凡納濱對(duì)蝦覆膜養(yǎng)殖池塘沉積物微生物群落的磷脂脂肪酸譜圖分析.pdf

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 第 ? 卷第 ? 期 ? 年 ? 月 ? 水?產(chǎn)?學(xué)?報(bào) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 收稿日期? ? ?修回日期? ? ? 資助項(xiàng)目?國(guó)家科技支撐計(jì)劃? ? ? ? ?寧波大學(xué)教研項(xiàng)目? ? ? ? ? 通訊作者?鄭忠明? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 凡納濱對(duì)蝦覆膜養(yǎng)殖池塘沉積物 微生物群落的磷脂脂肪酸譜圖分析 翟海佳?鄭忠明 ? ?金中文?陸開(kāi)宏?孫?芳?汪?洋?李越蜀? ? 寧波大學(xué)教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?浙江 寧波? ? 寧波市海洋與漁業(yè)研究院?浙江 寧波? 摘要? 于 ? 年 ? 月?選擇浙江省寧波市 ? 個(gè)凡納濱對(duì)蝦覆膜養(yǎng)殖池塘進(jìn)行水質(zhì)?沉積 物理化因子的研究?并采用磷脂脂肪酸譜圖? ? ? ? ?法研究了沉積微生物在不同養(yǎng)殖階段的 群落結(jié)構(gòu)變化及其與環(huán)境因子的相關(guān)性? 結(jié)果表明?在整個(gè)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖期間?沉積物 ? ? ? ? ? 組成以飽和脂肪酸?支鏈脂肪酸和單不飽和脂肪酸為主?多不飽和脂肪酸與環(huán)丙烷脂 肪酸含量較少? 微生物總生物量?細(xì)菌生物量和真菌生物量伴隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行都明顯增加? 雖然沉積物微生物是以細(xì)菌為主體?但真菌更適應(yīng)沉積物的環(huán)境?因此細(xì)菌與真菌的比值在不 斷降低? ?細(xì)菌與 ?細(xì)菌的比值表現(xiàn)在養(yǎng)殖后期比中期有所下降?但在末期變化不明顯? 冗余分析? ? ? ?表明?微生物總生物量?細(xì)菌生物量和真菌生物量與總氮? ? ?正相關(guān)性最為 顯著?細(xì)菌生物量和 ?細(xì)菌生物量與 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)?這些微生物群 落結(jié)構(gòu)因子全部和透明度? ? ?呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系? 關(guān)鍵詞? 凡納濱對(duì)蝦? 覆膜池塘? 沉積物? 微生物群落結(jié)構(gòu)? 磷脂脂肪酸譜圖 中圖分類號(hào)? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼? ?池塘沉積物是指池塘水體范圍內(nèi)發(fā)生的物 理?化學(xué)及生物學(xué)過(guò)程所產(chǎn)生的沉降物質(zhì)?是養(yǎng)殖 生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分? 沉積物中的有機(jī)質(zhì)一 部分可以被底棲生物同化?還有很大一部分需要 微生物的參與才能進(jìn)行分解? 因此?池塘中的 微生物生態(tài)系統(tǒng)狀況?微生物數(shù)量種群組成上的 變動(dòng)以及代謝分解有機(jī)物的能力對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境有很 大的影響? 由于養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的特殊性?池塘 內(nèi)微生物群落不僅受到環(huán)境中能源?營(yíng)養(yǎng)?捕食等 因素的影響還要受到各種有序的人類活動(dòng)的干 預(yù)?如人工投餌?增氧?調(diào)節(jié) ?等? 因此?養(yǎng)殖環(huán) 境中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化應(yīng)該呈現(xiàn)一定的規(guī)律 性?反應(yīng)當(dāng)時(shí)養(yǎng)殖系統(tǒng)的健康狀況? 有關(guān)養(yǎng)殖池塘沉積物中微生物的相關(guān)研究已 有較多報(bào)道?賈俊濤等?采用圍隔實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)方 法?對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘沉積物中的細(xì)菌總量?氨化細(xì) 菌?產(chǎn) ? ?細(xì)菌和硫酸鹽還原菌的數(shù)量變化進(jìn)行監(jiān) 測(cè)?申玉春等?