原核生物的基因重組.ppt

第六節(jié) 原核生物的基因重組,基因重組（gene recombination）： 將兩個(gè)不同性狀個(gè)體的基因通過一定的方式轉(zhuǎn)移到一起，并發(fā)生重新組合，產(chǎn)生新的遺傳性狀的過程，稱為基因重組(gene recombination)或遺傳重組。 重組：遺傳物質(zhì)在分子水平上發(fā)生的交換； 雜交：在細(xì)胞水平上遺傳物質(zhì)的交換. 雜交必然包含著重組，但重組不僅限于雜交這一形式。,原核生物的基因重組類型,4種形式：1）轉(zhuǎn)化 2）轉(zhuǎn)導(dǎo) 3）接合 4）原生質(zhì)體融合,一、 轉(zhuǎn)化（transformation）,定義：受體細(xì)胞直接吸收供體細(xì)胞的DNA片段, 并與其染色體同源片段進(jìn)行遺傳物質(zhì)交換，從而使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的現(xiàn)象。,轉(zhuǎn)化子（ transformant）：經(jīng)轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)了供體性狀的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子，即轉(zhuǎn)化成功的菌落。,目前已知有二十多個(gè)種的G+和G-細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力 此過程可以發(fā)生在土壤和海洋環(huán)境中，可能是自然界遺傳交換的重要方式。,自然遺傳轉(zhuǎn)化（natural genetic transformation）,人工轉(zhuǎn)化（artificial transformation）,感受態(tài)細(xì)胞（competent cell） ：具有攝取外源 DNA能力的細(xì)胞,1. 感受態(tài),感受態(tài)：是指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。一個(gè)細(xì)菌能否出現(xiàn)感受態(tài)是由其遺傳性決定的，但受環(huán)境條件的影響也很大，因而表現(xiàn)差別很大。,感受態(tài)因子：調(diào)節(jié)感受態(tài)的一類特異蛋白，它包括三種主要成分：膜相關(guān)DNA結(jié)合蛋白、細(xì)胞壁自溶素和幾種核酸酶。,自然感受態(tài)與人工感受態(tài)的不同？,自然感受態(tài)的出現(xiàn)是細(xì)胞一定生長(zhǎng)階段的生理特性 （如肺炎鏈球菌的感受態(tài)出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期） 受細(xì)菌自身的基因控制,人工感受態(tài)則是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有 攝取DNA的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。 （該過程與細(xì)菌自身的遺傳控制無關(guān)！）,進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：,（1）建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞,（2）外源游離DNA分子,感受態(tài)的機(jī)理研究：,局部原生質(zhì)體化假說： 處于感受態(tài)的細(xì)胞局部失去了細(xì)胞壁，使外源DNA能順利經(jīng)膜進(jìn)入菌體。,酶受體假說： 受體細(xì)胞表面出現(xiàn)了一種能結(jié)合DNA并使之進(jìn)入細(xì)胞的酶。,2. 轉(zhuǎn)化模型,（1）轉(zhuǎn)化因子 本質(zhì)是離體的DNA片斷或質(zhì)粒DNA 。轉(zhuǎn)化因子進(jìn)入細(xì)胞前還會(huì)被酶解成更小的片段，約8kb。在不同的微生物中，轉(zhuǎn)化因子的形式不同，dsDNA,ssDNA. 革蘭氏陰性的嗜血桿菌中，細(xì)胞只吸收dsDNA形式的轉(zhuǎn)化因子，但進(jìn)入細(xì)胞后需經(jīng)酶解為ssDNA，才能與受體菌的基因組整合； 革蘭氏陽性的鏈球菌和芽孢桿菌中，dsDNA的一條鏈必須在胞外降解，只有ssDNA形式的轉(zhuǎn)化因子才能進(jìn)入細(xì)胞。 但不管何種情況，最易與細(xì)胞表面結(jié)合的仍是dsDNA。 由于每個(gè)細(xì)胞表面能與轉(zhuǎn)化因子相結(jié)合的位點(diǎn)有限（如肺炎鏈球菌約10個(gè)），因此，從外界加入無關(guān)的dsDNA就可競(jìng)爭(zhēng)并干擾轉(zhuǎn)化作用。 質(zhì)粒DNA也是良好的轉(zhuǎn)化因子，但它們通常并不能與核染色體組發(fā)生重組。 轉(zhuǎn)化的頻率通常為0.11，最高為20。,(2) 轉(zhuǎn)化過程,肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化的主要過程,轉(zhuǎn)化因子進(jìn)入細(xì)胞,轉(zhuǎn)化因子單鏈配對(duì)與整合,復(fù)制,分離,自然轉(zhuǎn)化過程的特點(diǎn)：,a）對(duì)核酸酶敏感；,c）轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化（DNA） 給體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系；,d）通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化形成轉(zhuǎn)化子效率要低得多；,提高質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率的二種方法： 1）使質(zhì)粒形成多聚體，這樣進(jìn)入細(xì)胞后重新組合成有 活性的質(zhì)粒的幾率大大提高； 2）在質(zhì)粒上插入受體菌染色體的部分片段，或?