農(nóng)林學類論文-番茄細菌性斑點病菌無毒基因研究進展.doc

農(nóng)林學類論文-番茄細菌性斑點病菌無毒基因研究進展作者：張月娟朱秀秀陳新趙廷昌論文關鍵詞無毒基因；抗病基因；植物防御反應；過敏性壞死反應論文摘要番茄細菌性斑點病是影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害，Pseudomonassyringaepv.tomato(Pst)為其病原菌，其與番茄的互作系統(tǒng)是研究植物抗感病機理的典型模式系統(tǒng)。Pst存在2種無毒基因：avrPto和avrPtoB，它們編碼的蛋白質(zhì)均能與番茄抗性基因P0編碼的serThr蛋白激酶互作，符合Flor“基因?qū)颉睂W說。AvrPto和AvrPtoB在表達Pto的抗性植物中，與Pto互作，表現(xiàn)無毒功能，引發(fā)植物防御反應；而在缺失Pto的感病植物中，它們具有毒性，促進細菌的生長。本文綜述了番茄細菌性斑點病菌無毒基因avrPto及avrPtoB的結(jié)構(gòu)特點及其功能，這有助于了解病原物與植物的互作機制，對認識植物的感病性、抗病性以及植物防御反應都具有重要意義。番茄是重要的經(jīng)濟作物，每年因病蟲危害，造成其大量減產(chǎn)。番茄細菌性斑點病是危害番茄生產(chǎn)的重要病害之一，為一種世界性病害，主要危害番茄的葉、莖、花、葉柄和果實。自1933年首次報道以來，在全球26個國家均有發(fā)現(xiàn)，我國也于1998年發(fā)現(xiàn)。據(jù)報道，該病可造成575的產(chǎn)量損失。該病的病原菌是丁香假單胞番茄致病變種Pseudomonassyringaepv.tomato(Pst)。Pst與番茄的互作系統(tǒng)是研究病原物與植物互作的典型模式系統(tǒng)，該系統(tǒng)的無毒基因(avirulencegene，avr)和抗病基因(resistencegene，R)符合Flor“基因?qū)颉睂W說。當病原物中存在無毒基因avrPto或avrPtoB，寄主中存在并表達相應抗病基因Pto時，無毒蛋白就會與抗病蛋白相識別，激活植物防御反應系統(tǒng)，引起過敏性壞死反應(hypersensitivereaction，HR)，從而抑制細菌的生長。本文綜述了番茄細菌性斑點病無毒基因avrPto及avrPtoB的結(jié)構(gòu)特點及其功能，從無毒基因的角度闡述病原物與植物的互作機制，這對認識植物的感病性、抗病性以及植物防御反應都具有重要意義。1病原菌Pseudomonassyringaepv.tomatoPseudomonassyringae是農(nóng)業(yè)上重要的植物病原細菌，根據(jù)其宿主特異性，該菌可分為50多個致病變種Pst是其中的一個致病變種，該菌菌體短桿狀，直或稍彎，單細胞，大小為(0.11)m(1.54)m，革蘭氏陰性，在含蔗糖的培養(yǎng)基上能產(chǎn)生綠色熒光，超過41不能生長。該菌株能夠侵染番茄和擬南芥。Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000是Pseudomonassyringaepv.tomato的模式種，2003年C.R.Buell等報道了它的全基因組序列，這是丁香假單胞菌屬中第一個被完全測序的菌株，此工作的完成為研究Pst的致病機理奠定了基礎。Pst存在2個小種：0號小種和1號小種，2個小種的區(qū)別在于它們對抗病番茄具有不同的毒力。在抗病番茄上接種Pst的0號小種，植物會產(chǎn)生HR反應；而在抗病番茄上接種1號小種，Pst大量增殖，引起感病反應。如果將O號小種或1號小種接種于不表達Pro的感病番茄植株上，它們都會引起番茄的感病反應。2無毒基因簡介植物機體內(nèi)存在防御機制，當植物受到病原菌侵襲時，能夠檢測到病原菌，從而延遲或抑制疾病的發(fā)生。