用血球板計(jì)數(shù)法對(duì)凡納濱對(duì)蝦 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?高位池沉積中的細(xì)菌數(shù)量 的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究?錢麗君等?用傳統(tǒng)平板稀 釋法對(duì)三疣梭子蟹? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?養(yǎng)殖 池塘泥樣中的細(xì)菌進(jìn)行分離純化?并應(yīng)用 ? ? ? ? ? ? ? ?方法揭示各類群細(xì)菌的分類多樣性? ? ? ? 等?對(duì)養(yǎng)殖池塘表層沉淀物中微生物的活動(dòng)特點(diǎn) 進(jìn)行了研究? 但目前這些研究大都是建立在分離 培養(yǎng)計(jì)數(shù)的基礎(chǔ)之上?然而大部分環(huán)境微生物處于 存活不可培養(yǎng)狀態(tài)?使得通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法了解 環(huán)境微生物生物量與群落結(jié)構(gòu)變化比較困難?另外 由于不同地域氣候?氣象特點(diǎn)不同?養(yǎng)殖品種不同? 各地的養(yǎng)殖水域和池塘的生態(tài)系統(tǒng)有其顯著的特 點(diǎn)?因此不同養(yǎng)殖池塘沉積物微生物生物量與群落 結(jié)構(gòu)之間的變化趨勢(shì)往往不相同? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?水?產(chǎn)?學(xué)?報(bào)? 卷 近年來(lái)?磷脂脂肪酸? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?譜圖分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于堆肥樣品?湖 泊沉積物和土壤微生物群落研究? ? ?但應(yīng)用于 養(yǎng)殖池塘沉積物種微生物群落結(jié)構(gòu)分析還鮮有報(bào) 道? 本研究通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查?選擇了新型養(yǎng)殖模式 下的凡納濱對(duì)蝦覆膜養(yǎng)殖池塘?對(duì)其進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)和 實(shí)驗(yàn)室的水質(zhì)及沉積物理化因子檢測(cè)?并引入 ? ? ? ?法對(duì)沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)不同時(shí)期的 變化 進(jìn) 行 分 析? 通 過(guò) 主 成 分 分 析 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?和冗余分析? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?研究環(huán)境因子與沉積物微生物群 落結(jié)構(gòu)間的關(guān)系?旨在通過(guò)對(duì)新型養(yǎng)殖模式池塘 環(huán)境微生物生態(tài)的研究?比較準(zhǔn)確地了解其生態(tài) 狀況?監(jiān)測(cè)環(huán)境變化?并用來(lái)指導(dǎo)養(yǎng)殖生產(chǎn)? ?材料與方法 ? ?采樣池塘 選擇浙江省寧波市橫山碼頭的 ? 個(gè)理化條件 相同的高密度凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘?池底全部覆 蓋厚度為 ? ? ? ?的黑色聚乙烯塑料薄膜?每個(gè) 池塘面積約? ? ? ?養(yǎng)殖期間池塘水位為 ? ? ? ? ? ? ? 月 ? 日統(tǒng)一投放蝦苗? ? ? ? ? ? ? 放養(yǎng)密度 ? ? ? ? ? 在養(yǎng)殖期間?前期? 月 ? 日? 月 ? 日? 不換水?中期? 月 ? 日? 月 ? 日?每半個(gè)月少量換水?后期? 月 ? 日? 月 ? 日?累積換水三分之一?末期? 月 ? 日以后?因 已開(kāi)始捕撈?不再換水? 增氧方式為水表層鋪設(shè) 管道和水車增氧兩種方式結(jié)合? ? ?樣品的采集和處理 于 ? 年 ? 月?每 ? 天采集 ? 個(gè)覆膜 凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘的中間和四周底層的水樣? 水樣中氨氮?亞硝酸鹽?硝酸鹽?總氮?總磷等指標(biāo) 用 ? ? ? ? ? ? ?水質(zhì)檢測(cè)儀檢測(cè)?測(cè)定方法 按照?海洋調(diào)查規(guī)范?進(jìn)行? 現(xiàn)場(chǎng)利用美國(guó)產(chǎn) 的 ? ? ? ? ? ? ? ? 水質(zhì)檢測(cè)儀?檢測(cè)池塘底部 ?沉積物與水界面接觸處? 溶解氧?溫度?鹽度? ? ?