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn) 化進(jìn)含有與該質(zhì)粒具有同源區(qū)段的質(zhì)粒的受體菌-重組獲救,b）不需要活的DNA給體細(xì)胞；,定義：噬菌體DNA被感受態(tài)細(xì)胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒。,4. 轉(zhuǎn)染(transfection)：,現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動(dòng)物細(xì)胞的過程也稱轉(zhuǎn)染,提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑進(jìn)入微生物細(xì)胞并表達(dá)后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。,特點(diǎn)：,5、人工轉(zhuǎn)化,用CaCl2處理細(xì)胞，PEG介導(dǎo)、電穿孔、基因槍法等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段（使細(xì)胞膜更易于透過DNA ）。,在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。,不是由細(xì)菌自身的基因所控制；,用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞，使其人為地處于一 種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。,質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高（不像線型DNA 那樣易于降解，而且還能在宿主中復(fù)制。任何來源的DNA 將其連接到質(zhì)粒上都能進(jìn)入受體細(xì)胞）.,二、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）,轉(zhuǎn)導(dǎo)：利用完全或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。,由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的重組受體 細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子 （transductant） 攜帶供體部分遺傳物質(zhì)（DNA片段）的噬菌體稱為 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。,細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo),局限性轉(zhuǎn)導(dǎo),1、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalized transduction）,通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體對(duì)供體菌基因組上任何小片段DNA進(jìn)行誤包，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。,(1) 意外的發(fā)現(xiàn),1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder為了證實(shí)大腸桿菌以外 的其它菌種是否也存在接合作用，用二株具不同的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型 的鼠傷寒沙門氏菌LT22A(trp-)（P22）和LT2(his-)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：,用“U”型管進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)時(shí)，在供體和受體細(xì)胞不接觸的情況下，同樣出現(xiàn)原養(yǎng)型細(xì)菌！,沙門氏菌LT22A(trp-)是攜帶P22噬菌體的溶源性細(xì)菌 另一株LT2(his-)是非溶源性細(xì)菌,一個(gè)表面看起來的常規(guī)研究卻導(dǎo)致 一個(gè)驚奇和十分重要發(fā)現(xiàn)的重要例證！,基因的傳遞很可能是由可透過“U”型管濾板的 P22噬菌體介導(dǎo)的(在接種LT22A的一端出現(xiàn)了原養(yǎng)型),（普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)這一重要的基因轉(zhuǎn)移途徑的發(fā)現(xiàn)）,(2) 轉(zhuǎn)導(dǎo)模型,轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體為什么“錯(cuò)” 將宿主的DNA包裹進(jìn)去?,噬菌體的DNA包裝酶也能識(shí)別染色體DNA上類似pac的位點(diǎn) 并進(jìn)行切割，以“headful”的包裝機(jī)制包裝進(jìn)P22噬菌體外殼， 形成只含宿主DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒（假噬菌體）。,因?yàn)槿旧w上的pac與P22 DNA的pac序列不完全相同， 利用效率較低，這種“錯(cuò)裝”機(jī)率一般僅約10-6-10-8,形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的噬菌體可以是溫和的，也可以是烈性的，但必須具有能偶爾識(shí)別宿主DNA的包裝機(jī)制，并在宿主基因組完全降解以前進(jìn)行包裝。,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本要求：,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的三種后果：,進(jìn)入受體的外源DNA通過與細(xì)胞染色體 的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子,流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortive transduction）,轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制，但其攜帶的基因可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá)。