GB5009.198-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)貝類中失憶性貝類毒素的測定.pdf

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 6食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)貝類中失憶性貝類毒素的測定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實(shí)施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)國 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B/T5 0 0 9.1 9 82 0 0 3 貝類 記憶喪失性貝類毒素軟骨藻酸的測定 、S N/T1 0 7 02 0 0 2 進(jìn)出口貝類中記憶喪失性貝類毒素檢驗(yàn)方法 、S N/T1 8 6 72 0 0 7 進(jìn)出口貝類中軟骨藻酸的檢測方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 、S N/T2 6 6 32 0 1 0 貝類中失憶性貝類毒素檢驗(yàn)方法 酶聯(lián)免疫吸附法 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B/T5 0 0 9.1 9 82 0 0 3相比, 主要變化如下: 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“ 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 貝類中失憶性貝類毒素的測定”; 修改了固相萃取條件; 改變了流動(dòng)相; 增加了酶聯(lián)免疫吸附法; 增加了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 61 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)貝類中失憶性貝類毒素的測定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了貝類中失憶性貝類毒素測定的酶聯(lián)免疫吸附法、 液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。本標(biāo)準(zhǔn)中酶聯(lián)免疫吸附法適用于貝類及其制品中失憶性貝類毒素的測定, 液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法適用于貝類及其制品( 不包括鹽漬制品) 中失憶性貝類毒素軟骨藻酸(D A) 的測定。酶聯(lián)免疫吸附法2 原理本方法測定基礎(chǔ)是競爭性酶聯(lián)免疫反應(yīng), 酶標(biāo)板上包被有針對軟骨藻酸抗體的捕捉抗體, 加入抗軟骨藻酸抗體、 標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液及軟骨藻酸酶標(biāo)記物, 游離的失憶性貝類毒素與軟骨藻酸酶標(biāo)記物競爭軟骨藻酸抗體, 同時(shí)軟骨藻酸抗體與捕捉抗體連接。沒有結(jié)合的酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質(zhì)和顯色劑加入到微孔中并且孵育。結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在4 5 0n m測量微孔溶液的吸光度值, 試樣中失憶性貝類毒素的含量與吸光度值成反比, 按繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計(jì)算。3 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。3.1 試劑3.1.1 甲醇(CH3OH) 。3.1.2 十二水合磷酸氫二鈉(N a2H P O41 2 H2O) 。3.1.3 氯化鈉(N a C l) 。3.1.4 氯化鉀(K C l) 。3.1.5 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。3.1.6 吐溫- 2 0(C5 8H1 1 4O2 6) 。3.1.7 抗D A抗體。3.1.8 牛血清白蛋白(B S A) 。3.1.9 D A酶標(biāo)記物。3.1.1 0 過氧化氫(H2O2) 。3.1.1 1 3,3,5,5 -四甲基聯(lián)苯胺(TMB,C1 6H2 0N2) 。3.1.1 2 硫酸(H2S O4) 。G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 62 3.2 試劑配制3.2.1 P B S溶液(p H 7.4) : 分別稱取磷酸二氫鉀0.2 0g、 十二水合磷酸氫二鈉2.9 0g、 氯化鈉8.0 0g、 氯化鉀0.2 0g, 加水溶解并定容至10 0 0m L。3.2.2 抗體稀釋液: 稱取1.0gB S A, 加P B S溶液(p H 7.4) 溶解并定容至10 0 0m L。3.2.3 抗D A抗體工作液: 抗D A抗體用抗體稀釋液稀釋至工作濃度。3.2.4 D A酶標(biāo)記物工作液: 用抗體稀釋液將D A酶標(biāo)記物稀釋至工作濃度。3.2.5 洗脫液: 吸取0.5m L吐溫- 2 0, 用P B S溶液(p H 7.4) 稀釋至10 0 0m L。3.2.6 硫酸溶液(6m o l/L) : 吸取3 1 9.2m L硫酸, 緩緩加至6 0 0m L水中, 并用水稀釋至10 0 0m L。3.3 標(biāo)準(zhǔn)品軟骨藻酸(D A,C1 5H2 1NO6,C A S號1 4 2 7 7 - 9 7 - 5) 標(biāo)準(zhǔn)溶液。3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制D A標(biāo)準(zhǔn)系列工作液: 準(zhǔn)確吸取適量D A標(biāo)準(zhǔn)溶液用P B S溶液稀釋并定容, 配制成質(zhì)量濃度分別為0n g/m L、0.5n g/m L、1.0n g/m L、2.0n g/m L、5.0n g/m L和1 0.0n g/m L的D A標(biāo)準(zhǔn)系列工作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。3.5 材料3.5.1 包被有D A捕捉抗體的微孔板。注:商業(yè)化試劑盒若評價(jià)技術(shù)參數(shù)達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的要求則也適合于本標(biāo)準(zhǔn), 參見附錄A。3.5.2 水相微孔濾膜:0.4 5m。4 儀器和設(shè)備4.1 酶標(biāo)儀。4.2 天平: 感量為0.0 1g。