并用透明度盤測(cè)定水體透明度? 同時(shí)分別在 養(yǎng)殖的中期?后期?末期 ? 個(gè)時(shí)期分別采集覆膜池 底稠狀沉積物于滅菌的樣品瓶中?然后放入 ? ? 泡沫塑料冷藏箱中保存?并在采樣后的 ? ? 內(nèi)進(jìn) 行冷凍干燥處理? ? ?微生物群落分析方法 用 ? ? ? ?法測(cè)定沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)? ? ? ? ?是活體微生物細(xì)胞膜恒定組分?其對(duì)環(huán)境 因素敏感且在生物體外迅速降解?因此特定菌群 ? ? ? ?變化可反映出原位土壤細(xì)菌?真菌活體生 物量 與 菌 群 結(jié) 構(gòu)? ? ? 具 體 操 作 在 ? ? ? ? 等?的方法上加以改進(jìn)? 提取?稱? ? 冷凍干 燥后的沉積物?加入? ? ?檸檬酸緩沖液? ? ?氯 仿? ? ?甲醇? ?檸檬酸緩沖液? ? ?氯仿? ? ?甲醇? ? ? ? ? ? ? ? ?避光震蕩? ? ? ? ? ? ? ? 離心? ? ? ? 后取上清液? 再加入? ? ?檸檬 酸緩沖液和? ? ?氯仿?檸檬酸緩沖液? 氯仿? 甲醇 ? ? ? ? ? ?震蕩 ? ? ? ?避光條件下保存 ? ? 經(jīng) ? ? 靜置分離后?吸走上層水相部分?保留 底層氯仿相?在氮?dú)庀麓蹈陕确? ? 分離?使用 固相 萃 取 裝 置 分 離 ? ? ? ? ? 固 相 萃 取 小 柱 為 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?先用? ? ?氯仿清 洗小柱? ? ?氯仿分批溶解樣品后注入硅膠柱 內(nèi)?然后依次分別加入 ? ? ?氯仿? ? ?丙酮? ? ? ?甲醇?收集甲醇相并在氮?dú)庀麓蹈? ? 甲脂化?向吹干樣品中加入 ? ? ? ?甲醇? ? ?甲 苯? ?和 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?甲醇溶液?手 動(dòng)搖晃 ? ? ? ?放入水溫? ? ? ?溫浴? ? ? ?后 冷卻到室溫?依次加入 ? ? ?去離子水? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?正己烷?漩渦混合 ? ? ?然后 ? ? ? ? ? ? ? 離心 ? ? ? ?重復(fù)提取一次?合并兩 次提取的正己烷相?氮?dú)庀麓蹈? ? ? ?冷凍保 存? 在進(jìn)行 ? ?測(cè)定前用加入 ? ? ? 做為內(nèi)標(biāo)的 正己烷?色譜純?定溶? ? ?條件? ?型號(hào)為 ? ? ? ? ? ?毛細(xì)管柱 采用 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?不分流進(jìn) 樣?進(jìn)樣口溫度 ? ? 檢測(cè)器溫度 ? ? ? ? ? ? ? 定量根據(jù)外標(biāo)標(biāo)樣?選用 ? ? ? ? ? 公司的 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 和 ? ?內(nèi) 含 ? 種脂肪酸甲酯 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?混合標(biāo)樣?可涵蓋沉積物 ? ? ? ? ? 范圍? 脂肪酸分子式以? ? ? ? ? ? ? ?表示?其中 ? ?代表脂肪酸分子的碳原子總數(shù)? ?代表不 飽和烯鍵的數(shù)目? ?代表烯鍵距離羧基的位置? ? ?為烯鍵或環(huán)丙烷鏈的位置? 前綴? ? ? ?代 表異構(gòu)甲基支鏈?距甲基端的第二個(gè)碳原子? ? ? ? ? ? ? ?代表前異構(gòu)甲基支鏈?距甲基端的 第三個(gè)碳原子? ?代表環(huán)丙基支鏈?后綴? ? 和? ?分別代表順式和反式同分異構(gòu)體? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 期翟海佳?等?凡納濱對(duì)蝦覆膜養(yǎng)殖池塘沉積物微生物群落的磷脂脂肪酸譜圖分析? 特征脂肪酸是不同微生物類群的生物標(biāo)志 物?根據(jù)現(xiàn)有的研究成果? ? ?本研究以 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 作為細(xì)菌源脂肪酸?真菌源脂肪酸以 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 表示?革蘭氏陽(yáng) 性菌?以 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 和 ? ? ? ? 表示?革 蘭氏陰性菌?以 ? ? ? 表示? ? ?數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用主成分分析及冗余分析等數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì) 方 法? 