,特點(diǎn)：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落,外源DNA被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗。,如果受體菌通過普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得了供體菌DNA片段后，在其體內(nèi)不發(fā)生基因的交換、整合和復(fù)制，只進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯和性狀的表達(dá)。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)被稱為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo).,2. 局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（restricted transduction） 定義：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù) 特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因 組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。 媒介： 部分缺陷噬菌體（丟失自身一部分基因，并被 同等長(zhǎng)度的宿主基因所取代） 只能轉(zhuǎn)導(dǎo)個(gè)別特定基因,大腸桿菌中噬菌體的正常裂解及半乳糖基因轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成過程,低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT）的定義: 誘導(dǎo)溶源性大腸桿菌而產(chǎn)生的細(xì)胞裂解產(chǎn)物中，除含有正常的噬菌體外，還有少數(shù)（10-6）轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒，因此，用誘導(dǎo)溶源性菌株得來的噬菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率不過10-6 ，稱為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。,高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)(HFT): 如果細(xì)菌染色體中整合有一個(gè)正常的噬菌體時(shí)， 缺陷噬菌體也能整合到同一細(xì)菌染色體上（因?yàn)檎Ｊ删w整合后，產(chǎn)生兩個(gè)細(xì)菌/噬菌體雜合att位點(diǎn)，缺陷噬菌體可以在該位點(diǎn)插入），這種細(xì)菌稱為雙重溶源菌. 雙重溶源菌中，正常噬菌體稱為輔助噬菌體，因?yàn)樗鼛椭毕菔删w整合和繁殖。 雙重溶原菌在紫外輻射等因子的誘導(dǎo)下,原噬菌體容易被切割下來，產(chǎn)生等量的缺陷噬菌體和正常噬菌體，該裂解物稱為高頻率轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物，用這樣的裂解物去感染細(xì)菌，將比低頻率轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物產(chǎn)生多得多的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。這一過程稱為高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。,大腸桿菌的低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)和高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)比較： uv E.coli K12() LFT 裂解物 dg(10-5 10-6) 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 uv E.coli K12(/dg) HFT裂解物 50% (雙重溶源菌) 50%dg轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 低頻率轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT） ： LFT裂解物 E.coli gal- E.coli gal- / dgal+ （極少量轉(zhuǎn)導(dǎo)子菌落) E.coli gal- 高頻率轉(zhuǎn)導(dǎo)(HFT) ： HFT裂解物 E.coli gal- E.coli gal- / dgal+ （ 50% 轉(zhuǎn)導(dǎo)子菌落) E.coli gal-（50%）,普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)與局限轉(zhuǎn)導(dǎo)的特性比較,溶源轉(zhuǎn)變（lysogenic conversion）：,一個(gè)與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似又不同的現(xiàn)象,定義:溫和噬菌體感染細(xì)胞后使之發(fā)生溶源化，因噬菌體的基因整合到宿主染色體上，而使后者獲得了新性狀的現(xiàn)象。,溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同？,a）噬菌體不攜帶任何供體菌的基因；,b）這種噬菌體是完整的，而不是缺陷的；,三、 接合 (conjugation),通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程,1.