化學毒物的一般毒性作用.ppt

第6章 一般毒性作用及評價,2,一般毒性：基礎毒性，實驗動物單次、多次或長期染毒所產(chǎn)生的總體毒性綜合效應； 特殊毒性：三致作用和生殖毒性。,化學毒物的一般毒性作用研究是毒理學工作中非常重要的內(nèi)容。毒物的一般毒性作用觀察是毒理學的經(jīng)常性工作，對防治外源化學物所致急慢性中毒，對毒理學安全性評價和危險度評定，制訂衛(wèi)生標準以及管理毒理學的決策方面均具有十分重要的意義。,根據(jù)接觸毒物的時間長短，一般毒性的實驗方法分為： 急性毒性 短期重復劑量 亞慢性毒性 慢性毒性,第一節(jié) 急性毒性試驗,In 1984, 5,000 people died and 30,000 were permanently disabled due to exposure to methyl isocyanate（異氰酸甲酯，MIC） from an industrial accident in India Many people die each year from inhaling carbon monoxide （CO）from faulty heaters,機體（實驗動物或人）一次或24h內(nèi)多次接觸外源化學物后在短期內(nèi)所產(chǎn)生的毒性效應，包括一般行為和外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應。,一、急性毒性的概念,急性毒性（acute toxicity）,實驗動物接觸化學物的方式或途徑不同， “一次”的含義也有所不同 經(jīng)口和注射接觸，“一次”是指在瞬間將受試化學物輸入實驗動物體內(nèi) 經(jīng)呼吸道吸入與經(jīng)皮膚接觸，“一次” 是指在一個特定的期間內(nèi)實驗動物持續(xù)地接觸受試化學物的過程 所以“一次”含有時間因素,化學物使實驗動物發(fā)生中毒效應的快慢和劇烈的程度，可因所接觸的化學物的質(zhì)與量不同而異 有的化學物在實驗動物接觸致死劑量的幾分鐘之內(nèi)，就可發(fā)生中毒癥狀，甚至死亡 而有的化學物則在幾天后才顯現(xiàn)中毒癥狀和死亡，即遲發(fā)死亡,急性毒性的概念,需要注意,急性接觸的次數(shù)：一次，24h多次 中毒效應出現(xiàn)的時間 不僅以接觸毒物后毒性癥狀出現(xiàn)的時間，主要以接觸毒物的時間，觀察時間：714天 強度：一次性大劑量，中毒癥狀明顯，常發(fā)生死亡,二、急性毒性試驗的目的,求出致死劑量及其他急性毒性參數(shù) 觀察中毒表現(xiàn)、毒作用強度和死亡情況，初步評價毒物的毒效應特征、靶器官、劑量反應（效應）關系和對人體產(chǎn)生損害的危險性 為其他毒理試驗提供接觸劑量和選擇觀察指標的依據(jù) 為毒理學機制研究提供線索,總體原則,三、急性毒性試驗方法的要點,實驗動物 染毒途徑 染毒劑量 觀察周期 觀察指標的選擇、計算方法和評價,急性毒性反應與人近似 易于飼養(yǎng)、操作方便 繁殖力較強，數(shù)量較大 價格較低，易于獲得,（一）實驗動物的選擇和要求,主要原則,實驗動物的物種和品系,嚙齒類（rodent species）,非嚙齒類（nonrodent species）,小鼠：昆明種、NIH、ICR,大鼠：Sprague-Dawley(SD)、Wistar,犬或猴,實驗動物的物種和品系,首先選擇哺乳動物，其中以大小鼠為最常用。 急性皮膚毒性實驗：成年大鼠、豚鼠或家兔，優(yōu)先考慮白色家兔。 急性吸入毒性實驗和經(jīng)口毒性實驗：優(yōu)先考慮大鼠。