分 析 軟 件 為 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?結(jié)果 ? ?池塘水質(zhì)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)鹽變化 在整個(gè)調(diào)查期間? 個(gè)池塘的水質(zhì)變化保持 了良好的一致性? 其中水溫大致相近? ? ? ? ? ?沒(méi)有發(fā)生較大的起伏?鹽度在整個(gè)養(yǎng) 殖過(guò)程中有下降趨勢(shì)?尤其在后期更為明顯?整個(gè) 過(guò)程的平均鹽度為 ? ?隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行有 增高的趨勢(shì)?但大體波動(dòng)范圍為 ? ? ? ? ?平 均為 ? ?為堿性水體?溶解氧因使用了兩種不 同的增氧方式?且進(jìn)行了定時(shí)增氧?因此波動(dòng)不是 太大?基本維持在 ? ? ? ? ? ? ?池塘透明度變化在 ? ? ? ? ? ?平均為 ? ? ?水體透明度前期 較高?但隨養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)?中后期水中有機(jī)碎屑 和無(wú)機(jī)懸浮物的數(shù)量?以及水中浮游植物?浮游動(dòng) 物的種類和數(shù)量的大幅增加而顯著下降?表 ? 養(yǎng)殖試驗(yàn)期內(nèi) ? 個(gè)池塘的水體營(yíng)養(yǎng)鹽呈現(xiàn)了明顯 的變化?主要表現(xiàn)在總氮隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行一直呈 現(xiàn)上升的趨勢(shì)?亞硝酸鹽和硝酸鹽在養(yǎng)殖前期和 中期保持了一個(gè)很低的水平?但到了后期都發(fā)生 了急速的提升? 氨氮在整個(gè)養(yǎng)殖期間則經(jīng)歷了從 一個(gè)低水平到一個(gè)高水平后又迅速回落的過(guò)程? 總磷在養(yǎng)殖前期到中期這個(gè)階段呈現(xiàn)上升趨勢(shì)? 并在中期達(dá)到了最高值?但伴隨著養(yǎng)殖的繼續(xù)進(jìn) 行而又迅速回落?最后在養(yǎng)殖的末期再次升高 ?表 ? 表 ?實(shí)驗(yàn)池塘各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 日期 ? ? ? 水溫? ? ? ? 鹽度 ? 溶氧? ? ? ? ? ? ? 透明度? ? ? ? 氨氮? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 硝氮? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 亞硝氮? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 總氮? ? ? ? ? ? ? 總磷? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 注?表中同一列標(biāo)有不同字母的平均數(shù)表示差異顯著? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)分析 沉積物磷酯脂肪酸組成及相對(duì)含量?在養(yǎng) 殖的不同時(shí)期? 個(gè)不同的池塘總共檢測(cè)到 ? ? ? ? 種類從 ? ? 到 ? ? 共計(jì) ? 種? 其中?飽和脂肪 酸包括 ? ? ? ? ? 和 ? ? 這 ? 種?其 相對(duì)含量為 ? ? ? ? ?是沉積物中含量 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?水?產(chǎn)?學(xué)?報(bào)? 卷 最豐富的脂肪酸種類?其次是支鏈脂肪酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 和單不飽和脂肪酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 相對(duì) 含量 分 別 為 ? ? ? ? ? 和 ? ? ? ? ? 多不飽和脂肪酸 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 的相對(duì)含量較低?僅占總 ? ? ? ? 的? ? ? ? ?而環(huán)丙基脂肪酸 ? ? ? 的相 對(duì)含量最低?不到總磷酯脂肪酸? ? ? ? ?的 ? 特征性脂肪酸的主成分分析? ? ? ?將不 同時(shí)期能指示不同微生物群落類型的特征性脂肪 酸進(jìn)行主成分分析?圖 ?結(jié)果顯示? ? ? 和 ? ? ? 兩個(gè)主成分占沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)組成的 ? ? 除 ? ? ? 外?其他特征脂肪酸遠(yuǎn)離原點(diǎn)?說(shuō) 明在養(yǎng)殖過(guò)程中脂肪酸的含量發(fā)生了明顯變化? 其中? