FLT3基因動(dòng)態(tài)監(jiān)測在急性髓系白血病治療中的應(yīng)用.doc

FLT3基因動(dòng)態(tài)監(jiān)測在急性髓系白血病治療中的應(yīng)用 作者：李樹，王彤，王杰，李軍，張璐 【摘要】 微小殘留病(Minute Residual Disease, MRD)是急性髓系白血病(Acute myeloid leukaemia, AML)復(fù)發(fā)和妨礙長期無病生存率的重要原因。本研究旨在探討FLT3基因在AML發(fā)病中的作用及對微小殘留病(MRD)檢測的意義。 應(yīng)用PCR技術(shù)檢測了125例AML患者在化療與異基因造血干細(xì)胞移植（alloHSCT）治療前后FLT3基因的表達(dá)，并對FLT3基因陽性者進(jìn)行了隨訪觀察。結(jié)果表明： PCR檢測FLT3基因的靈敏度為10-4；AML初診患者中FLT3基因的陽性表達(dá)率為69.6%；完全緩解(CR)患者FLT3表達(dá)基因陽性表達(dá)率44.90%，F(xiàn)LT3轉(zhuǎn)為陰性者占48.98%；FLT3表達(dá)無改變者占6.12%；復(fù)發(fā)者FLT3基因表達(dá)轉(zhuǎn)為陽性，而未緩解者FLT3持續(xù)陽性，治療前FLT3陽性AML患者完全緩解率低于FLT3基因表達(dá)陰性患者，兩者有顯著性差異(p<0.05)。獲得CR的FLT3陽性AML患者的復(fù)發(fā)率顯著高于FLT3陰性患者(p<0.05)。結(jié)論：FLT3基因表達(dá)與白血病發(fā)生有關(guān)，PCR動(dòng)態(tài)檢測AML患者治療前后FLT3表達(dá)水平,可作為判斷AML白血病預(yù)后和監(jiān)測微量殘留病的一項(xiàng)指標(biāo)。 【關(guān)鍵詞】 急性髓系白血病 Dynamic Detection of FLT3 Gene in Patients with AML and Its Significance Abstract Minimal residual disease (MRD) is an important cause of relapse and diseasefree survival time decrease in patients with acute myeloid leukemia (AML). This study was aimed to explore the role of FLT3 gene in AML pathogenesis and its significanse for detection of MRD. Using genomic PCR, 125 AML patients were detected for FLT3 gene expression before and after chemical therapy and allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT), meantime the AML patients with FLT3 positive expression were observed by followup. The results showed that the sensitivity of PCR was 10-4 in FLT3 gene detection; the rates of FLT3 positive expression were 69.6% and 44.90% in the newly diagnosed AML patients and complete remission (CR) patients respectively. The rate of FLT3 expression coverted to negative was 48.98% in treated AML patients, while no change of FLT 3 expression was found in 6.12% treated patients. The FLT3 expression converted to positive in relapsed patients, and FLT3 expression remains positive in nonremitted patients. The CR rate in FLT3 positive expression patients before treatment was significantly lower than that in FLT3 negative expression patients, the difference of which was statistically significant (p<0.05). The AML relapse rate in FLT3 positive patients was significantly higher than