GB5009.206-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中河豚毒素的測定.pdf

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B5 0 0 9.2 0 62 0 1 6食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中河豚毒素的測定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會國 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B5 0 0 9.2 0 62 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B/T2 3 2 1 72 0 0 8 水產(chǎn)品中河豚毒素的測定 液相色譜-熒光檢測法 、G B/T5 0 0 9 .2 0 62 0 0 7 鮮河豚魚中河豚毒素的測定 和S N/T1 5 6 9.22 0 1 3 出口河豚魚中河豚毒素檢測方法 第2部分: 小鼠生物法 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B/T5 0 0 9.2 0 62 0 0 7相比, 主要變化如下: 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“ 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中河豚毒素的測定” ; 增加了凈化步驟; 修改了酶聯(lián)免疫吸附法。G B5 0 0 9.2 0 62 0 1 61 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中河豚毒素的測定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)品中河豚毒素的測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于河豚魚肌肉、 肝臟、 皮膚和性腺組織中河豚毒素的測定。第二法適用于河豚魚肌肉、 肝臟、 皮膚和性腺組織中河豚毒素的測定。第三法適用于河豚魚、 織紋螺、 蝦、 牡蠣、 花蛤和魷魚中河豚毒素的測定。第四法適用于河豚魚肌肉、 肝臟、 皮膚和性腺組織中河豚毒素的測定。第一法 小鼠生物法2 原理根據(jù)河豚毒素易溶于酸性溶液原理, 試樣制備后經(jīng)兩次乙酸溶液(0.5%) 煮沸提取,2 00 0 0g離心收集上清液, 將兩次上清液合并定容至2 5m L, 用于小鼠生物試驗。根據(jù)小鼠注射試樣提取液后的死亡時間, 查出鼠單位, 并按小鼠體重校正鼠單位, 計算確定河豚毒素含量。3 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 實驗用水為G B6 6 8 2規(guī)定的三級水。3.1 試劑3.1.1 冰乙酸(CH3C OOH) 。3.1.2 氫氧化鈉(N a OH) 。3.2 試劑配制3.2.1 乙酸溶液(0.5%) : 將5m L冰乙酸用水稀釋至1L。3.2.2 氫氧化鈉溶液(1m o l/L) : 將4 0g氫氧化鈉用水溶解并定容至10 0 0m L。3.3 標(biāo)準(zhǔn)品河豚毒素(C1 1H1 7N3O8,C A S號:4 3 6 8 - 2 8 - 9) , 純度9 8%, 或經(jīng)國家認證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3.4 實驗動物小白鼠: 體重1 9.0g 2 1.0g, 無特定病原體級(S P F) 昆明系雄性健康小鼠。4 儀器和設(shè)備4.1 均質(zhì)器:1 20 0 0r/m i n。G B5 0 0 9.2 0 62 0 1 62 4.2 電子天平: 感量0.1g。4.3 離心機: 離心力3 00 0 0g。4.4 秒表。5 分析步驟注:為避免毒素的危害, 應(yīng)戴手套進行檢驗操作。移液器吸頭等用過的器材、 廢棄的提取液等應(yīng)在氫氧化鈉溶液(1m o l/L) 中浸泡1h以上, 以使毒素分解。5.1 試樣制備5.1.1 冷凍河豚魚樣品將樣品裝于密封塑料袋內(nèi)于自來水水流下快速解凍。解凍后用水洗凈, 用濾紙吸干, 分解成肌肉、肝臟、 皮膚等部分。分別稱量后將各組織剪碎, 充分均質(zhì)。5.1.2 新鮮河豚魚樣品將樣品用水洗凈后用濾紙吸干, 分解成肌肉、 肝臟、 皮膚等部分, 分別稱量后將各組織剪碎, 充分均質(zhì)。5.2 試樣提取5.2.1 肌肉組織試樣準(zhǔn)確稱取試樣1 0g( 精確至0.1g) 于5 0m L離心管中, 加入乙酸溶液(0.5%)1 1m L, 充分混勻, 沸水浴中煮沸1 0m i n, 不斷攪拌以防止組織結(jié)塊。冷卻至室溫,2 00 0 0g高速離心2 0m i n, 移取上清液于2 5m L容量瓶中。向沉淀中加入乙酸溶液(0.5%)1 1m L, 充分混勻, 沸水浴中煮沸5m i n, 不斷攪拌以防止組織結(jié)塊。