植物的防御反應包括兩種：一種是基礎防御反應，包括細胞壁的加厚，防御相關蛋白的表達等；另一種是依賴于抗性蛋白的HR反應，是指在抗病植物中存在抗病基因(R)，其表達的抗病蛋白(R蛋白)能夠識別病原菌型分泌系統(tǒng)(typesecretionsystem，TTSS)的效應因子，與之互作，從而激活植物防御反應系統(tǒng)，引起過敏性壞死反應(HR)，過敏性壞死反應的主要表現(xiàn)就是引起侵染位點的局部快速的程序性壞死反應(programedcelldeath，PCD)，從而抑制侵染位點病原菌的生長和擴展。病原菌必須克服植物防御反應，從中獲得營養(yǎng)得以增殖，才能夠使植物發(fā)病。很多革蘭氏陰性菌侵襲植物都需要TTSS，病原菌通過TTSS將效應蛋白注入植物體內(nèi)，這些蛋白進入寄主細胞后，可以通過修飾或改變寄主的關鍵蛋白來促使植物發(fā)病。目前已鑒定了50多種可以進入寄主細胞的病原菌效應蛋白，這些效應蛋白進入寄主細胞后，修飾或改變寄主的關鍵蛋白以改變植物的生理狀態(tài)，抑制植物防御反應，從而提高病原菌的生存適合度，最終導致其大量增殖，致使植物發(fā)病。TTSS中編碼型泌出通道的hrp(HRandpathogenicity)和hrc(HRandconserved)基因、編碼效應蛋白的avr(avirulence)和hop(Hrpdependentoutprotein，依賴hrp的泌出蛋白)基因，均決定著植物病原細菌在寄主和非寄主植物上的反應。無毒基因是病原菌的遺傳因子，其編碼產(chǎn)物能夠激發(fā)病原物與寄主特異性互作。病原物無毒基因與植物抗病基因產(chǎn)物之間相互作用導致產(chǎn)生的基因?qū)蚩剐允侵参锟共⌒缘闹匾问健o毒基因(avr)被認為是一類兩性效應因子(bifunctionaleffector)，在決定病原細菌的無毒性和致病性兩方面均起作用：在含互補抗病基因植物中表現(xiàn)無毒效應，而在不含互補抗病基因植物中顯示毒性效應。雖然大部分無毒蛋白的功能至今還不清楚，但已探清一些無毒蛋白的氨基酸序列和已知蛋白序列同源，如avrBs3、pthA以及avrb6都具有NLS(nuclearlocalizationsignal)序列，將含有放射性標記的基因嵌入到NLS區(qū)，能定位到細胞核中。這就表明，定位于細胞核對于發(fā)揮無毒基因功能是必要的。Pst存在2種無毒基因：無毒基因avrPto和avrPtoB。這2種無毒基因均已克隆并獲得全序列，1992年從Pst的O號小種中克隆到無毒基因avrP-to，2002年又克隆到了無毒基因avrPtoB。avrPto和avrPtoB序列一致性很低，分別編碼具有18ku和59ku的蛋白質(zhì)。關于它們的功能，2005年N.C.Lin等構(gòu)建了DC3000avrPto、avrPtoB以及avrPtoavrPtoB突變體，分別接種于感病番茄上，發(fā)現(xiàn)野生型DC3000引起的癥狀較單突變體的癥狀嚴重，單突變體的癥狀又較雙突變體嚴重，而菌群數(shù)量沒有差別。由此可見，avrPto和avrPtoB是Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000上僅有的無毒基因。AvrPtoPto和AvrPtoBPto符合Flor“基因?qū)颉睂W說。AvrPto和AvrPtoB通過TTSS進入到植物體中，在缺失Pto的感病番茄中，它們是毒性因子，能夠促進細菌的生長；在表達Pto的抗病番茄中，它們作為無毒因子，能夠引起宿主的HR反應。Pto存在于抗病番茄中，編碼一個絲氨酸一蘇氨酸(Ser-Thr)的蛋白激酶，它能特異性的識別avrPto或avrPtoB編碼的無毒蛋白，激活植物防御反應系統(tǒng)，從而引發(fā)植物的抗病反應。3無毒基因avrPto31avrPto基因結(jié)構(gòu)特點無毒基因avrPto存在于PstO號小種中，于1992年首次分離。無毒基因avrPto編碼一個由164個氨基酸組成的18ku親水性蛋白質(zhì)，其N末端具有十四烷基結(jié)構(gòu)域和棕櫚酸鹽結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域能將蛋白定位并穩(wěn)定于植物細胞膜上。