that in FLT3 negative expression patients (p<0.05). It is concluded that FLT3 gene expression is related to leukemia pathogenesis; the dynamic levels of FLT3 expression before and after treatment can be used for estimating prognosis of AML patients and detecting MRD. Key words AML; FLT3 gene; MRD; leukemia prognosis; PCR J Exp Hematol 2007; 15(4):705-708 急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia, AML)是發(fā)病率最高的一種造血系統(tǒng)惡性腫瘤，化療方法的完善和造血干細(xì)胞移植技術(shù)的開展使AML的預(yù)后有了很大改善，但仍有不少患者復(fù)發(fā)。目前認(rèn)為，微小殘留?。∕RD）是白血病治療緩解后復(fù)發(fā)的最重要的原因1。近年來分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為常規(guī)骨髓形態(tài)學(xué)檢查難以檢測的MRD提供了新方法，然而目前尚缺乏合適的MDR的檢測指標(biāo)。FLT3是與AML發(fā)生及預(yù)后相關(guān)的一種重要因子2。因此，我們把FLT3作為MRD的基因標(biāo)志，應(yīng)用PCR技術(shù)監(jiān)測AML的治療過程，并探討其臨床意義。 材料和方法 標(biāo)本來源 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志 J Exp Hematol 2007; 15(4)FLT3基因動(dòng)態(tài)監(jiān)測在急性髓系白血病治療中的應(yīng)用標(biāo)本來自1998年3月至2005年10月中國醫(yī)科大學(xué)和沈陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科門診及住院治療的125例AML患者。所有患者均經(jīng)形態(tài)學(xué)及骨髓活檢確診。125例AML患者中男72例，女53例，平均年齡13歲(3個(gè)月-61歲)，按FAB分型為M0 7例、M1 9例、M2 31例、M3 8例、M4 18例、M5 26例、M6/7 10例和M7 16例。對初診時(shí)具有FLT3基因表達(dá)陽性的87例患者分別在初診、完全緩解及緩解后3個(gè)月、6個(gè)月各取骨髓或外周血標(biāo)本1次，以進(jìn)行FLT3基因動(dòng)態(tài)檢測。對照組為同期就診的非白血病(淋巴瘤、過敏性紫癜、免疫性血小板減少性紫癜）患者及健康供者，男、女各10名，平均年齡18(9-57)歲。 治療方案及療效標(biāo)準(zhǔn) 采用標(biāo)準(zhǔn)的DA (柔紅霉素+阿糖胞苷) 、HA (高三尖杉酯堿+阿糖胞苷)方案誘導(dǎo)緩解，難治、復(fù)發(fā)患者則采用米托蒽醌或去甲氧柔紅霉素或安吖啶+阿糖胞苷誘導(dǎo)緩解，對于隨后相繼以原方案及中等劑量阿糖胞苷鞏固強(qiáng)化治療。對于M3患者則采用全反式維甲酸誘導(dǎo)分化達(dá)完全緩解后，給予AML方案鞏固強(qiáng)化治療。62例患者在完全緩解后行親緣或非親緣供者alloBMT。療效判斷標(biāo)準(zhǔn)按照張之南主編的血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)3。 基因組DNA的提取 對患者骨髓或健康志愿者外周血標(biāo)本采用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，用傳統(tǒng)酚/氯仿/異丙醇法抽提DNA。核酸蛋白測定儀測定吸光度值為2.37-2.69，調(diào)整DNA濃度為200 ng/l。 -70保存?zhèn)溆谩?PCR引物及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 針對FLT3基因內(nèi)部重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)主要發(fā)生在11號外顯子4，在11號外顯子近端和遠(yuǎn)端分別設(shè)計(jì)引物11F和11R，擴(kuò)增產(chǎn)物為大小133 bp 。同時(shí)設(shè)計(jì)對照組actin引物actin F和actin R，擴(kuò)增產(chǎn)物為305 bp。