,根據(jù)接觸途徑選擇實驗動物,大鼠：180-240g 小鼠：18-25g 家兔：2-2.5kg,實驗動物的年齡和體重,剛成年、健康、未曾交配和受孕的動物 小動物根據(jù)體重 同一次試驗同一批實驗動物體重變異范圍不應超過平均體重的20%,實驗動物的性別,雌雄各半 如雌、雄動物毒效應有明顯差異，應分別并求出雌性和雄性動物的LD50值 特殊的試驗研究可僅作單一性別的急性毒性試驗,實驗動物分組與數(shù)量,根據(jù)組數(shù)和每組數(shù)量來決定數(shù)量 LD50，一般為4-6組 大、小鼠每組10只，犬類6只 嚴格遵循隨機化的原則,實驗動物的預檢,給藥前檢疫觀察 大、小鼠、兔、豚鼠1周，犬猴23周 適應新環(huán)境，減少環(huán)境和生理條件變化可能對試驗結果的影響 篩檢健康狀況不符合試驗要求的動物,實驗動物的給藥前禁食處理,經(jīng)口途徑染毒，實驗動物胃腸道內(nèi)食物存留量對化學毒物的毒性可產(chǎn)生較明顯的干擾 大、小鼠隔夜禁食，染毒2h后提供飼料 經(jīng)口多次染毒可不禁食,（二）受試物及處理,受試物的接受、分樣、保管、稱量、配制以及在此過程中的嚴格的質(zhì)量保證是急性毒性試驗成功與否的重要環(huán)節(jié)。,（二）受試物及處理,常用劑型：水溶液、混懸液、油溶液 所用的溶劑和助溶劑應該是基本無毒的，與受試物不起反應 水溶性受試物，蒸餾水、去離子水、生理鹽水，保持與體內(nèi)滲透壓一致 水不溶性受試物，溶于或懸浮于適當?shù)挠袡C溶劑中 受試物一般應臨用前新配,（二）受試物及處理,急性毒性試驗受試物給予動物染毒的量有規(guī)定。常用實驗動物和染毒途徑的適宜容積（最大容積）分別為：大鼠灌胃1.0（3.0）ml/100g體重（BW）；小鼠灌胃0.1（0.4）ml/10g（BW）。,適宜容積染毒,毒性較大的受試物給藥量較小 毒性較低的受試物常需較大量的染毒 給藥容積根據(jù)染毒途徑和實驗動物 經(jīng)口：20ml/kg(空腹動物) 經(jīng)皮：2ml/kg 靜脈：1ml/kg(5min以上),受試物及處理,(三) 染毒方法,應考慮人在生產(chǎn)和生活環(huán)境中接觸該化學毒物的情況，通常根據(jù)實驗目的、化學毒物的性質(zhì)和用途、人類實際接觸途徑和方式來選擇染毒途徑。,(三) 染毒方法,模擬實際接觸的途徑和方式 有利于不同化學物之間結果的比較 受試物的性質(zhì)和用途 受試物毒性評價程序的要求,工業(yè)毒物：經(jīng)呼吸道、皮膚 農(nóng)用化學物：經(jīng)口、皮膚、呼吸道 藥品：經(jīng)口、注射、皮膚 食品：經(jīng)口 環(huán)境污染物：經(jīng)口、呼吸道、皮膚,染毒途徑,消化道、呼吸道、皮膚、注射,染毒途徑影響受試物急性毒性,不同途徑的吸收量和吸收速率,吸收速率：靜脈注射呼吸道腹腔注射肌內(nèi)注射皮下注射消化道皮內(nèi)注射經(jīng)皮 同一受試物不同染毒途徑LD50的大小通常符合上述規(guī)律,經(jīng)口（胃腸道）染毒,LD50值來比較不同化學物急性毒性大小,灌胃：溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導管注入胃內(nèi)，等容量灌胃法 吞咽膠囊：將受試物裝入膠囊中，放至舌后部，迫使動物咽下。犬、猴 喂飼：將受試物摻入動物飼料或飲水中供實驗動物自行攝入,灌胃法,急性實驗多采用灌胃法。小鼠的灌胃針長約45cm，直徑為1mm，大鼠的灌胃針長約68cm，直徑約1.2mm。灌胃針的尖端焊有一小圓金屬球，金屬球為中空的。焊金屬球的目的是防止針頭刺入氣管或損傷消化道。針頭金屬球端彎曲成20左右的角度，以適應口腔、食道的生理彎曲度走向。,用左手固定鼠，右手持灌胃器，將灌胃針從鼠的口腔插入，壓迫鼠的頭部，使口腔與食道成一直線,將灌胃針沿咽后壁慢慢插入食道，可感到輕微的阻力,此時可略改變一下灌胃針方向，以刺激引起吞咽動作，順勢將藥液注入。一般灌胃針插入小鼠深度為34cm，大鼠或豚鼠為46cm。常用灌胃量小鼠為0.21ml，大鼠14ml，豚鼠15ml,鼠類的灌胃法,經(jīng)呼吸道染毒,經(jīng)呼吸道染毒（inhalation）： 研究生產(chǎn)條件下以氣體、蒸氣、粉塵、煙、霧等形式存在的化學毒物和評價環(huán)境空氣污染物。,靜式吸入染毒 動式吸入染毒,經(jīng)呼吸道染毒,氣管內(nèi)注入,吸入染毒,靜式吸入染毒,將一定量的易揮發(fā)的靜態(tài)化學毒物或一定體積的氣態(tài)化學毒物加入到具有一定體積的密閉容器內(nèi)，使實驗動物吸入染毒。