流行性腦脊髓膜炎實(shí)驗(yàn)室診斷.ppt

流行性腦脊髓膜炎實(shí)驗(yàn)室診斷,天津市衛(wèi)生防病中心病原生物學(xué)部 井良義,何謂流行性腦脊髓膜炎？,流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦），是由腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides，Nm）通過呼吸道傳播所引起的化膿性腦膜炎，常在冬春季節(jié)引起發(fā)病與流行,患者以兒童為多見，現(xiàn)在成年人發(fā)病有增多趨勢。人受Nm 感染后大多數(shù)表現(xiàn)為鼻咽部帶菌狀態(tài)，只有少數(shù)成為流腦患者。,正常人群中Nm帶菌率可達(dá)5 30%。，帶菌者為流腦流行的重要傳染源。 細(xì)菌經(jīng)飛沫傳播，患者潛伏期1 4天，其發(fā)展經(jīng)過可分為三期： 1.首先侵入鼻咽腔，引起上呼吸道感染，有時(shí)局部有炎癥。 2.少數(shù)細(xì)菌侵入血流，造成單純 菌血癥，可有突然發(fā)作的惡寒、發(fā)熱、惡心、嘔吐等，并可有出血性或紅斑性皮疹，或稱淤血點(diǎn)。 3.大量細(xì)菌侵入，由血液或淋巴到達(dá)腦脊髓膜，引起腦脊髓膜炎的癥狀與體征，如頭痛、嘔吐、頸項(xiàng)強(qiáng)直、發(fā)熱等一般腦膜炎癥狀。,適宜的檢測樣品,鼻咽拭子、血液、皮膚粘膜出血點(diǎn)擠出液、血清及腦脊液等。 其中腦脊液、血液、皮膚粘膜出血點(diǎn)擠出液中檢出腦膜炎奈瑟氏菌可直接作為確診依據(jù)。,樣品采集與運(yùn)送,樣品采集（一）,腦脊液：無菌操作，吸出CSF 35mL，立即放到無菌試管內(nèi)離心(2000 3000r/min，30min)，用滅菌過的毛細(xì)管吸取沉淀物直接接種到10羊血巧克力色瓊脂上(CSF上清液部分供檢測Nm特異抗原，亦可將其置于20待測)，5二氧化碳環(huán)境37培養(yǎng)24 72h，每日檢查細(xì)菌生長的情況，及時(shí)分離純培養(yǎng)物供鑒定。,樣品采集（二）,血液：采取病人急性期靜脈血液6mL，無菌操作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉湯三角瓶內(nèi)注入4mL血液(余下的2mL血液同上離心后吸出血清，供檢測Nm特異抗原和抗體，亦可將其置于一20待測)，同上述條件培養(yǎng)2472h，每日進(jìn)行分離培養(yǎng)。,樣品采集（三）,淤血點(diǎn)：選病人皮膚上的新鮮淤血點(diǎn)或淤斑，消毒后用針頭挑破，擠出組織液，用無菌棉簽蘸取先接種含雙抗的葡萄糖增菌肉湯管中增菌812h后分離培養(yǎng)或直接接種10羊血巧克力色瓊脂；涂片，干后革蘭染色，直接鏡檢。,樣品采集（四）,咽拭子：用長柄棉拭子采咽后壁兩側(cè)分泌物，立即接種卵黃雙抗培養(yǎng)基或巧克力雙抗平板，也可將咽拭子放入液體雙抗增菌管內(nèi)，增菌8 12h后分離培養(yǎng) 。,咽拭子接種,咽拭子接種,不合格咽拭子接種,不合格咽拭子接種,樣品的處理和運(yùn)送,早期采集樣品：應(yīng)盡可能采集病人用藥前的早期樣品，這可以明顯提高病原的檢出水平。 及時(shí)處理樣品：應(yīng)盡可能地做到床邊接種，若無可能則應(yīng)在最短的時(shí)間內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行接種培養(yǎng)。 保溫運(yùn)送：應(yīng)盡可能保持樣品處于2036之間，切記不能低溫運(yùn)送（檢測抗體的血清標(biāo)本除外）。,流腦病原學(xué)檢查方法,生長特性,腦膜炎雙球菌為專性需氧菌，初次分離時(shí)需510%的二氧化碳環(huán)境才能生長，最適生長溫度為37 。,菌落特征及菌體形態(tài),菌落：Nm接種于巧克力色瓊脂平皿上，5%CO2，37 培養(yǎng)24小時(shí)后，其菌落直徑約1mm ，表面突起、光滑、濕潤、圓整、略帶灰白色、半透明、不溶血、無色素。 細(xì)菌形態(tài)：為革蘭氏陰性，呈卵圓形和腎形，0.80.6大小。