缺失N末端十四烷基結(jié)構(gòu)域的AvrPto突變體G2A，不能將AvrPto定位于植物細胞膜上，也不能與Pto互作，從而不能引起基于Pto介導的抗病反應。因此，推測無毒蛋白AvrPto在Pst的細胞質(zhì)中合成，通過TTSS進入到植物細胞中，在植物細胞膜上與Pto識別、互作、引起植物的抗病反應。AvrPto和其他無毒蛋白一樣，在GenBank和EMBL中沒有發(fā)現(xiàn)它的同源序列。avrPto啟動子上游具有hrp基因簇，該基因簇位于-42至-34區(qū)域，能夠調(diào)節(jié)avrPto的表達，缺失突變-34區(qū)域能引起avrPtomRNA表達量急劇下降，因此該位點可能是轉(zhuǎn)錄因子的識別位點。-37至-31的核苷酸序列TGGAACC，除了存在于avrPto的上游以外，也存在于其他很多無毒基因的上游，例如，avrPph3、avrB、avrC、avrD、avrRpt2以及hrpAB、hrpF、hrpS。但是，還沒有直接的試驗結(jié)果證明該位點是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。分析AvrPtoPto互作的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)AvrPtoPro的互作依賴于AvrPto的一端的螺旋束和GINP結(jié)構(gòu)域(Gly-Ile-Asn-Pro)，它們分別能夠與Pro蛋白激酶的P-1環(huán)和P+1環(huán)結(jié)合。32avrPto的無毒功能avrPto在表達Pto的抗病番茄上具有無毒功能，在缺失Pto的感病番茄上具有毒性功能。將Pst1號小種接種于表達Pto的抗病番茄中，引起寄主的HR反應；將avrPto采用農(nóng)桿菌的方法轉(zhuǎn)化到表達Pto的Nicotianatabacum和N.benthamiaria的葉片中，能夠引起煙草的HR反應。說明AvrPto是一個能夠單獨起作用無毒因子，番茄Pto基因家族的成員能夠直接或間接地識別它，引起抗病反應。1996年Tang等通過酵母雙雜交系統(tǒng)分析AvrPto和Pto是否能直接互作，結(jié)果表明，AvrPto能與Pto發(fā)生高度特異性互作，而與Pto基因家族的其他成員不能互作。迄今為止，通過純化的蛋白還不能證明AvrPto和Pto能否在體外互作，因此還不能證明是否有其他宿主蛋白參與互作。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)要激活植物抗性，除了需要AvrPto和Pto外，還需要富含亮氨酸重復(leucine-richrepeat，LRR)的Prf蛋白、Fbox蛋白SGTl以及HSP90。為了研究AvrPtoPto互作機制，Shan等構(gòu)建了AvrPto的多個突變體，發(fā)現(xiàn)AvrPto的164個氨基酸并不都是與Pto互作所必需的。Lin等構(gòu)建重組AvrPto蛋白，即第19個氨基酸包含十四烷基化結(jié)構(gòu)域和十六酰基化結(jié)構(gòu)域和部分AvrPto蛋白(29133)組成融合蛋白，通過農(nóng)桿菌方法轉(zhuǎn)化到表達Pro基因的抗性番茄中，發(fā)現(xiàn)仍然能夠引起HR反應；去掉N末端的30個氨基酸以及C末端的40個氨基酸也不影響AvrPto與Pto在酵母雙雜交系統(tǒng)中的互作，說明AvrPto的N末端和C末端并不是AvrPtoPto互作所必需的；點突變AvrPto蛋白164個氨基酸中的60個不影響其與Pto的互作。一直以來，人們認為AvrPto與Pro互作激活了Pto的激酶活性，然而，最近研究AvrPtoPto復合體的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，AvrPtoPto互作并沒有改變Pto激酶活性，而是激活了Prf的活性。