,靜式吸入染毒,方法：一定體積的密閉容器，加入易揮發(fā)的液態(tài)或氣態(tài)受試物 染毒柜體積、動物數(shù)、時間，依據(jù)實驗動物最低需氣量計算 優(yōu)點：簡單、方便、受試物消耗少，適合于小鼠 缺點：氧氣減少，濃度不穩(wěn)定，經(jīng)皮吸收，不適合稍大動物，揮發(fā)性,動式吸入染毒,將實驗動物處于有空氣流動的染毒柜中，新鮮空氣不斷流入，污染空氣不斷流出。溫度、濕度、氧及二氧化碳分壓相對恒定，并有隨時補充受試物，維持濃度穩(wěn)定?？刹蓸颖O(jiān)測受試物濃度，可持續(xù)接觸受試物，無時間限制。,動式吸入染毒裝置的組成,染毒柜 機械通風系統(tǒng) 配氣系統(tǒng),38,動式吸入染毒設備,動式吸入染毒方式分類,動式吸入接觸（動式染毒） 面罩接觸（面罩吸入染毒）,動式吸入染毒優(yōu)缺點,優(yōu)點：受試物濃度和氧分壓較穩(wěn)定 缺點：設備要求高，消耗受試物量很大，操作比較復雜，費時費工,氣管注入法,經(jīng)喉插入法、氣管穿刺法、暴露氣管穿刺法 優(yōu)點：染毒劑量較準確，用毒物量少；形成中毒模型速度快。 缺點：操作易造成損傷，引起動物死亡；不能發(fā)揮上呼吸道的防衛(wèi)作用，與自然吸入有差異。,經(jīng)皮膚染毒,液態(tài)、氣態(tài)甚至粉塵狀態(tài)的化學毒物 多選擇家兔和豚鼠，采用動物脊柱兩側皮膚脫毛（剪毛法、剃毛法、拔毛法、化學脫毛法） ，局部涂敷受試化學毒物并以玻璃鐘罩、油紙或塑料薄膜覆蓋固定一定的時間。,經(jīng)皮膚染毒,農(nóng)藥、化妝品、工業(yè)毒物、環(huán)境污染物、外用藥物 常用大鼠 染毒方式：,脫毛：化學或機械法脫毛（體表面積的10%） 染毒：局部涂敷或大鼠、小鼠浸尾法,經(jīng)注射途徑染毒（ingestion）,進行化學毒物的毒作用機制研究、比較毒性研究、了解化學毒物代謝與毒物動力學參數(shù)或?qū)本人幬镞M行篩選研究。 腹腔注射、靜脈注射（大、小鼠尾靜脈、兔耳靜脈）、肌內(nèi)注射、皮下注射等。,45,經(jīng)注射途徑染毒,（四） 劑量選擇,參考新化學物的理化性質(zhì) 參考相關資料 先用少量動物，以較大的劑量間隔染毒，找出10%-90%（或0%-100%）的致死劑量范圍，然后設計正式實驗的劑量和分組 根據(jù)試驗所選的LD50計算方法確定劑量組數(shù),了解化學毒物的理化特性，純度，雜質(zhì)成分與含量等,有相關毒性資料可供參考者,沒有毒性資料可供查閱者,預試驗,找出大致致死范圍(即死亡率從0-10%至90-100%),設計正式試驗的劑量和分組,近似化學物的LD50(LC50)值作預期毒性中間劑量，上下各設計12個劑量組,最大耐受量試驗,各組劑量的計算,i =（lgLD90-lgLD10）/（n-1）,或 i =（lgLD100- lgLD0）/（n-1）,i為組距，n為設計的劑量組數(shù)。以最低劑量值（LD0或LD10）的對數(shù)劑量加上一個i值，即是第二個劑量組的對數(shù)劑量，依次類推直至最高劑量組,49,霍恩法（Horn）：平均移動內(nèi)插法（moving average interpolation） 改進寇氏法 Bliss法：最大似然性法（maximum likelihood method），最精確的計算方法,LD50的幾種計算方法,50,霍恩法,設4個劑量組 每組動物數(shù)相等，一般為4只或5只 各劑量公比為10。結果可查表求出LD50及其95%可信限。 由于動物數(shù)量較少，其95%可信限范圍大，適用于預試驗較好。,51,改進寇氏法,各組實驗動物數(shù)相等，一般為10只 各劑量組劑量呈等比級數(shù)排列，至少有5個劑量組 死亡率呈正態(tài)分布，最低劑量組死亡率小于20%，最高劑量組死亡率高于80%，所選劑量對數(shù)差值相等。,化學物LD50大于2g/kg 或5g/kg，表明毒性不大 我國藥品的毒理研究指導原則規(guī)定要以最大容積最高濃度給予動物后未見死亡,不必計算LD50,化學毒物的LD50（LC50）的測定一般要求計算實驗動物接觸受試物后14天內(nèi)的總死亡數(shù)。