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 和 ? ? ? 在 ? ? ? 上的載荷值較高? 主成分一是它們的代表因子? 其中的不飽和脂肪 肪酸是指示真菌的特征脂肪酸脂肪酸? ? ? 是革 蘭氏陰性菌? ?的特征脂肪酸?說(shuō)明了真菌和 ? ?在養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)生了明顯的變化? ? ? ? ? ? ? ? ? 在 ? ? ? 上的載荷值相對(duì)較低?它們是 革蘭氏陽(yáng)性菌? ?的特征性脂肪酸?說(shuō)明養(yǎng)殖過(guò) 程沉積物中的 ? ?變化相對(duì)不明顯? 圖 ? ? ?分析顯示特征脂肪酸隨養(yǎng)殖時(shí)間的變化分布 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?微生物總 ? ? ? ? ?生物量?及群落結(jié)構(gòu)變化 有研究發(fā)現(xiàn)用總 ? ? ? ?指示的生物量與用熏 蒸技術(shù)提取計(jì)算的微生物生物量有很好的相關(guān) 性? ? ? 因此本試驗(yàn)用總 ? ? ? ?指示總微生物 生物量變化? 如圖 ? 所示?在整個(gè)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng) 殖的不同時(shí)期? 個(gè)實(shí)驗(yàn)塘沉積物中的微生物量 有顯著變化?主要表現(xiàn)在 ? ? ? ?總量? ? ? ? ? ?隨 著凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖的延長(zhǎng)皆呈遞增的趨勢(shì)?后期 的 ? ? ? ? ?為養(yǎng)殖中期的 ? ? ? ? ? 倍?到了末期 ? ? ? ? ?已達(dá)到中期的 ? ? ? ? ? 倍? 同時(shí)通過(guò)對(duì) 各類型微生物特征性 ? ? ? ?的統(tǒng)計(jì)分析?細(xì)菌和 真菌的生物量? ? ? ? ?和 ? ? ? ? ? ?以及 ? ? ? ? 和 ? ? ? ?也是隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增 加的?這和上述計(jì)算的微生物總生物量的變化趨 勢(shì)相同? 但通過(guò)對(duì)比不同養(yǎng)殖時(shí)期的 ? ? ? ? ?和 ? ? ? ? ?后發(fā)現(xiàn)?在養(yǎng)殖的整個(gè)周期內(nèi)?雖然沉積 物中微生物是以細(xì)菌為主體的群落結(jié)構(gòu)? 但 ? ? ? ? ?與 ? ? ? ? ?的比值? ? ? 由養(yǎng)殖中期的 ? ? ? ? ?降到后期的? ? ? ? ?再到末 期的? ? ? ? ? 這說(shuō)明了隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行? 細(xì)菌生物量在整個(gè)微生物群落中的比重在不斷降 低?養(yǎng)殖過(guò)程中池底沉積物底質(zhì)理化特性的改變 更適應(yīng)于真菌的生長(zhǎng)繁殖? ? ? ? ? 與 ? ? ? ? ?的比值在中期約為? ? ? ? ?到了后 期已經(jīng)降到? ? ? ? ? 但在末期時(shí)并沒(méi)有 發(fā)生明顯變化?大體為? ? ? ? ? 說(shuō)明 ? 和 ?細(xì)菌在養(yǎng)殖池塘后期到末期這段時(shí)間里? 結(jié)構(gòu)比例已經(jīng)趨于穩(wěn)定?不再隨環(huán)境變化而變化? 圖 ?不同養(yǎng)殖時(shí)期沉積物微生物群落 結(jié)構(gòu)變化?平均值 ? 標(biāo)準(zhǔn)差? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子關(guān)系的 冗余分析? ? ? ? 通過(guò) 選 取 總 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 細(xì) 菌 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?真菌 ? ? ? ? ? ? ? ?細(xì)菌 ? ? ? ? ? ? ? ? ?細(xì)菌 ? ? ? ? ? ? ? ? 細(xì)菌 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 期翟海佳?等?凡納濱對(duì)蝦覆膜養(yǎng)殖池塘沉積物微生物群落的磷脂脂肪酸譜圖分析? ? ? ? ? ? 真菌 ? ? ? ? ? ? ? ?和 ?細(xì)菌 ? ? ? ? ? ?細(xì) 菌 ? ? ? ? ? ? 個(gè)因子作為可能的群落分析 指標(biāo)和 ? ? ? ?溫度?鹽度?透明度以及 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?等環(huán)境因子?對(duì)它們進(jìn) 行冗余分析? ? ? ?