在缺失AvrPto時，Pto激酶上的-1與P+1環(huán)能夠抑制Prf活性，從而抑制其介導的抗性反應；一旦AvrPto與Pto互作，Pro激酶上的1和P+1就會和AvrPto上的螺旋束以及GINP結(jié)構(gòu)域(Gly-IleAsn-Pro)互作，從而改變了Pto與Prf原有的互作方式，激活Prf，引起Prf介導的抗病反應。研究還發(fā)現(xiàn)AvrPto有2個顯著的結(jié)構(gòu)域，其中由S94、I96和G99所編碼AvrPto的結(jié)構(gòu)域?qū)τ谧R別Pto蛋白中N145、P146、S147和S153編碼的結(jié)構(gòu)域很重要，它們可能參與AvrPtoPto互作。33avrPto的其他功能AvrPto除了能夠和Pto互作，引發(fā)Pto介導的抗病反應之外，還能夠抑制番茄上非寄主病原菌引起的HR反應。Pseudomonassyringaepv.tomatoTl是N.benthamiana的非寄主病原菌，它能夠在Nbentharniana上引起HR反應。然而在此植株上如果同時接種Pseudomonassyringaepv.tomatoT1和P.s.pv.tomatoDC3000時，這種壞死反應就會被延遲；對AvrPto的突變體研究發(fā)現(xiàn)，AvrPto的某些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谝种芇CD是必須的，如G2A，P146L以及N末端的12個氨基酸。因此，抑制宿主PCD反應是成功侵染宿主植物的策略之一。4無毒基因avrPtoBavrPtoB廣泛存在于植物病原細菌各菌屬中，包括假單胞菌屬(Pseudornonas)、黃單胞菌屬(Xanthornonas)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)和歐文氏菌屬(Erwinia)。無毒蛋白AvrPtoB一方面在感病植株中能夠增加細菌的毒性，抑制番茄免疫反應及PCD，促進細菌的生長；另一方面在抗病植物中，AvrPtoB通過型分泌系統(tǒng)進入植物細胞，與抗性蛋白Pto互作，引發(fā)HR反應。41avrPtoB的發(fā)現(xiàn)avrPtoB是偶然發(fā)現(xiàn)的，在研究avrPto時，將avrPto的缺失突變菌株接種于表達Pto的抗病番茄中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)仍然存在HR反應。這就表明在丁香假單胞菌中可能存在第2個無毒基因，它和avrPto一樣，能夠與Pto互作，引起抗性反應。為了分離出該基因，Kim等利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以Pto蛋白為誘餌，在P.s.pv.tomatoDC3000的文庫中篩選和Pto互作的基因，進而找到了avrPtoB。進一步研究證明AvrPto和AvrPtoB都是引起Pto介導的植物抗病的效應因子。42avrPtoB的結(jié)構(gòu)特點avrPtoB編碼一個59ku的蛋白質(zhì)，該蛋白是一個組成性的蛋白質(zhì)，可以分為N末端和C末端兩部分，Abranmovitch等構(gòu)建了僅包括N端1308個氨基酸序列的AvrPtoBC末端缺失突變體，發(fā)現(xiàn)該突變體能夠在酵母雙雜交系統(tǒng)中與Pto互作，并能引起N.bentharniana的HR反應。由此可見，AvrPtoB的N端是其與Pto互作所必需的。AvrPtoB的C端(308533)具有CDS(celldeathsuppressor)的活性，能夠抑制寄主植物的PCD反應。同時其還具有的GINP結(jié)構(gòu)域，雖然對于AvrPtoBPto的互作沒有影響，但會影響Pto引起的HR反應。Kim等構(gòu)建GINP位點突變體發(fā)現(xiàn)，AvrPtoBC末端的44個氨基酸對于抑制細胞程序性壞死反應是必須的，當突變該44個氨基酸，AvrPtoB突變體就會引起，N.bentharniana上的程序性壞死反應，這種PCD反應的獲得表明AvrPtoB的CDS活性能夠