,試驗周期,全面觀察動物的各種反應和變化，仔細分析實驗動物在染毒后出現(xiàn)的中毒表現(xiàn)、劑量效應、時間分布。觀察記錄的內(nèi)容：,（五） 毒性作用觀察,中毒體征及發(fā)生過程 死亡情況和時間分布 體重 病理形態(tài)學變化,（五） 毒性作用觀察,中毒體征及發(fā)生過程,詳細觀察和記錄動物出現(xiàn)的中毒體征 發(fā)生時間 體征發(fā)展的經(jīng)過 各個系統(tǒng)的特征 初步確定急性毒性靶器官 不同表現(xiàn)提供毒性機制的信息,57,58,續(xù)表6-1 嚙齒類動物急性中毒表現(xiàn),死亡情況和時間分布,實驗動物的死亡數(shù)對LD50值產(chǎn)生明顯影響 分析中毒死亡時間的分布規(guī)律可以提供重要信息：原形，代謝,60,久效磷小鼠經(jīng)口與腹腔注射染毒，均呈現(xiàn)染毒劑量增加，死亡時間縮短，呈直線負相關，這提示實驗動物致死原因是化學物原形所致； 過氧化二磷酸二環(huán)己酯給大鼠腹腔注射后呈現(xiàn)明顯的染毒劑量對數(shù)值與死亡時間呈負相關關系，但給小鼠腹腔注射后，染毒劑量與死亡時間無明顯相關。這提示可能與該化學物在大鼠和小鼠體內(nèi)代謝不同有關。,體重,體重可反映動物中毒后的整體變化。對存活動物尤其是對低于LD50劑量組的存活動物，應在觀察期14天內(nèi)稱量其體重的變化，以便了解受試物引起毒效應的持續(xù)時間。,體重,反映動物中毒后綜合性整體變化，比較客觀簡便的量化指標 應定期多次稱量動物的體重變化，一般為每周1次或2次 對體重指標的變化要仔細觀察和分析,體重變化的原因,影響食欲或消化系統(tǒng)的功能 影響食物的吸收和利用 影響水的攝取 腎功能急性損傷,病理檢查,死亡動物：大體病理變化，如臟器外觀、大小、色澤的變化，有無充血、出血、水腫或其他改變 存活動物：觀察期結束時應進行解剖檢查，必要時做組織病理學檢查,（六） 觀察時間和周期,染毒以后應即刻開始觀察動物中毒表現(xiàn)和死亡情況 給藥當天應連續(xù)或多次觀察，以后可根據(jù)情況，每天2次或多次觀察直至試驗周期結束,觀察周期一般為14天 LD50(LC50)計算時以觀察周期內(nèi)各組動物的總死亡數(shù)為依據(jù) 不同化學物質(zhì)引起動物中毒體征出現(xiàn)的時間不同，而且引起死亡的時間存在個體差異 速殺型化學毒物僅計算24h的死亡率,（六） 觀察時間和周期,急性毒性試驗求出LD50(LC50)值，通過LD50值進行急性毒性分級(acute toxicity classification)，評價毒物的急性毒性強弱，比較毒物的急性毒性大小,四、急性毒性分級和評價, 不論我國或國際上的急性毒性分級標準均還存在不少缺點，因為它們主要是根據(jù)經(jīng)驗確定，客觀性還不足 目前還沒有全世界公認、統(tǒng)一的毒性分級標準,急性毒性分級,69,70,按照急性毒性分級標準評價毒性大小是相對粗略的分級 報告：LD50、急性毒性級別；中毒體征、出現(xiàn)體征時間、死亡前征兆、死亡時間和劑量組間分布、存活動物的體重變化和恢復情況、死亡動物的病理變化,急性毒性分級,舉 例,文獻：曹靜祥, 治洪, 余淑懿, 等. 硼硒聯(lián)合對大鼠的急性毒性和亞慢性毒性研究. 衛(wèi)生研究, 2002,31(4):297-299. 中國預防醫(yī)學科學院環(huán)境衛(wèi)生與衛(wèi)生工程研究所,前言 單獨的硒、單獨的硼均有抗氟作用，有研究表明硼硒聯(lián)合作用使氟中毒大鼠的康復效果較好。因此，我們在硼硒抗氟藥效實驗研究的基礎上，為了解硼硒聯(lián)合毒性作用，為現(xiàn)場人群應用硼硒聯(lián)合防治氟中毒提供試驗依據(jù)，我們就硼硒聯(lián)合對大鼠的急性毒性及亞慢性毒性進行試驗研究,舉 例,主要試劑：四硼酸鈉、亞硒酸鈉 急性毒性試驗：參照霍恩氏（Horn）法，選用80只成年大鼠，雌、雄各半，平均體重220g，隨機分為8組。