考察各不同微生物群落因子 與環(huán)境因子變量之間的關(guān)系?以及各群落因子對(duì) 微生物群落結(jié)構(gòu)隨外界條件變化的表征程度? 冗 余分析使用 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖 ? 圖 ?微生物群落結(jié)構(gòu)因子與水質(zhì)指標(biāo)的冗余分析 坐標(biāo)軸上數(shù)值表示因子的重要程度?箭頭號(hào)延伸至該圖邊緣 的因子表示其變化顯著?與其它因子具相關(guān)性? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?和 ? ? ? ? ? 個(gè)因子與總氮 ? ? ?正相關(guān)性最為顯著?與透明度? ? ?則呈顯 著負(fù)相關(guān)性? ? ? ?本身和 ? ? ? ? ?和 ? ? ? ? ?有著 較好的負(fù)相關(guān)性?圖 ?因此可以通過(guò)這兩個(gè)因 子進(jìn)行表征? ? ? ? ?和 ? ? ? ?與 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?呈現(xiàn)顯著正相關(guān)?同時(shí)與 ? ?的顯著負(fù)相 關(guān)性最高? ? ?本身和 ? ? ? ?和 ? ? ? ? 有著很好的負(fù)相關(guān)性?因此可以通過(guò)它們進(jìn)行表 征? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 和 ? ? ? ? ? ? 個(gè) 因 子 還 與 ? ? ? ? ?有顯著正相關(guān)關(guān)系?與 ? ? ? ? ?和 ? ? ? ? ? 的正相關(guān)關(guān)系稍弱?與 ?呈現(xiàn)一定的負(fù)相關(guān)性? ? ? ? ? ? ? ? ?與 ? ?存在著顯著正相關(guān)?與 ? ? ? ? ?則正相關(guān)性不顯著? 另外?因?yàn)樵陴B(yǎng)殖期 間 ? ? ? ?變化不明顯?而 ? ?發(fā)生了較大的波 動(dòng)?因此 ? 個(gè)可能的群落結(jié)構(gòu)因子都沒(méi)能很好地 表征它們的變化?圖 ? 綜上可知?在本實(shí)驗(yàn)分 析中? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?和 ? ? ? ? ? 個(gè)因子能夠較好地反映微生物群落結(jié)構(gòu) 對(duì)環(huán)境因子的應(yīng)答? ? ?和 ? ?兩個(gè)因子與環(huán) 境營(yíng)養(yǎng)要素相關(guān)性的主要特點(diǎn)雖然與其它 ? 個(gè)因 子一樣?但是相關(guān)性明顯較弱? ?討論 集約化養(yǎng)殖池塘是受人類活動(dòng)直接影響的生 態(tài)系統(tǒng)?系統(tǒng)內(nèi)群落生物量高?有機(jī)負(fù)荷大?各種 理化因子?生物因子關(guān)系十分復(fù)雜?并且處于不斷 變化之中? 在本實(shí)驗(yàn)中? 個(gè)新養(yǎng)殖模式下的 凡納濱對(duì)蝦覆膜養(yǎng)殖池塘?因池底全部覆膜?阻斷 了底泥與池水的物質(zhì)交換?因此隨著養(yǎng)殖時(shí)間的 增加?由于大量殘餌?排泄物和尸體等在池底沉積 和腐敗?高溫下?水體中營(yíng)養(yǎng)鹽等濃度在養(yǎng)殖后期 增加迅速? 同時(shí)? 個(gè)池塘屬于標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖池塘? 因此在養(yǎng)殖過(guò)程中?各種理化因子表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)?一致? 微生物?水生動(dòng)物?外界環(huán)境?人工操作都影 響?zhàn)B殖系統(tǒng)理化因子動(dòng)態(tài)變化?而微生物在環(huán)境 中理化因子的動(dòng)態(tài)變化中具有決定性的作用? 微生物是各種有機(jī)物質(zhì)的分解者和轉(zhuǎn)化者?能直 接利用動(dòng)?植物生命活動(dòng)過(guò)程中和死后分解形成 的各類碎屑?生物大分子等? 在分解過(guò)程中釋放 營(yíng)養(yǎng)鹽為浮游微藻大量繁殖提供所需的養(yǎng)分?而 浮游微藻對(duì)水體中的 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?以 及 ? ?溶解氧的變動(dòng)有重要的影響?所以養(yǎng)殖系 統(tǒng)中的理化因子的動(dòng)態(tài)變化與微生物具有顯著的 關(guān)系? 從本研究結(jié)果來(lái)看?覆膜池塘的特殊環(huán) 境狀況?使池底沉積物隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行而產(chǎn)生? 由于凡納濱對(duì)蝦迅速成長(zhǎng)?水體中的浮游植物和 浮游動(dòng)物也大量繁殖?