冷卻至室溫,2 00 0 0g高速離心2 0m i n, 移取上清液。合并上清液, 混勻, 用乙酸溶液(0.5%) 定容至2 5m L。此提取液1m L相當(dāng)于0.4g試樣。5.2.2 肝臟組織試樣準(zhǔn)確稱取1 0g( 精確至0.1g) 試樣于5 0m L離心管中, 加入乙酸溶液(0.5%)8m L, 充分混勻, 室溫下2 00 0 0g高速離心2 0m i n, 移取上清液于2 5m L容量瓶中。用8m L乙酸溶液(0.5%) 重復(fù)提取1次。合并上清液, 混勻, 用乙酸溶液(0.5%) 定容至2 5m L。此提取液1m L相當(dāng)于0.4g試樣。5.2.3 皮膚組織試樣準(zhǔn)確稱取1 0g( 精確至0.1g) 試樣于5 0m L離心管中, 加入乙酸溶液(0.5%)1 1m L, 充分混勻, 室溫下2 00 0 0g高速離心2 0m i n, 移取上清液于2 5m L容量瓶中。用1 1m L乙酸溶液(0.5%) 重復(fù)提取1次。合并上清液, 用乙酸溶液(0.5%) 定容至2 5m L。此提取液1m L相當(dāng)于0.4g試樣。注1:試樣制備時, 冷凍樣品需在半解凍狀態(tài)下進行操作。試樣若不能及時檢驗, 應(yīng)于4保存, 在2 4h內(nèi)檢驗。注2:如果河豚魚樣品的臟器或者組織不足1 0g的情況下, 按照以上方法進行提取操作, 需適量減少乙酸溶液(0.5%) 的加入量。注3:提取液中應(yīng)不含有離心分離液表面上被分離出來的油狀物、 膠狀物或者脂質(zhì)類。5.3 小鼠試驗選取1 9.0g 2 1.0g的無特定病原體級(S P F) 昆明系雄性健康小鼠6只, 稱量并記錄體重。隨機分G B5 0 0 9.2 0 62 0 1 63 為實驗組和空白對照組兩組, 每組3只。對每只試驗小鼠腹腔注射1 m L試樣提取液或乙酸溶液(0.5%) ( 空白對照液) 。若注射過程中注射液溢出, 須將該只小鼠丟棄, 并重新注射一只小鼠。記錄注射開始和完畢時間, 仔細觀察并記錄小鼠停止呼吸時的死亡時間( 到小鼠呼出最后一口氣止) 。若注射試樣提取液后, 小鼠死亡時間小于7m i n, 則按附錄A中表A.1計算出1m L試樣提取液的毒力, 以此為基準(zhǔn), 配制出使小鼠在7m i n1 3m i n死亡所需的稀釋液, 采用乙酸溶液(0.5%) 進行稀釋, 將稀釋液再注射至少3只小鼠以確定試樣的毒力。具體示例見附錄B。若注射試樣溶液后, 小鼠的死亡時間大于或等于7m i n, 則直接根據(jù)中位數(shù)致死時間確定試樣的毒力。小鼠中毒死亡癥狀: 被注射了河豚毒素的小鼠初期安靜, 隨后出現(xiàn)呼吸困難, 急促, 腹部收縮加快,反應(yīng)遲鈍, 繼而出現(xiàn)突然疾走, 急跑急跳, 四處亂竄, 東倒西歪, 翻轉(zhuǎn)亂跳等掙扎動作, 數(shù)十秒后, 小鼠后腿劇烈抽搐,23次后爬臥不動, 腹部呼吸逐漸微弱減慢, 最后死亡。以停止呼吸作為判斷死亡的標(biāo)準(zhǔn)。6 分析結(jié)果的表述6.1 毒力的計算根據(jù)小鼠試驗中得到的小鼠致死時間, 計算出中位數(shù)致死時間, 然后按表A.1計算出毒力( 若中位數(shù)致死時間剛好處于表A.1中給出的兩時間中間時, 則取兩時間中較大的時間值; 若介于表A.1中給出的兩時間中但不正好處于中間時, 則取更接近于中位數(shù)致死時間的時間值) 。若小鼠體重不正好為2 0.0g, 則按表A.2對鼠單位(MU) 進行校正, 通過校正后的鼠單位表示出提取液的毒力。1MU的定義為使體重為2 0.0g的無特定病原體級(S P F) 昆明系雄性小鼠3 0m i n死亡的毒力, 相當(dāng)于0.1 8g河豚毒素。試樣中河豚毒素的含量按式(1) 計算:X=MEfW(1) 式中:X 試樣中河豚毒素的含量, 單位為鼠單位每克(MU/g) ;M 1m L注射液的鼠單位數(shù), 單位為鼠單位(MU) ;E 提取系數(shù), 本方法提取系數(shù)為3.1 1;f 試樣提取液的稀釋倍數(shù);W 小鼠體重校正系數(shù)。6.2 結(jié)果報告在空白對照組小鼠正常的情況下, 河豚魚各組織中河豚毒素含量進行如下判斷和表述:若小鼠的死亡時間大于3 0m i n, 結(jié)果報告為5 0%2 0%5 0%1 0%2 0%1 0%允許的相對偏差2 0%2 5%3 0%5 0%1 1.8 空白實驗除不加試樣外, 均按上述測定步驟進行。1 2 分析結(jié)果的表述試樣中河豚毒素的含量按式(2) 計算:X=cVfm(2) 式中:X 試樣中河豚毒素的含量, 單位為微克每千克(g/k g) ;c 試樣待測液中河豚毒素的濃度, 單位為微克每升(g/L) ;V 定容體積, 單位為毫升(m L) ;f 試液稀釋倍數(shù), 按照1 1.2進行試樣前處理時為5;m 試樣的稱樣量, 單位為克(g) 。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。1 3 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的1 5%。1 4 其他本方法的檢出限為1g/k g, 定量限為3g/k g。