以上引物均由寶生物制品公司合成，引物序列為： 11F： 5CAATTTAGGTATGAAAGCC3； 11R： 5CAAACTCTAAATTTTCTCT3 ； actin F：5CTTCTACAATGAGCTGCGTG3； actin R：5TCATGAGGTAGTCAGTCAGG3 PCR反應(yīng)體系50 l , 包括上、下游引物各0.2 mol/L, dNTPs 0.25 mmol/L, Taq DNA 聚合酶2.5 U, 模板DNA 200 ng。反應(yīng)條件為94變性3分鐘后，94 1分鐘, 60 1分鐘, 72 1分鐘，35個(gè)循環(huán)，最后72延伸10分鐘。取PCR 產(chǎn)物13 l，加溴化乙錠2 l，于2%瓊脂糖凝膠上電泳20分鐘， pBR322 (Hind )作為標(biāo)志物，用紫外投射儀分析圖像并照相。用QIA quick Gel Extraction試劑盒(Qiagen公司產(chǎn)品)回收純化PCR產(chǎn)物，由中國刑警學(xué)院法醫(yī)系測序。所得序列資料在線使用Blast進(jìn)行同源性比對分析。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 患者全部資料包括返院復(fù)查或信訪資料輸入計(jì)算機(jī)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件生命表法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié) 果 PCR檢測FLT3基因的靈敏性 取FLT3基因表達(dá)陽性的AML患者的樣本1 g，按110連續(xù)稀釋DNA，然后行PCR擴(kuò)增，確定本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增FLT3的靈敏度為10-5以上(總DNA 1 g時(shí)設(shè)為1)，即100 pg (結(jié)果未顯示)。 FLT3基因在AML初診患者中的表達(dá) FLT3基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳，在133 bp位置出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶。結(jié)果顯示，125例患者中87例呈FLT3基因表達(dá)陽性，占69.6%（表1）。 DNA測序及Blast比對分析結(jié)果證實(shí)， 在FLT3陽性標(biāo)本均未見重復(fù)序列、點(diǎn)突變及插入（結(jié)果未顯示）。 AML治療后FLT3基因表達(dá)情況 治療前FLT3基因表達(dá)陽性的87例AML患者，經(jīng)DA或HA標(biāo)準(zhǔn)化療1-2個(gè)療程或維甲酸誘導(dǎo)(M4)治療2個(gè)月后，49例達(dá)完全緩解（CR），其中22例FLT3表達(dá)減弱，占44.90%；24例FLT3轉(zhuǎn)為陰性，占48.98%；3例無改變，占6.12%。隨訪3-18個(gè)月，16例復(fù)發(fā)者FLT3基因表達(dá)轉(zhuǎn)為陽性，2例在臨床復(fù)發(fā)前1-2個(gè)月FLT3已呈陽性表達(dá)。38例未獲緩解者，F(xiàn)LT3持續(xù)陽性。而38例治療前FLT3陰性患者，經(jīng)同樣方案治療后33例達(dá)到CR；隨訪3-18個(gè)月后2例復(fù)發(fā)，F(xiàn)LT3基因表達(dá)轉(zhuǎn)為陽性。此結(jié)果表明FLT3與AML發(fā)病及疾病狀態(tài)有關(guān)，同時(shí)也反映出FLT3基因表達(dá)與MRD有關(guān)。 FLT3基因表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 治療前FLT3基因表達(dá)陽性的87例AML患者經(jīng)2個(gè)月治療，49例達(dá)CR，完全緩解(CR)率為56.32%，低于FLT3基因表達(dá)陰性組的86.84%(33/38)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示兩者有顯著性差異(p<0.05)。49例獲CR的FLT3基因表達(dá)陽性AML患者在緩解期有25例仍可檢測出FLT3基因，此25例雖經(jīng)正規(guī)定期強(qiáng)化治療及親緣或非親緣供者alloBMT，但均于1年內(nèi)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)時(shí)間平均6.5個(gè)月(2-11個(gè)月)，復(fù)發(fā)率為58.93%。而24例獲CR的FLT3基因表達(dá)陰性AML患者，在CR后1年內(nèi)復(fù)發(fā)率為25.0% (6/24)，F(xiàn)LT3基因表達(dá)陽性AML患者CR后1年內(nèi)復(fù)發(fā)率顯著高于FLT3基因表達(dá)陰性患者(p<0.05)（表2）。 討 論 人FLT3基因定位于染色體13q12，是型酪氨酸激酶受體(RTKm)成員之一。