養(yǎng)殖廢物?如未被食用的 餌料?對(duì)蝦的排泄物以及衰老死亡的浮游生物? 以固態(tài)營(yíng)養(yǎng)物或溶解態(tài)營(yíng)養(yǎng)物的形式沉積于水 底?同時(shí)池塘底質(zhì)中 ? ?以及其他營(yíng)養(yǎng)物的含量 大量增加?因而附著于其中的各類沉積物微生物 也伴 隨 著 其 所 需 養(yǎng) 分 的 增 加 而 迅 速 增 加? 細(xì)菌? 真菌的比值? ? ? ?可反映細(xì)菌和真菌含量 的變化范圍和兩個(gè)種群的相對(duì)豐富程度?對(duì)比 不同養(yǎng)殖時(shí)期的特征性脂肪酸后可發(fā)現(xiàn)?覆膜池 塘沉積物中的 ? ? ?比值逐漸降低?表明在養(yǎng)殖的 后期?真菌的繁殖速度更快?更適應(yīng)覆膜池塘的沉 積物環(huán)境? ? ? ? ? ?等?和 ? ? ? ? ?等?分別報(bào) 道了 ? ? ?比值低的微生物群落可驅(qū)動(dòng)土壤內(nèi)源 碳底物進(jìn)一步礦化?因而可以表明土壤生態(tài)系統(tǒng) 的穩(wěn)定性? 因此?養(yǎng)殖池塘沉積物 ? ? ?比值的逐 漸降低?也暗示隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行?后期的沉積物生 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?水?產(chǎn)?學(xué)?報(bào)? 卷 態(tài)系統(tǒng)變得更為穩(wěn)定? 同時(shí)鑒于真菌在有機(jī)廢水 的生物處理方面有著積極的作用?故可認(rèn)為真菌 生物量的增加對(duì)覆膜池塘污染負(fù)荷的降低有較大 貢獻(xiàn)? 另外在自然生態(tài)系統(tǒng)中?在細(xì)菌結(jié)構(gòu)中 占優(yōu)勢(shì)?但在覆膜養(yǎng)殖池塘中這種優(yōu)勢(shì)卻在養(yǎng)殖 過(guò)程中逐漸降低? 可見(jiàn)覆膜池塘的特殊生態(tài)環(huán)境 對(duì) ?細(xì)菌有著更為積極的意義? 通過(guò)把微生物群落結(jié)構(gòu)因子與水質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行 ? ? ?分析?發(fā)現(xiàn) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?的變化 與 ? ?呈線性正相關(guān)關(guān)系? ? ? ?和 ? ? ? ? 與 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系?說(shuō)明了 整個(gè)池塘的氮循環(huán)和微生物數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化有著 重要的相互依托關(guān)系? 微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)環(huán)境變 化尤其是可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化很敏感?當(dāng)有 機(jī)質(zhì)大量存在時(shí)?微生物便能充分發(fā)揮其分解利 用有機(jī)質(zhì)的能力?其中的氮源更是以各種形式分 散在水體中被各種類型的微生物所利用?因此也 豐富了微生物的群落結(jié)構(gòu)? ? ? ? ? ? ?等?的研 究也表明氮含量高低以及氮源的循環(huán)有可能成為 影 響 微 生 物 數(shù) 量 變 化 的 限 制 因 子? 另 外 ? ? ? ? ? ?等?提到趨于簡(jiǎn)單化的微生物群落生 態(tài)系統(tǒng)是不穩(wěn)定的?也增加了養(yǎng)殖生物患病的可 能性?而豐富的微生物群落結(jié)構(gòu)可以更好地維護(hù) 養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)平衡? 微生物的生命活動(dòng)釋放的營(yíng) 養(yǎng)鹽能促使浮游植物的大量繁殖?導(dǎo)致 ? ?降低? 本實(shí)驗(yàn)中微生物總量與 ? ?呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)?進(jìn)一步 說(shuō)明試驗(yàn)未期沉積物微生物的數(shù)量和多樣性程度 較高?促進(jìn)了有機(jī)物的分解及浮游植物的生長(zhǎng)? ? ? ? ? ? ?等?研究發(fā)現(xiàn)微生物的總量隨水溫升高 而增大?但當(dāng)水溫已處于適宜范圍時(shí)?溫度對(duì)微生 物的促進(jìn)作用明顯減弱?而其它影響因子變得更 為重要? 從本實(shí)驗(yàn)的水溫變化趨勢(shì)看?從 ? 月到 ? 月間采樣?水溫的變化幅度并不大?且處于微生 物繁殖的適宜范圍? ? ? ?因此對(duì)于微生物 總量的相關(guān)性不高? 本實(shí)驗(yàn)利用 ? ? ? ?