸就有一個(gè)亮氨酸殘基，這些亮氨酸出現(xiàn)在-螺旋的一個(gè)方向，每兩個(gè)蛋白組成一個(gè)二聚體，使亮氨酸相對排列，形成拉鏈樣結(jié)構(gòu)，在拉鏈區(qū)的氨基端有個(gè)約30個(gè)殘基的堿性區(qū)(富含賴氨酸和精氨酸)。此區(qū)的作用是與DNA結(jié)合，它也形成-螺旋。,亮氨酸拉鏈?zhǔn)且环N富含亮氨酸的蛋白鏈形成的二聚體模體。它本身形成二聚體同時(shí)還可以識(shí)到特殊的DNA序列。,亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)示意圖,肝臟、小腸上皮、脂肪以及某些腦細(xì)胞中存在一類 C/EBP家族蛋白，GCN4酵母激活因子、CREB（cAMP應(yīng) 答元件結(jié)合蛋白）、熱休克蛋白原癌基因jun, fos編 碼產(chǎn)物，它們都具有典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。,（4）螺旋-環(huán)-螺旋（basic- helix-loop-helix）,蛋白質(zhì)的C端的氨基酸殘基形成兩個(gè)-螺旋，中間被非螺旋的環(huán)狀結(jié)構(gòu)隔開，蛋白質(zhì)的N端是堿性區(qū)，為DNA結(jié)合區(qū)。堿性-螺旋-環(huán)-螺旋類蛋白通常組成二聚體的形式，才具有結(jié)合DNA的能力。 肌細(xì)胞定向分化調(diào)控因子MyoD-1、原癌基因產(chǎn)物Myc及免疫球蛋白鏈基因增強(qiáng)子蛋白E12都具有這種bHLH結(jié)構(gòu)，而還有一些蛋白因子（如ID等）具有HLH樣結(jié)構(gòu)，無堿性區(qū)，就不能結(jié)合DNA。,二聚體bHLH蛋白與DNA結(jié)合模式圖,（5）同源異形結(jié)構(gòu)域（homeodomain, HD),許多反式作用因子結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域中具有一段相同的保守序列，是60個(gè)左右氨基酸組成的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域，稱為同源異形結(jié)構(gòu)域，簡稱同源域。含3個(gè)螺旋。,同源域蛋白結(jié)合DNA示意圖,靠C端的螺旋3結(jié)合在DNA的大溝中，它是蛋白質(zhì)和DNA的主要接觸部位。螺旋1和螺旋2為反平行樣式，它們與螺旋3近于垂直，在結(jié)構(gòu)域N端有個(gè)伸展的臂與DNA小溝結(jié)合，提高結(jié)合的穩(wěn)定性。,3）轉(zhuǎn)錄因子的激活結(jié)構(gòu)域（active domain,AD),一般是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以外的20-100氨基酸殘基組 成，它們與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在空間和功能上是分開的，主要包括以下幾種特征性結(jié)構(gòu) 酸性-螺旋結(jié)構(gòu)域(acidic helix domain) 富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域(glutamine-rich domain) 富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域(proline-rich domain),a. 酸性-螺旋(acidic -helix) 該結(jié)構(gòu)域含有由酸性氨基酸殘基一側(cè)組成的保守序列，多呈雙親性的-螺旋結(jié)構(gòu)，富含酸性氨基酸，為親水性，另一側(cè)含疏水性氨基酸。包含這種結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子有GAL4、GCN4、糖皮質(zhì)激素受體和AP-1/Jun等。,增加激活區(qū)的負(fù)電荷數(shù)能提高激活轉(zhuǎn)錄的水平?？赡苁峭ㄟ^非特異性的相互作用與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物上的TFIID等因子結(jié)合生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。,b. 谷氨酰胺豐富區(qū)(glutamine-rich domain) 氨基酸組成中有25%的谷氨酰胺，很少有帶電荷的氨基酸殘基。 如：SP1含有2個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，酵母的HAP1、HAP2和GAL2及哺乳動(dòng)物的OCT-1、OCT-2、Jun、AP2和SRF也含有這種結(jié)構(gòu)域。,c. 脯氨酸豐富區(qū)(proline-rich domain) CTF家族（包括CTF-1、CTF-2、CTF-3）的C末端與其轉(zhuǎn)錄激活功能有關(guān)，含有20%-30%的脯氨酸殘基，其它如Oct2、Jun哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子中也富含這種結(jié)構(gòu)。