FLT3與配體結(jié)合后，發(fā)生同源二聚化，使激酶區(qū)接近酪氨酸殘基自主磷酸化，引起Ras和STAT5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，從而轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞分裂信號。正常情況下，F(xiàn)LT3基因存在于早期造血組織，與造血細(xì)胞的生長、增殖、凋亡有關(guān)5。FLT3基因發(fā)生突變，可破壞正常血細(xì)胞的增殖分化與凋亡，是AML中突變率最高且與預(yù)后相關(guān)的重要因子6。本研究采用PCR技術(shù)檢測了125例AML患者中FLT3基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)陽性率69.6%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致56，提示FLT3基因在大多數(shù)AML中表達(dá)陽性。目前化療及造血干細(xì)胞移植是治療AML的主要方法，MRD是治療后復(fù)發(fā)的主要原因之一，測定MRD是指導(dǎo)緩解后治療及判斷預(yù)后的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，在大多數(shù)AML患者中FLT3基因表達(dá)陽性，因此FLT3可作為檢測AML殘留白血病的一個(gè)重要標(biāo)志。 隨著急性白血病化療方案的改善和造血干細(xì)胞移植的進(jìn)展，急性白血病的完全緩解(CR)率明顯提高。然而仍有許多CR患者在數(shù)年內(nèi)復(fù)發(fā)，其主要原因是血液學(xué)CR后體內(nèi)仍殘留106-109白血病細(xì)胞，稱為微小殘留病(MRD)。現(xiàn)在普遍認(rèn)為MRD是血液學(xué)CR乃至持續(xù)完全緩解(CCR)期間白血病復(fù)發(fā)的根源7。目前檢測MRD 的方法主要有3種：熒光原位雜交、PCR 和流式細(xì)胞術(shù)，其中以PCR 法最敏感，臨床應(yīng)用最廣。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道靈敏度可高達(dá)106-107水平，比染色體技術(shù)更加靈敏8。在本實(shí)驗(yàn)中我們利用PCR技術(shù)探索了FLT3基因的最低檢出值，結(jié)果顯示樣本中提取的DNA稀釋至100 pg時(shí)仍可以檢測到FLT3基因表達(dá)，說明PCR方法可以檢出白血病患者FLT3基因，用于AML患者CR后MRD的檢測。 我們用FLT3基因作為AML的分子標(biāo)志，通過PCR技術(shù)跟蹤了AML完全緩解后的MRD，結(jié)果表明： 治療前FLT3陽性AML患者，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療后，低于半數(shù)的患者達(dá)到完全緩解（CR），其中絕大部分患者FLT3基因表達(dá)減弱或轉(zhuǎn)為陰性；隨訪3-18個(gè)月，復(fù)發(fā)者FLT3基因表達(dá)轉(zhuǎn)為陽性，此結(jié)果表明FLT3基因表達(dá)與AML發(fā)病及疾病狀態(tài)有關(guān)，同時(shí)也反映出FLT3基因表達(dá)與MRD有關(guān)。FLT3基因表達(dá)陽性AML患者治療后，完全緩解(CR)率低于FLT3基因表達(dá)陰性的患者；另外FLT3基因表達(dá)陽性AML患者在緩解期仍可檢測出FLT3基因，且均于1年內(nèi)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率顯著高于FLT3基因表達(dá)陰性患者,表明FLT3基因表達(dá)與預(yù)后有關(guān)。AML患者達(dá)CR后均需要鞏固強(qiáng)化治療,以消除MRD。AML患者達(dá)CR后FLT3基因表達(dá)持續(xù)陽性或轉(zhuǎn)陰后再次出現(xiàn)陽性，提示將發(fā)生復(fù)發(fā)，此結(jié)果表明FLT3基因能提前預(yù)示AML復(fù)發(fā)。 FLT3轉(zhuǎn)為陰性或長期持續(xù)陰性者預(yù)示能獲得長期無病生存。 所以,在完全緩解期追蹤檢測FLT3基因并分析其變化極為重要, 該基因持續(xù)陽性或由陰性變?yōu)殛栃?其復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)度是明顯增高的,這對及時(shí)調(diào)整化療方案、預(yù)防復(fù)發(fā)有著重要的臨床意義。【參考文獻(xiàn)】 1Kerst G, Kreyenberg H, Roth C, et al. 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