接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(shí),1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 細(xì)菌的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn),中間平板上長(zhǎng)出的原養(yǎng)型菌落 是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換 和重組所致！,為了減少所培養(yǎng)的結(jié)果是回復(fù)突變的機(jī)會(huì)，采用了雙重或三重營(yíng)養(yǎng)缺陷型。該實(shí)驗(yàn)是建立在不大可能同時(shí)發(fā)生兩種或三種回復(fù)突變的設(shè)想上的。,證實(shí)接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的 “U”型管實(shí)驗(yàn)（ Bernard Davis，1950 ）,2. 能進(jìn)行接合的微生物種類,主要在細(xì)菌和放線菌中存在。 在細(xì)菌中，G 細(xì)菌尤為普遍，如E. coli、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弧菌屬、固氮菌屬和假單胞菌屬等； 放線菌中，以鏈霉菌屬和諾卡氏菌屬最為常見，其中研究得最為詳細(xì)的是天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coeilcolor ）。 在不同屬的一些菌種之間也可發(fā)生接合現(xiàn)象，如大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌間或沙門氏菌與痢疾志賀氏菌間。 在所有對(duì)象中，接合現(xiàn)象研究得最多、了解得最清楚的是E. coli 。E. coli 是有性別分化的，決定性別的是其中的F質(zhì)粒，F(xiàn)質(zhì)粒還是合成性菌毛基因的載體。,3. 大腸桿菌的接合型與接合,細(xì)菌遺傳重組單向過程和F因子的提出 F菌株,F菌株,Hfr菌株,F因子結(jié)構(gòu)圖: 相對(duì)分子質(zhì)量通常為5107，上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛及控制接合過程進(jìn)行的20多個(gè)基因。 圖中黃色區(qū)域表示轉(zhuǎn)座子，通過這些部位可以整合進(jìn)細(xì)菌染色體上形成各種Hfr菌株。,Hfr菌株: 細(xì)胞中的F質(zhì)粒整合到核染色體組上, 與F 菌株相接合后，發(fā)生基因重組的頻率比任何已知的F 與F 接合后的頻率高出幾百倍，這種“雄性”菌株稱為Hfr。,在Hfr菌株與F-細(xì)胞進(jìn)行接合時(shí), OriT序列被缺刻螺旋酶識(shí)別而產(chǎn)生缺口后，F(xiàn)因子的先導(dǎo)區(qū)(leading region)結(jié)合著染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移，F(xiàn)因子除先導(dǎo)區(qū)以外，其余絕大部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末端，由于轉(zhuǎn)移過程常被中斷，因此F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，故HfrF-雜交后的受體細(xì)胞大多數(shù)仍然是F-（即不能使受體菌變成供體）。,接合中DNA轉(zhuǎn)移過程有著穩(wěn)定的速度和嚴(yán)格的順序性 。 染色體上越靠近F因子的先導(dǎo)區(qū)的基因，進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越多，在F-中出現(xiàn)重組子的的時(shí)間就越早，頻率也高。,中斷雜交（interrupted mating）技術(shù)和基因定位,利用HfrF-的接合過程，在不同時(shí)間取樣，并把樣品猛烈攪拌以 分散接合中的細(xì)菌，然后分析受體細(xì)菌基因型，以時(shí)間(分鐘)為 單位繪制遺傳圖譜，該圖譜是細(xì)菌染色體上基因順序的直接反映。,左圖: 不同Hfr菌株的形成方式，以不同的起點(diǎn)不同的順序轉(zhuǎn)移基因。（a）細(xì)菌染色體為環(huán)狀，可以不同的IS位點(diǎn)打開，F(xiàn)質(zhì)粒插入進(jìn)去。 （b） Hfr菌株的部分基因順序。,大腸桿菌基因組很大（全部轉(zhuǎn)移需要100分鐘），其遺傳圖譜須用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成,基因定位：通過遺傳重組等手段確定不同的基因在染色體上的位置及相對(duì)距離，從而獲得遺傳圖譜。,連鎖的二基因間的距離與其共轉(zhuǎn)化，或共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率成反比，因此，可根據(jù)二個(gè)基因被共轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率判斷它們?cè)谌旧w上的相對(duì)距離。,接合作用（中斷雜交）作圖只能判斷相距較遠(yuǎn)的基因間的相對(duì)位置；轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化則可用于對(duì)相隔很近的基因進(jìn)行定位；,大腸桿菌 遺傳圖譜,目前對(duì)大腸桿菌的染色體已定位了1000多個(gè)基因,F菌株,F菌株: Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F因子。 細(xì)胞表面同樣有性菌毛。,FF-與F+F-的不同：給體的部分染色體基因隨F一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞,細(xì)胞基因通過F和F-的接合而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的過程常稱為性導(dǎo)（sexduction）、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)，或F