,4) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用機(jī)制,真核細(xì)胞細(xì)胞核中共有3類RNA聚合酶,RNA聚合酶的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且序列變化很大，與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)有關(guān)的位點(diǎn)包括4個(gè)部位： 帽子位點(diǎn)（轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)），其堿基大多為A； -25附近的TATA框； -75附近的CAAT框； -100以上的遠(yuǎn)上游序列，即增強(qiáng)子。 轉(zhuǎn)錄要起始，需很多的轉(zhuǎn)錄因子參與，如：通用轉(zhuǎn)錄因子、DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子和輔助轉(zhuǎn)錄因子。,（1）轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用,酵母菌半乳糖代謝的正調(diào)控系統(tǒng)早在1900年就被發(fā)現(xiàn),是真核生物中最早作為基因調(diào)控研究的系統(tǒng)之一。 半乳糖的存在與否決定半乳糖代謝基因是否表達(dá)：在沒有半乳糖時(shí)，基因不表達(dá)；加入半乳糖后，mRNA濃度可迅速增加1000倍。 半乳糖基因是受GAL4調(diào)控蛋白調(diào)控， GAL4和調(diào)節(jié)基因上游元件UAS結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。,UAS序列具有4個(gè)GAL4蛋白質(zhì)(Gal4p)結(jié)合位點(diǎn)，無論基因是否轉(zhuǎn)錄，這四個(gè)位點(diǎn)總是與Gal4p結(jié)合 GAL80P總是與GAL4P結(jié)合，覆蓋了GAL4P的活性中心，當(dāng)磷酸化的半乳糖與GAL80P/GAL4P復(fù)合體結(jié)合時(shí)，改變他們的構(gòu)型，使GAL4P的活性中心外露，集中其他轉(zhuǎn)錄因子，使GAL基因表達(dá)。,基因轉(zhuǎn)錄的起始除了需要通用轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子外，有的基因轉(zhuǎn)錄過程還依賴于增強(qiáng)子、介導(dǎo)因子或輔助激活因子的共同作用。,（2）介導(dǎo)因子,介導(dǎo)因子可與RNA聚合酶II互作來增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄； 介導(dǎo)因子不能直接結(jié)合DNA，但與RNA聚合酶II未磷酸化的CTD結(jié)合，形成完整RNA聚合酶II復(fù)合物，一旦轉(zhuǎn)錄開始，CTD磷酸化使得介導(dǎo)因子與RNA聚合酶II解離，RNA聚合酶II沿DNA延伸，而介導(dǎo)因子則參與新一輪的轉(zhuǎn)錄重復(fù)起始。,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的激活與抑制是相輔相成的兩個(gè)方面，某個(gè)特定基因的轉(zhuǎn)錄方式取決于正負(fù)調(diào)控因子之間的平衡。 真核細(xì)胞主要通過控制染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從整體上對轉(zhuǎn)錄因子加以控制，而較少采取類似于原核阻遏物那樣的機(jī)制； 在真核生物中，并非所有的調(diào)節(jié)蛋白都是激活蛋白，也有一些是阻遏蛋白，它們可以通過不同的方式發(fā)揮作用。,（3）真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的阻遏作用,5）固醇類激素對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控,固醇類激素是疏水性很強(qiáng)的化合物，可經(jīng)擴(kuò)散通過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞。在細(xì)胞中，固醇類激素與其受體結(jié)合形成二聚體。而固醇類受體本身是一組轉(zhuǎn)錄因子，具有與DNA結(jié)合的保守序列。這種二聚體一旦與目的基因啟動(dòng)子結(jié)合，即可直接啟動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄。而且，固醇類受體必須在固醇類存在時(shí)，才能與DNA結(jié)合，起始基因轉(zhuǎn)錄。 固醇類激素受體屬于核受體。,（1）受體的類型,根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)分布的不同,膜受體 胞內(nèi)受體,胞內(nèi)受體/核受體：主要于細(xì)胞核內(nèi)，或在胞漿中結(jié)合配體后也轉(zhuǎn)入核內(nèi)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。 