受試物用蒸餾水溶解，動物禁食16小時，經(jīng)口灌胃一次染毒，觀察兩周內(nèi)動物的死亡數(shù)，查表計算LD50,舉 例,材料與方法,四硼酸鈉與亞硒酸鈉聯(lián)合對大鼠的急性毒性實驗：根據(jù)亞硒酸鈉和四硼酸鈉的半數(shù)致死量，將受試物按比例混合并用蒸餾水溶解，40只，隨機分為4組。應用預測與實測LD50的對比法評價兩種毒物之間的聯(lián)合作用性質(zhì),舉 例,材料與方法,急性毒性試驗：急性硒中毒動物在服藥5min后出現(xiàn)急性硒中毒癥狀，最初表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉，然后呼吸困難，四肢痙攣，直至死亡。急性硼中毒動物在服藥60min后出現(xiàn)急性中毒癥狀，表現(xiàn)為不好動、腹瀉、口鼻出血，甚至驚厥死亡,舉 例,結 果,舉 例,結 果,聯(lián)合作用評價結果,結 果,LD50：四硼酸鈉對雌、雄性大鼠1470mg/kg。亞硒酸鈉對雄性大鼠14.70mg/kg，對雌性大鼠6.81mg/kg。聯(lián)合對大鼠的急性毒性，雄性大鼠為1727.10mg/kg，雌性大鼠1717.94mg/kg,討 論,我國工業(yè)毒物急性毒性分級標準評價：本實驗四硼酸鈉與亞硒酸鈉混合毒物屬于低毒類物質(zhì)。該毒物的值可為亞慢性毒性實驗提供染毒劑量水平的設計依據(jù),討 論,第二節(jié) 蓄積毒性作用,蓄積作用(accumulation): 當化學毒物反復多次給動物染毒、化學毒物進入機體的速度(或總量)超過代謝轉(zhuǎn)化的速度和排泄的速度(或總量)時，化學毒物或其代謝產(chǎn)物就有可能在機體內(nèi)逐漸增加并貯留?；瘜W毒物容易蓄積的組織和器官稱為儲存庫(depot)。機體常見的儲存庫有血漿蛋白、脂肪組織、肝臟、腎臟、骨骼等。, 蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎 一種外源化學物有無蓄積作用是評定該化學物是否可能引起潛在慢性中毒的論據(jù)之一，也是制定衛(wèi)生限量標準時安全系數(shù)的一種依據(jù),物質(zhì)蓄積( material accumulation ) ：實驗動物反復多次接觸化學物后，用化學分析方法能夠測得機體內(nèi)存在該化學物或其代謝產(chǎn)物 功能( 損傷 )蓄積( functional accumulation)：有的化學物在長期接觸后，機體內(nèi)雖不能測出其原型或代謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用,功能蓄積可能是 由于貯存體內(nèi)的化學物或其代謝產(chǎn)物的數(shù)量極微，不能檢出物質(zhì)的蓄積 或者是由于每次機體接觸化學物之后 所引起的損害累積所致,蓄積系數(shù)(accumulation coefficient) 是多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)效應(或死亡)的累積劑量ED50(n)與一次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)相同效應(或死亡)的劑量ED50(1)的比值，即： ED50(n) LD50(n) K= 或 K= ED50(1) LD50(1),87,第三節(jié) 短期、亞慢性、慢性毒性作用,88,一、短期重復劑量毒性,短期重復劑量毒性：實驗動物或人連續(xù)暴露外源化學物1430天所產(chǎn)生的中毒效應。 短期重復劑量毒性試驗具有預備和篩選的性質(zhì)，尤其是28天短期毒性試驗，基本成為一種初步估計長期暴露可能引起毒效應的經(jīng)濟實用的短期重復毒性試驗。,89,二、亞慢性毒性作用,90,亞慢性毒性(subchronic toxicity) 是指人或?qū)嶒瀯游镞B續(xù)接觸較長時間、較大劑量的化學毒物所產(chǎn)生的中毒效應。 接觸時間通常指介于單次染毒和10%動物壽命的范圍，通常為16個月 。 較大劑量是相對低劑量而言，沒有明確的劑量范圍下限，上限一般小于急性LD50。