技術(shù)分析了覆膜凡納濱對(duì) 蝦養(yǎng)殖池塘不同時(shí)期的沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu) 變化情況和與環(huán)境因子的相關(guān)性? 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明?整個(gè)養(yǎng)殖過(guò)程中?新型養(yǎng)殖模式的覆膜池塘環(huán) 境因子表現(xiàn)出良好的一致性和穩(wěn)定性?同時(shí)沉積 物微生物群落的多樣性以及結(jié)構(gòu)變化與環(huán)境的協(xié) 調(diào)性也表現(xiàn)得較為合理? ? ? ? ?技術(shù)利用 ? ? ? ? ? 不同時(shí)期的組成差異來(lái)描述環(huán)境樣品中的微生物 群體?在一定程度上克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的缺陷? 并且操作相對(duì)簡(jiǎn)便?是一種快捷?可靠的微生物群 落分析方法? 但在實(shí)際應(yīng)用中? ? ? ?技術(shù)并不 能準(zhǔn)確地定量不同種群的絕對(duì)生物量?也不能反 映種群功能特點(diǎn)? 因此?在今后的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中 應(yīng)該結(jié)合其他分子生物學(xué)技術(shù)從微生物功能群落 的層面研究微生物群落結(jié)構(gòu)?并繼續(xù)利用 ? ? ? ? 譜圖分析方法對(duì)養(yǎng)殖池塘沉積微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn) 行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)分析?通過(guò)與環(huán)境因子對(duì)比分析?以便 更好地認(rèn)識(shí)和利用微生物之間的結(jié)構(gòu)變化及其物 種的多樣性來(lái)指導(dǎo)漁業(yè)生產(chǎn)? 參考文獻(xiàn)? ? ? ?崔玉珩? 人工養(yǎng)蝦池生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其控制 對(duì)策? ? 海洋科學(xué)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?賈俊濤?呂艷?李筠? 對(duì)蝦圍隔生態(tài)系底泥中細(xì)菌 數(shù)量動(dòng)態(tài)研究? ? 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展? ? ? ? ? ? ?申玉春?葉富良?周玉竹?等? 南美白對(duì)蝦高位池沉 積物理化性質(zhì)和細(xì)菌狀況的研究? ? 華中農(nóng)業(yè)大 學(xué)學(xué)報(bào)? ? ? ? ? ?錢麗君?張德民?徐小紅? 應(yīng)用 ? ? ? ?分析三疣梭 子蟹養(yǎng)殖塘底泥細(xì)菌的多樣性? ? 水產(chǎn)學(xué)報(bào)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?喻曼?曾光明?陳耀寧?等? ? ? ? ?法研究稻草固態(tài) 發(fā)酵中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化? ? 環(huán)境科學(xué)? ? ? ? ? ? ?趙大勇?燕文明?馮景偉?等? 磷脂脂肪酸分析在湖 泊沉積物微生物生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用? ? 化學(xué)與 生物工程? ? ? ? ? ?張秋芳?劉波?林營(yíng)志?等? 土壤微生物群落磷脂脂 肪酸 ? ? ? ?生物標(biāo)記多樣性? ? 生態(tài)學(xué)報(bào)? ? ? ? ?國(guó)家海洋局?國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局? ? ? ? ? 海 洋調(diào)查規(guī)范? ? 北京?中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 期翟海佳?等?凡納濱對(duì)蝦覆膜養(yǎng)殖池塘沉積物微生物群落的磷脂脂肪酸譜圖分析? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?申玉春?熊邦喜?葉富良?等? 凡納濱對(duì)蝦高位池細(xì) 菌數(shù)量變化與水環(huán)境因子的關(guān)系? ? 海洋科學(xué)? ? ? ? ?鄭天凌?陳瑛? 控制對(duì)蝦弧菌病藥物的實(shí)驗(yàn)研究 ? ? 水產(chǎn)學(xué)報(bào)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?