4.3 均質(zhì)器。4.4 離心機(jī): 轉(zhuǎn)速60 0 0r/m i n。5 分析步驟5.1 樣品采集至少采集1 0個(gè)貝類樣品, 并使貝肉達(dá)2 0 0g以上。冷凍樣品置于保溫盒中冷凍送檢, 或保證其處于低溫狀態(tài)(01 0) 送檢。如為帶殼樣品, 應(yīng)開殼, 去除水分后冷凍送檢。5.2 試樣制備5.2.1 生鮮帶殼樣品用清水將貝類樣品外表徹底洗凈, 切斷閉殼肌, 開殼, 用水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來物。將閉殼肌和連接在膠合部的組織分開, 取出貝肉, 切勿割破肉體。開殼前不要加熱或用麻醉劑。收集1 0 0g貝肉置于孔徑約2mm的金屬篩網(wǎng)上, 瀝水5m i n, 檢出碎殼等雜物, 將貝肉均質(zhì), 備用。G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 63 5.2.2 冷凍樣品在室溫下, 使冷凍樣品呈半冷凍狀態(tài)。帶殼冷凍樣品, 按5.2.1方法清洗、 開殼、 淋洗取肉, 除去貝肉外部附著的冰片, 抹去水分, 室溫緩化。將1 0 0g解凍的貝肉均質(zhì), 備用。5.2.3 貝類罐頭將貝類罐頭內(nèi)容物瀝干水分, 充分均質(zhì), 備用。5.2.4 貝肉干制品稱取1 0 0g貝肉干制品放入一定量水中浸泡2 4h4 8h(4冷藏) , 瀝干、 均質(zhì)、 備用。5.2.5 鹽漬制品用清水洗滌, 流水脫鹽, 瀝干, 均質(zhì), 備用。5.3 試樣提取稱取1 0g( 精確至0.0 1g) 試樣, 加入1 0m L水, 渦旋振蕩1m i n, 加入2 0m L甲醇, 渦旋振蕩1m i n,60 0 0r/m i n離心1 0m i n, 移取上清液, 用0.4 5m的水相微孔濾膜過濾, 得到試樣提取液, 用P B S溶液(p H 7.4) 稀釋1 0 0倍, 得到試樣稀釋液。吸取5 0L試樣稀釋液進(jìn)行測定。5.4 測定將已包被捕捉抗體的微孔條插入微孔架并做好標(biāo)記, 其中包括空白對照孔、 標(biāo)準(zhǔn)液孔和樣液孔, 分別做平行孔。向空白對照孔加入1 5 0LP B S溶液(p H 7.4) , 向標(biāo)準(zhǔn)液孔加入5 0L失憶性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液, 向樣液孔加入5 0L樣液。向上述所有微孔中加入1 0 0L D A酶標(biāo)記物工作液, 輕輕混合, 再加入1 0 0L D A抗體工作液, 迅速充分混合1m i n, 用粘膠紙封住微孔以防溶液揮發(fā),4 孵育2h。孵育結(jié)束后, 倒去孔中液體, 每個(gè)微孔注入3 0 0L洗脫液沖洗, 翻轉(zhuǎn)微孔板, 傾去孔內(nèi)液體, 再重復(fù)以上洗板操作2次, 在吸水紙上拍干。每孔加1 5 0L過氧化氫和TMB充分混合, 室溫避光孵育3 0m i n。每孔加入5 0L硫酸溶液(6m o l/L) 迅速混勻, 終止反應(yīng), 在3 0m i n內(nèi)測量并記錄4 5 0n m波長下的吸光度值。若試樣稀釋液經(jīng)測定超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍, 可擴(kuò)大稀釋倍數(shù)后重新進(jìn)行測定。5.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以失憶性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的質(zhì)量濃度的以1 0為底的對數(shù)值為橫坐標(biāo), 以按式(1) 計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)液的百分比吸光度值為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。失憶性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)液( 或樣液) 的百分比吸光度值按式(1) 計(jì)算:A=S-S1S0-S11 0 0%(1) 式中:A 百分比吸光度值;S 失憶性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液或樣液的平均吸光度值;S1 空白對照孔的平均吸光度值;S0 0g/L的失憶性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液的平均吸光度值。6 分析結(jié)果的表述試樣中失憶貝類毒素的含量按式(2) 計(jì)算:G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 64 X=Vfm(2) 式中:X 試樣中失憶性貝類毒素的含量, 單位為微克每克(g/g) ; 由標(biāo)準(zhǔn)曲 線 得 到 的 試 樣 待 測 液 中 失 憶 性 貝 類 毒 素 的 質(zhì) 量 濃 度, 單 位 為 納 克 每 毫 升(n g/m L) ;V 試樣提取液的體積, 單位為毫升(m L) ;f 稀釋倍數(shù);m 試樣的稱樣量, 單位為克(g) 。當(dāng)測定值2 0g/g時(shí), 則報(bào)告失憶性貝類毒素含量5 0%2 0%5 0%1 0%2 0%1 0%允許的相對偏差2 0%2 5%3 0%5 0%1 9 分析結(jié)果的表述試樣中軟骨藻酸的含量按式(4) 計(jì)算:X=Vm10 0 0(4) 式中:X 試樣中軟骨藻酸的含量, 單位為微克每克(g/g) ; 由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中軟骨藻酸的質(zhì)量濃度, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;V 洗脫液的定容體積, 單位為毫升(m L) ;m 與洗脫液相當(dāng)?shù)脑嚇淤|(zhì)量, 單位為克(g) ;10 0 0 換算因子。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。計(jì)算結(jié)果應(yīng)扣除空白值。2 0 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的1 5%。2 1 其他本方法的檢出限為0.0 0 5g/g, 定量限為0.0 2g/g。G B5 0 0 9.1 9 82 0 1 61 1 附 錄 A商業(yè)化試劑盒評價(jià)技術(shù)參數(shù)A.1 定量限定量限為1g/g。A.2 回收率回收率為8 5%9 0%。A.3 重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)品變異系數(shù)1 0%, 樣品變異系數(shù)1 5%。A.4 交叉反應(yīng)率檢測D A交叉反應(yīng)率達(dá)到1 0 0%。與S T X、OA、P b T x - 2 等