,（一 ）基本概念,91,1. 研究受試物亞慢性毒性劑量反應（效應）關系，確定未觀察到有害作用的劑量（NOAEL）和其觀察到有害作用的最低劑量（LOAEL），提出安全限量參考值。,（二）亞慢性毒性試驗的目的,92,2.觀察受試物亞慢性毒性效應譜、毒作 用特點和毒作用靶器官。 3.觀察受試物亞慢性毒性作用的可逆性。 4.為慢性毒理試驗的劑量設計和觀察指標選擇提供依據(jù)。,（二）亞慢性毒性試驗的目的,93,5. 為在其他試驗（急性、亞急性、其他動物種屬的亞慢性試驗等）中發(fā)現(xiàn)的或未發(fā)現(xiàn)的毒作用提供新的信息，比較不同動物物種毒效應的差異，為受試物毒性機制研究和將研究結果外推到人提供依據(jù)。,（二）亞慢性毒性試驗的目的,94,（三）亞慢性毒性試驗方法的要點,1. 實驗動物的選擇,（1）種屬和品系 （2）性別、年齡和動物數(shù) （3）微生物學寄生蟲學等級和飼養(yǎng)環(huán)境,95,嚙齒類和非嚙齒類：大鼠、犬和猴 經(jīng)皮毒性試驗，可用兔或豚鼠。 大鼠常用Wistar和Sprague Dawley。 犬多選用Beagle犬。,（1）種屬和品系,96,雌雄各半。 選擇離乳不久的動物，大鼠6-8周齡（體重80-100g） 同組動物體重相差不應超過平均體重 的10%，組間平均體重不超過5% 大鼠、小鼠每組不少于20只，犬、猴 每組不少于6只,（2）性別、年齡和動物數(shù),97,亞慢性毒性試驗周期較長，觀察指標較多，實驗動物的質(zhì)量、喂飼條件和試驗環(huán)境明顯影響受試物的毒性反應。 實驗動物分四級：普通級、清潔級、無特定病原體級（SPF級）、無菌級。,（3）微生物學寄生蟲學等級和飼養(yǎng)環(huán)境,98,使用清潔級及以上等級大小鼠，飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)進行試驗。 保持符合規(guī)范的溫度、日溫差、濕度、換氣次數(shù)、氣流速度、壓強梯度、落下菌數(shù)、空氣潔凈度、氨濃度、噪聲和照度。,（3）微生物學寄生蟲學等級和飼養(yǎng)環(huán)境,99,環(huán)境嚴格控制人員、物品和環(huán)境空氣的進出。 合理營養(yǎng)的飼料，潔凈的飲水，清潔無污染的墊料和籠具。 不同項目的試驗應分室進行。 人工控制晝夜交替。,（3）微生物學寄生蟲學等級和飼養(yǎng)環(huán)境,100,2. 染毒方式,盡量選擇和人類接觸途徑相似的方式； 與預期進行的慢性毒作用研究的接觸途 徑相一致。 以經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮染毒為多。 染毒頻率通常每日一次，連續(xù)給予，如 試驗期為3個月以上，可每周6次。,101,（1）經(jīng)口染毒途徑：灌胃法、喂飼法、膠囊法。建議灌胃法，特別是要求染毒量準確性高。犬采用膠囊法或灌胃法。長期灌胃給藥需熟練的技術和非常認真負責的工作態(tài)度，出現(xiàn)失誤，均應如實記錄，以利試驗結果的準確評價。,102,（2）經(jīng)呼吸道染毒的時間2-6h/d，設計需要可縮短或延長。工業(yè)毒物可縮短至1h，環(huán)境污染物可延長至8h （3）一些特殊染毒途徑的亞慢性毒性試驗，受目前技術條件的限制較難進行，常不能確保給藥量的準確。如長期反復的直腸用藥、眼睛用藥等，期待研制出完善的專用裝置。,103,（4）隨著注射劑型的新藥增多，需經(jīng)常進行注射染毒長期毒性試驗。犬靜脈注射比較易行、常用。大鼠連續(xù)反復長期的靜脈注射十分困難，有熟練的技術人員，也難以進行的?？捎闷渌⑸渫緩酱?，如腹腔注射。盡管大鼠有較強的抗感染能力，但長期反復腹腔注射仍應注意無菌操作。,104,（5）在進行亞慢性毒性試驗時，最好應結合進行毒代動力學血藥濃度的監(jiān)測。為了維持實驗動物體液中有一個準確的血藥濃度水平，保持受試物生物學效應每日相似性，亞慢性毒性試驗每日染毒的時間應保持一致。在每日上午進行，給藥后喂食。,105,3. 