常成對排列，鄰近兩邊扁平凹陷,菌 落 特 征,菌 落 特 征,腦 脊 液 涂 片,生化特征,分解葡萄糖和麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。 不分離蔗糖、果糖和乳糖。 過氧化酶和氧化酶陽性,血清分群鑒定,檢查從病人分離的疑似Nm時(shí)，先用多價(jià)、多價(jià)、多價(jià)抗血清檢測，如果陽性再用分群血清（A群、 B群、C群、W135群抗血清等）檢測。 不與鹽水發(fā)生凝集，與一種腦膜炎抗血清發(fā)生凝集反應(yīng)，即為某一型的流腦菌。 在鹽水中發(fā)生凝集反應(yīng)，不能作為抗血清分群。,菌種保存,短期保存：保存腦膜炎雙球菌，用卵黃鹽水保存，可保存7天。 2長期保存：最好方法是低溫冷凍或冷凍干燥。所有的細(xì)菌都可在-70冰箱中冷凍保存。將腦膜炎雙球菌接種巧克力平板中，放二氧化碳培養(yǎng)箱中35 37 孵育18 20小時(shí)，收集細(xì)菌放到含1ml脫脂牛奶的2ml螺蓋冷凍瓶中。將菌苔在管壁研磨振蕩，使細(xì)菌分散在培養(yǎng)基中。-70 低溫冰箱分類保存。,流腦血清學(xué)檢查方法（一）,玻片凝集試驗(yàn):應(yīng)用玻片凝集試驗(yàn)對Nm病原菌株或帶菌者菌株進(jìn)行血清學(xué)分群。 Nm診斷血清：國產(chǎn)售品有多價(jià)（包含A、B、C、D群），多價(jià) 含1889（Y）、 1890（H）、1892（29E），多價(jià)含319（W135）、1916（X）、1486（I）、1811（K）群及各群單價(jià)血清，共計(jì)14種。（括號內(nèi)為國際編碼）,流腦血清學(xué)檢查方法（二）,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：應(yīng)用ELISA間接法測病人急性期和恢復(fù)期血清中抗A群流腦IgG的抗體水平。此方法也可以應(yīng)用于健康者血清抗體的測定。若病人恢復(fù)期血清抗體效價(jià)較急性期呈現(xiàn)4或4倍以上升高有追溯診斷的意義。,流腦血清學(xué)檢查方法（三）,殺菌力試驗(yàn)：應(yīng)用微量殺菌力試驗(yàn)(TTC法)測定病人急性期和恢復(fù)期血清中對Nm的殺菌抗體水平。此方法也可用于健康人群的血清抗體測定。,流腦其它檢查方法（一）,膠乳凝集試驗(yàn)應(yīng)用膠乳凝集實(shí)驗(yàn)測定病人CSF、急性期血清和尿中Nm群特異抗原，輔助流腦臨床診斷。可用市售的腦膜炎乳膠凝集試劑盒（如法國梅里埃公司的試劑盒）。方法：一滴乳膠試劑（30l）加上一滴病人的腦脊液，涂勻，在2分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性。,流腦其它檢查方法（二）,PCR檢測：應(yīng)用PCR檢查病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特異片段，對流腦病人進(jìn)行早期診斷。,培養(yǎng)基制備,巧克力色血液瓊脂： 成份：營養(yǎng)瓊脂（pH7.6） 100ml 脫纖維血 510ml 制法：將營養(yǎng)瓊脂溶解，以無菌手續(xù)加入羊血，搖勻。置水浴鍋內(nèi)，維持在902030min。待培養(yǎng)基冷至50 時(shí)才傾注平板。如做病人密切接觸者或健康人群帶菌調(diào)查時(shí)，則需加雙抗，每1000ml培養(yǎng)基加入多粘菌素4.2mg（或2.5萬單位），萬古霉素3.3mg。,卵黃鹽水,將新鮮雞蛋洗凈，在70%酒精中浸泡消毒1h后取出，用3%碘酒消毒蛋殼，以無菌操作于雞蛋的一端開一小孔，使蛋清全部流盡，蛋黃倒入置有玻璃珠的三個(gè)燒瓶中，打碎后，一份蛋黃加一份生理鹽水，再在搖珠瓶中振搖，使其混勻呈乳狀分裝試管，56 加溫30 min ，置37 作無菌試驗(yàn)。（腦膜炎雙球菌保菌用）,增菌肉湯,成份：新鮮牛肉湯 100ml 葡萄糖 0.5g 配制： 混合上述成份，調(diào)pH至7.47.6分裝試管，2ml/管或30ml/瓶，高壓滅菌10磅10分鐘，無菌檢驗(yàn)合格后供增菌用。,診斷試劑,1、診斷血清：中國CDC傳控所呼吸道細(xì)菌室流腦組（北京昌平