作用：調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄 如：類固醇激素受體、甲狀腺素受體,(2) 4種途徑,1、通過cAMP途徑 2、鈣及肌醇三磷酸作用途徑 3、受體的酪氨酸激酶途徑 4、固醇類激素受體調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄速度,典型的核受體由A/B、C、D、E和F（從N末端到C末端）等5個(gè)區(qū)域組成： N末端結(jié)構(gòu)域（A/B結(jié)構(gòu)域）為轉(zhuǎn)錄激活域，是整個(gè)蛋白可變性最高的部分，其長度從50個(gè)到500個(gè)氨基酸不等； C結(jié)構(gòu)域?yàn)镈NA結(jié)合域，是最保守的區(qū)域；D結(jié)構(gòu)域是鉸鏈區(qū)，起連接DBD和LBD兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的作用；核定位信號NLS位于C和D之間； E結(jié)構(gòu)域，即配體結(jié)合域，是最大的結(jié)構(gòu)域，其保守性僅次于DBD。在A/B和E結(jié)構(gòu)域分別存在著不依賴于配體的轉(zhuǎn)錄激活域AF-1、配體依賴型的轉(zhuǎn)錄激活域AF-2。,（3）核受體（nuclear receptor)的結(jié)構(gòu),激素受體元件 HRE,（4）固醇類激素受體對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控,六. 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,1.可變剪接/選擇性剪接（alternative splicing),在高等真核生物個(gè)體發(fā)育或細(xì)胞分化過程中可以有選擇性地越過某些外顯子或某個(gè)剪接點(diǎn)進(jìn)行變位剪接，產(chǎn)生出組織或發(fā)育階段特異性mRNA，稱為內(nèi)含子的可變剪接。 脊椎動(dòng)物中許多基因能以這種方式進(jìn)行剪接，保證各同源蛋白質(zhì)之間既具有大致相同的結(jié)構(gòu)或功能域，又具有特定的性質(zhì)差異，進(jìn)而拓展了基因所攜帶的遺傳信息。,（）外顯子跨越或外顯子缺失； （）外顯子延長； （）內(nèi)含子保留； （）外顯子交替。 在人類基因中大約有的基因具有選擇性剪接的形式,2）可變剪接的方式主要有以下幾種：,果蠅sxl(sex lethal) mRNA前體含有雄性特異的外顯子，若sxl mRNA前代剪接后保留外顯子1,2,4,5,6,7,8，即不含外顯子，以后發(fā)育為雌蠅，若sxl mRNA前代剪接后保留外顯子1,2,3,4,5,6,7。因外顯子中有終止密碼子，翻譯會(huì)提前終止，引起以后一系列反應(yīng)，發(fā)育為有雄性特征的果蠅,1,2,3,4,5,6,7,8,stop codon,Female alternative splicing,Male normal splicing,AAAA,Active protein,Inactive protein,AAAA,選擇性剪接過程受到許多順式元件和反式因子的調(diào)控,并與基本剪接過程緊密聯(lián)系,剪接體中的一些剪接因子也參與了對選擇性剪接的調(diào)控.選擇性剪接也是1個(gè)伴隨轉(zhuǎn)錄發(fā)生的過程,不同的啟動(dòng)子可調(diào)控產(chǎn)生不同的剪接產(chǎn)物.mRNA的選擇性剪接機(jī)制多種多樣,已發(fā)現(xiàn)RNA編輯和反式剪接也可參與選擇性剪接過程.,選擇性剪接的機(jī)制,參與可變剪接的順式作用元件（RNA元件）： 外顯子剪接增強(qiáng)子； 內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子； 外顯子剪接沉默子； 內(nèi)含子剪接沉默子,一類富含嘌呤核苷酸的外顯子剪接增強(qiáng)子（exon splicing enhancer, ESE）是最常見的一種剪接增強(qiáng)子,剪接增強(qiáng)子多位于它們所調(diào)節(jié)的剪接位點(diǎn)附近，有助于吸引剪接因子到剪接位點(diǎn)上；,調(diào)控因子Tra,Tra2和兩個(gè)SR 蛋白結(jié)合到ESE上,促進(jìn)U2AF 結(jié)合至3剪接位點(diǎn)或U1snRNP發(fā)生剪接; SR蛋白：富含絲氨酸和精氨酸的一類蛋白因子，在ESE 的剪接調(diào)控功能中發(fā)揮重要作用。,參與可變剪接的反式作用因子,順式剪接：剪接發(fā)生在同一條RNA分子上； 反式剪接：剪接發(fā)生在不同的RNA分子上。,選擇性剪接的意義,1，選擇性剪接極大地增加了蛋白質(zhì)的多樣性和基因表達(dá)的復(fù)雜程度 2，性別決定與發(fā)育：選擇性剪接可以調(diào)節(jié)決定性別及發(fā)育相關(guān)蛋白的表達(dá) 3，許多疾病與mRNA前體選擇性剪接有關(guān),2.RNA編輯,RNA編輯（RNA editing）是指改變RNA分子序列的一種轉(zhuǎn)錄后修飾現(xiàn)象，包括堿基的插入，缺失或核苷酸的轉(zhuǎn)換等現(xiàn)象。它導(dǎo)致了DNA所編碼的遺傳信息的改變。,RNA編輯現(xiàn)象是1986年，R.Benne等在研究錐蟲線粒體DNA時(shí)發(fā)現(xiàn)的。