劑量選擇和分組,設3個劑量組和1個陰性（溶劑）對照組。 高劑量組應能引起明顯的毒性或少量動物的死亡（少于10%）。 低劑量組應無中毒反應，相當于未觀察到有害作用劑量（NOAEL）。,106,3. 劑量選擇和分組,高低劑量組間設置1個中劑量組，比較理想的中劑量組約相當于觀察到有害作用的最低劑量（LOAEL）。 高、中、低劑量組距以3-10倍為宜，不少于2倍。 對于藥物，大鼠可用人臨床擬用劑量的10、30和100倍，非嚙齒類可用5、15、50倍。,107,3. 劑量選擇和分組,在實際工作中，由于受試物多樣性和試驗中多種因素的變化，亞慢性毒性試驗的劑量設計和確定是很不容易的，需要具有豐富的毒理學經(jīng)驗。,108,4. 觀察指標,對經(jīng)外源化學物染毒后的實驗動物進行全面、系統(tǒng)、深入的觀察檢測是亞慢性毒性試驗必做的工作，檢查的時間包括染毒前、試驗過程中、染毒結束時和染毒結束后的恢復期做檢查。檢查的項目包括一般性指標、實驗室指標、系統(tǒng)尸解和病理組織學檢查、其他特殊指標檢查。,亞慢性和慢性毒性試驗檢測各種毒性終點的流程圖,亞慢性、慢性,毒性試驗,過程中,外觀,生長和發(fā)育,行為功能,毒性體征,生物體液,最終體重,臟器濕重,臟,/,體比,活殺解剖,器官/組織,大體尸解,固定/染色,顯微鏡檢查,血液學,血清-化學-生化學,尿分析,生物學標志,酶,內(nèi)源性成分,膽汁,尿,110,指外觀體征和行為活動，糞便性狀、食量及體重變化等，能綜合反映毒物對機體的毒作用，是敏感的綜合毒效應指標。在試驗過程中，應詳細記錄，仔細分析，可以從中發(fā)現(xiàn)一些化學毒物的毒性特征。,（1）一般性指標,111,觀察實驗動物出現(xiàn)的外觀體征和行為改變，記錄各癥狀出現(xiàn)的時間和先后次序，包括食欲、活動、被毛、分泌物、排泄物、呼吸等，尤其要留意動物被毛的光潔度與色澤、眼分泌物、呼吸、神態(tài)、行為等。有助于分析化學毒物損害機體的部位及程度。,外觀體征、行為活動,112,是一個敏感、客觀的指標，反映了受試物對實驗動物的生長發(fā)育及一般狀態(tài)的影響。 如果受試組動物體重增長比對照組低10%，提示是由受試物引起的毒效應 如果各劑量組體重增長改變有劑量-反應關系，肯定是一種毒性效應。 每周稱重一次，3個月后每2周稱重一次。,動物體重,113,每月觀察并記錄動物的飼料消耗量，計算食物利用率，即動物每食入100g飼料所增長的體重克數(shù)（g體重/100g飼料）。比較各染毒組與對照組動物的食物利用率，有助于了解化學物的毒性效應，尤其將體重指標和食物利用率結合起來分析。,食物利用率,114,食物利用率,如果受試物影響食欲，則每日進食量減少，體重增長會受影響，但食物利用率不一定改變；如果受試物干擾了食物的吸收或代謝，雖然不一定影響食欲，但體重增長卻減慢，因而食物利用率也會有所改變。,115,通常包括血、尿常規(guī)和血液生化指標檢測。 目的是發(fā)現(xiàn)受試物所致器官損傷和功能紊亂，體內(nèi)生化轉(zhuǎn)化和排泄的重要器官肝和胃的功能是檢查重點，血液是另一個重要的靶器官。,（2）實驗室檢查,116,血液學檢查：紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、白細胞計數(shù)及分類、血小板計數(shù)、凝血時間等。 尿液檢查:外觀、pH值、蛋白、糖、潛血和沉淀物鏡檢等，可提供與毒物有關的靶器官毒性和中間代謝產(chǎn)物的信息。,117,血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN0、總量白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、總膽紅素(T-BIL)、肌酐(Crea)、總膽固醇(T-CHO)等。,血液生化檢查：,118,大鼠作試驗，不需在給藥前作實驗室檢查。 大動物犬等試驗，染毒前檢測12次。 恢復期試驗，在結束時作實驗室檢查，對判斷受試物作用的可逆性、延遲性有重要意義。,119,不影響實驗動物生理功能的最大取血量為其總血量的10%。 