微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)(2014上課).ppt

到目前為止， 幾十項(xiàng)Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，化學(xué)獎(jiǎng) 都與微生物學(xué)有關(guān),微生物的類群,原生生物：,原核生物:,真菌:,病毒:,如酵母菌,單細(xì)胞的動(dòng)植物,如草履蟲、單細(xì)胞藻類等,無細(xì)胞結(jié)構(gòu),細(xì)菌、藍(lán)藻,原核細(xì)胞,課題1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),專題2 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,1.提供營養(yǎng)和條件,2.防止污染,一.培養(yǎng)基：,微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì),1.基本成分：,思考：微生物“吃”什么？,碳源、氮源、水、無機(jī)鹽,碳源,無機(jī)碳源：,有機(jī)碳源：,CO2、CO32-、HCO3-,牛肉膏、蛋白胨等,自養(yǎng)微生物,異養(yǎng)微生物,氮源,無機(jī)氮源：,有機(jī)氮源：,NH4、NO3-（為硝化細(xì)菌提供N源和能源）,牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等,注：含CHON的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源,一.培養(yǎng)基：,微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì),1.基本成分：,碳源、氮源、水、無機(jī)鹽,2.特殊營養(yǎng)：,維生素、堿基等（生長因子）,（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）,3.pH、氧氣的需求：,4.種類：,固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,有無 凝固劑瓊脂,分離 鑒定,工業(yè) 生產(chǎn),化學(xué)成分：,物理性質(zhì)：,天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。,分析營養(yǎng)構(gòu)成？,5. 配制原則,目的明確：,營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當(dāng),適宜的pH值：,有機(jī)碳源,異養(yǎng)型：,根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的選擇原料,自養(yǎng)型：,不加碳源,加入緩沖劑,細(xì)菌偏堿，真菌偏酸,（CO2碳源）,耐高溫需保持干燥的 物品，160170 12小時(shí),接種環(huán)、接種針等 金屬用具,7075、30min 80、15min,100、56min,較為溫和理化方法，,殺死部分有害菌體,（不包括芽孢、孢子）,強(qiáng)烈的理化方法，,殺死所有微生物,（包括芽孢、孢子）,煮沸消毒法,巴氏消毒法,化學(xué)藥劑,紫外線,灼燒滅菌,干熱滅菌,酒精、氯氣、石炭酸等,高壓蒸汽滅菌,培養(yǎng)基， 100KPa、 121、1530min,二.無菌技術(shù)：,防止外來雜菌的污染,1.消毒與滅菌：,請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。 （1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 （2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管 （3） 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手,思考,2.無菌范圍：,實(shí)驗(yàn)操作空間消毒,操作者的手、衣著消毒,實(shí)驗(yàn)用具滅菌,實(shí)驗(yàn)操作過程,酒精燈旁操作,超凈工作臺(tái),芽孢,有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌,孢子,細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的生殖細(xì)胞。能直接發(fā)育成新個(gè)體。,單個(gè) 或少數(shù)菌體,2.特征：,大小、形狀、光澤度、 顏色、透明度等。,3.功能：,1.定義：,菌落,鑒定菌種的重要依據(jù),固體培養(yǎng)基上,大量繁殖,子細(xì)胞群體,三.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：,制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基,1.計(jì)算：,培養(yǎng)基用量,依配方計(jì)算各成分的用量,2.稱量：,3.溶化：,牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取,牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋,牛肉膏、稱量紙 、少量水加熱溶解,取紙,蛋白胨、NaCl,瓊脂,補(bǔ)水定容,4.調(diào)pH、分裝、封口：,5.滅菌：,6.倒平板：,培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿,分散成單個(gè)細(xì)胞,形成單個(gè)菌落,倒平板,約50,防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染,灼燒滅菌， 防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基,1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？,問題討論,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？,答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？,答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。,二.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：,制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基,純化大腸桿菌：,平板劃線法：,菌種,劃3個(gè)平板,1個(gè)不劃線,1.純化大腸桿菌的方法：平板劃線法和稀釋涂布平板法,接種環(huán),防止劃破培養(yǎng)基,（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）,（空白對(duì)照）,平板劃線法,平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體。,問題討論,1、為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物,殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時(shí)，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。,及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。,6支試管，分別加入9ml無菌水,101,102,103,104,105,106,稀釋涂布平板法：,a.梯度稀釋菌液：,菌液,微量 移液器,浸,稀釋涂布平板法：,a.梯度稀釋菌液：,b.涂布平板：,不超過0.1ml,各梯度分別涂布3個(gè)平板,1個(gè)不涂布作空白對(duì)照,滴,灼,涂,稀釋涂布法,稀釋涂布法是將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。,問題討論,涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？,應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。 例如：酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、 吸管頭不要接觸任何其他物體、 吸管要在酒精燈火焰周圍等等。,3平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較,平板劃線法：,稀釋涂布平板法：,2.培養(yǎng)：,將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基,放入37恒溫箱中培養(yǎng)12h24h后，,觀察并記錄,（三）菌種的保藏：,1.臨時(shí)保藏：,試管固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)長成菌落,4冰箱保存,2.長期保存：,菌種易被污染、變異,甘油管藏,1ml甘油（滅菌）1ml菌液,20,擱置斜面,四、課題成果評(píng)價(jià),（一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 （二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。 （三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同，及時(shí)觀察記錄的同學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培