,1）RNA編輯的形式,編輯類型 機(jī)制 存在,U的插入與刪除 gRNA的轉(zhuǎn)酯反應(yīng) 錐蟲線粒體mRNA C、A或U的插入 多頭絨孢菌線粒體的 mRNA和tRNA G的插入 RNA聚合酶重復(fù)轉(zhuǎn)錄 副粘病毒的P基因 C轉(zhuǎn)變?yōu)閁 酶促脫氨 哺乳類腸的apoB C轉(zhuǎn)變?yōu)閁或U轉(zhuǎn)變?yōu)镃 脫氨或氨基化 植物線粒體mRNA和tRNA 牛心線粒體tRNA A轉(zhuǎn)變?yōu)镮 脫氨 腦谷氨酸受體亞基mRNA,常見：1.單堿基突變(A-I,C-U)， ，尿苷酸的缺失和添加,尿苷酸的添加,RNA編輯的一種形式是尿苷酸的缺失和添加。研究發(fā)現(xiàn)，利什曼原蟲細(xì)胞色素b mRNA中含有許多獨(dú)立于核基因的尿嘧啶殘基，而特異性插入這些殘基的信息來自指導(dǎo)RNA（guide RNA,gRNA）。 指導(dǎo)RNA與被編輯區(qū)及其周圍部分核酸序列互補(bǔ)，但該RNA上存在一些未能配對的腺嘌呤，形成缺口，為插入尿嘧啶提供了模板。反應(yīng)完成后，指導(dǎo)RNA從mRNA上解離下來，而mRNA則被用做翻譯的模板。,2）指導(dǎo)RNA,3）RNA編輯的生物學(xué)意義,RNA編輯的生物學(xué)意義主要表現(xiàn)在: RNA編輯能夠改變和補(bǔ)充遺傳信息; RNA編輯能增加基因產(chǎn)物的多樣性； RNA編輯還和生物細(xì)胞發(fā)育與分化有關(guān); RNA編輯還可能使基因產(chǎn)物獲得新的結(jié)構(gòu)和功能，與生物進(jìn)化有關(guān); RNA編輯很可能與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān).,所有在細(xì)胞質(zhì)中起作用的真核生物細(xì)胞RNA都要從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)出來； mRNA能被特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)到翻譯的位置，在細(xì)胞之間能夠被長距離轉(zhuǎn)運(yùn)。 在完成合成和加工后，mRNA以轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體的形式從細(xì)胞核內(nèi)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。 內(nèi)含子可以阻止mRNA的出核，因?yàn)樗鼈兣c剪接裝置聯(lián)系在一起。,3. RNA的轉(zhuǎn)運(yùn),EJC ：exon junction complex，外顯子連接復(fù)合體,mRNA的穩(wěn)定性與基因表達(dá)調(diào)控 mRNA 5前導(dǎo)序列對翻譯水平的影響 翻譯起始因子的磷酸化可抑制或選擇性地加強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成 mRNA 3端的結(jié)構(gòu)對翻譯速率和mRNA壽命的影響 真核生物mRNA翻譯起始的控制 翻譯延伸過程對蛋白質(zhì)合成的影響 微小的干擾RNA對mRNA翻譯的負(fù)控制 蛋白質(zhì)的加工折疊轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控,七.翻譯水平的調(diào)控,真核生物mRNA分子的穩(wěn)定性 真核生物mRNA的穩(wěn)定性差異很大； 真核生物mRNA的3端polyA是增加mRNA穩(wěn)定性的重要用因素 細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成旺盛時(shí)，mRNA鏈上核糖體的數(shù)量就多， mRNA鏈上的poly(A)也較長；當(dāng)某些mRNA鏈不再被翻譯時(shí)，核糖體就被釋放出來，其poly(A)也相應(yīng)縮短。,（1）去除polyA引發(fā)mRNA降解 （2）mRNA 3端非翻譯區(qū)鏈內(nèi)剪切引起降解 3端非翻譯區(qū)富含AU的元件是mRNA不穩(wěn)定性的一個(gè)因素。數(shù)個(gè)UUAUUUAU八核苷酸核心序列稱為AUUUA序列。 一些壽命較短的mRNA，在3-UTR存在AUUUA序列，這些元件稱為不穩(wěn)定因子。 AUUUA序列也是一種順式作用元件，對翻譯效率有抑制作用，其抑制強(qiáng)弱取決于AUUUA序列拷貝數(shù)的多少，與距離終止密碼子的遠(yuǎn)近無關(guān)。,2. 5UTR結(jié)構(gòu)與翻譯起始的調(diào)節(jié),1）5端帽子結(jié)構(gòu) 帽子結(jié)構(gòu)是起始因子eIF-4F識(shí)別并結(jié)合于mRNA以及最終形成翻譯起始復(fù)合體所必需的。因此，大多數(shù)真核生物mRNA的翻譯起始活性依賴于5端帽子結(jié)構(gòu)的存在。,2）起始密碼子AUG和上游AUG 存在于真正開始翻譯起始的密碼子AUG的上游非翻譯區(qū)內(nèi)，稱為上游AUG； 絕大多數(shù)真核生物mRNA的翻譯從mRNA 5端的第一個(gè)AUG密碼子開始，符合AUG規(guī)律。 但也有些mRNA的翻譯不符合AUG規(guī)律，這些mRNA的5 UTR中有多個(gè)AU