總血量約為50ml/kg，0.3kg的大鼠約有15ml血液，一次取血量不應超過1.5ml。,120,試驗結束時活殺實驗動物，作系統(tǒng)解剖，進行詳細的肉眼檢查，測定臟器重量并作組織病理學檢查。在試驗中間死亡或處于瀕死狀態(tài)的動物，亦應作及時的系統(tǒng)尸解和病理學檢查。,（3）系統(tǒng)尸解和病理組織學檢查,121,臟器系數(shù)或稱臟體比，指某個臟器的濕重與單位體重的比值，通常是每100g體重中某臟器所占的質(zhì)量，表示為臟器質(zhì)量（g）/體重（100g）。適用于實質(zhì)性臟器，若某臟器的臟器系數(shù)增大或減小，反映該臟器的腫大或縮小，如增生、充血、水腫、萎縮等變化。,臟器重量和臟器系數(shù),122,目的 是確定化學毒物對機體毒作用的靶部位、損害的性質(zhì)和程度，從病理學角度尋找化學毒物與病理改變的劑量效應關系，為了解化學毒物的毒效應及其機制提供依據(jù)。,病理學檢查,123,檢查內(nèi)容： 大體檢查、常規(guī)病理組織學檢查、酶組織化學檢查、免疫組織化學檢查、細胞超微結構檢查等，分別從大體、組織、細胞、亞細胞甚至分子水平等多個方面發(fā)現(xiàn)化學毒物的毒效應。,病理學檢查,124,根據(jù)受試物毒性資料、試驗中的觀察和受試物的結構等線索增加一些檢查項目。 推測受試物可能對心血管系統(tǒng)有毒性，進行心電圖、血壓、眼底檢測； 對神經(jīng)系統(tǒng)有影響，進行神經(jīng)行為、神經(jīng)反射等檢查；,（4）其他指標的檢查,125,對電解質(zhì)、微量元素代謝有毒作用，則檢測血鈣、血磷等含量； 增加眼科、骨髓象檢查等。 增加酶組織化學檢查、免疫組織化學檢查和細胞超微結構檢查等。,（4）其他指標的檢查,126,為充分了解受試物的中毒特征，獲得盡可能多的揭示毒性靶器官和中毒機理的線索，亞慢性毒性試驗應認真仔細的選擇觀察指標，如能有特異性指標更好。,（4）其他指標的檢查,127,特異性指標（生物學標志）是指能反映毒物對機體毒作用本質(zhì)的特征性指標，常與其毒作用機制有關。確定特異性指標的難度較大。,（4）其他指標的檢查,128,在仔細分析化學毒物的急性、亞急性毒性試驗過程中動物中毒表現(xiàn)的基礎上，結合受試物的化學結構和了解其特殊的化學基團找出線索，然后設計測試項目和方案。,129,三、 慢性毒性作用,慢性毒性(chronic toxicity)：指人和試驗動物長期(甚至終生)反復接觸低劑量化學毒物所產(chǎn)生的毒性效應。 “長期”，一般是指2年。大鼠相當于終生染毒，兔相當于生命期的36%，犬為20%，猴為13%。,130,1. 研究慢性毒性劑量-反應（效應）關系。確定長期接觸造成有害作用的最低劑量(LOAEL)或閾劑量和造成有害作用的劑量(NOAEL)，為制定人類接觸時的安全限量標準，如最高容許濃度(MAC)和每日容許攝入量(ADI)以及危險度評價提供毒理學依據(jù)。,慢性毒性試驗目的,131,2. 觀察慢性毒性效應譜、毒作用特 點和毒作用靶器官。 3. 觀察慢性毒性作用的可逆性。 4. 為毒性機制研究和將毒性結果外 推到人提供依據(jù)。,慢性毒性試驗目的,132,慢性毒性試驗方法要點,與亞慢性相同。最好用純系動物并將同窩動物均勻分配到各組。 嚙齒類首選大鼠，非嚙齒類為犬或猴。 每個劑量組的動物數(shù)應滿足試驗結束時數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理的要求，如每組大鼠4060只，狗810只，雌雄各半。,（一）實驗動物的選擇,133,應選擇年齡較小的動物，一般選初斷奶的大鼠或小鼠，即小鼠出生后3周（體重約1015g），大鼠出生34周（體重約5070g），狗46月齡。 試驗結束時每個劑量組每性別的嚙齒類動物數(shù)不少于10只，非嚙齒類不少于4只。,（一）實驗動物的選擇,134,工業(yè)毒物染毒6個月或更長時間，環(huán)境毒物與食品則要求1年以上或2年。 多采用經(jīng)口染毒。染毒5-6d/w。 根據(jù)需要可經(jīng)皮膚染毒和經(jīng)