第三法 液相色譜-熒光檢測法1 5 原理采用酸性甲醇溶液提取試樣中的河豚毒素, 提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干, 用2m L乙酸溶液(1%) 溶解殘渣, 再用磷酸鹽緩沖溶液復(fù)溶, 調(diào)p H至6.07.0, 經(jīng)免疫親和柱凈化, 液相色譜-柱后衍生熒光法測G B5 0 0 9.2 0 62 0 1 68 定, 以保留時間定性, 外標(biāo)法定量。1 6 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 實驗用水為G B6 6 8 2規(guī)定的一級水。1 6.1 試劑1 6.1.1 甲醇(CH3OH) : 色譜純。1 6.1.2 甲酸(CHOOH) : 色譜純。1 6.1.3 乙腈(CH3C N) : 色譜純。1 6.1.4 冰乙酸(CH3C OOH) : 色譜純。1 6.1.5 乙酸銨(CH3C OONH4) : 色譜純。1 6.1.6 十二水合磷酸氫二鈉(N a2H P O41 2 H2O) 。1 6.1.7 二水合磷酸二氫鈉(N a H2P O42 H2O) 。1 6.1.8 氯化鈉(N a C l) 。1 6.1.9 氫氧化鈉(N a OH) 。1 6.1.1 0 庚烷磺酸鈉(C7H1 5N a O3S) 。1 6.1.1 1 碳酸鈉(N a2C O3) 。1 6.2 試劑配制1 6.2.1 氫氧化鈉溶液(1m o l/L) : 稱取4 0g氫氧化鈉, 加水溶解稀釋至10 0 0m L。1 6.2.2 磷酸鹽緩沖液(P B S溶液) : 分別稱取6.4 5g十二水合磷酸氫二鈉、1.0 9g二水合磷酸二氫鈉、4.2 5g氯化鈉, 用水溶解并定容至5 0 0m L。1 6.2.3 乙酸-甲醇溶液(1+9 9) : 將冰乙酸和甲醇按1比9 9的體積比混合均勻。1 6.2.4 乙酸-甲醇溶液(2+9 8) : 將冰乙酸和甲醇按2比9 8的體積比混合均勻。1 6.2.5 乙酸銨緩沖液: 稱取4.6g乙酸銨和2.0 2g庚烷磺酸鈉, 加入約7 0 0m L水溶解, 用冰乙酸調(diào)節(jié)p H為5.0, 用水稀釋至1L。1 6.2.6 氫氧化鈉溶液(4m o l/L) : 稱取1 6 0g氫氧化鈉, 用水溶解并稀釋至1L。1 6.2.7 乙酸溶液(1%) : 冰乙酸和水按1比9 9的體積比混合均勻。1 6.3 標(biāo)準(zhǔn)品河豚毒素(C1 1H1 7N3O8,C A S號:4 3 6 8 - 2 8 - 9) , 純度9 8%, 或經(jīng)國家認證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。1 6.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1 6.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 0 0g/m L) : 準(zhǔn)確稱取河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品1 0m g( 精確至0.1m g) , 用少量水溶解。以甲醇定容至1 0 0m L。置于4中可保存一個月。1 6.4.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液: 根據(jù)需要取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液, 以乙酸溶液(1%) 稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。臨用現(xiàn)配。1 6.4.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列工作液: 以空白基質(zhì)溶液配制適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。1 6.5 材料1 6.5.1 河豚毒素免疫親和柱: 柱規(guī)格3m L, 最大柱容量10 0 0n g, 或等效柱。G B5 0 0 9.2 0 62 0 1 69 1 6.5.2 0.2 2m水相微孔濾膜。1 7 儀器和設(shè)備1 7.1 液相色譜儀: 配有熒光檢測器與柱后衍生裝置。1 7.2 電子天平: 感量0.1m g和0.0 1g。1 7.3 組織搗碎機。1 7.4 振蕩器。1 7.5 超聲波發(fā)生器。1 7.6 固相萃取裝置。1 7.7 離心機:80 0 0r/m i n。1 7.8 氮吹儀。1 8 分析步驟注:為避免毒素的危害, 應(yīng)戴手套進行操作。移液器吸頭等用過的器材、 廢棄的提取液等應(yīng)在1m o l/L氫氧化鈉溶液中浸泡1h以上, 以使毒素分解。1 8.1 試樣制備用水清洗魚體表面的污物, 濾紙吸干魚體表面的水分后用剪刀將魚體分解成肌肉、 肝臟、 皮膚和性腺( 精巢或卵巢) 等部分, 各部分組織分別用水洗去血污, 濾紙吸干表面的水分后將各組織剪碎, 充分均質(zhì), 裝入清潔容器內(nèi), 并標(biāo)明標(biāo)記。1 8.2 試樣提取稱取2g( 精確到0.0 1g) 試樣置于5 0m L聚丙烯離心管中, 加入1 0m L乙酸-甲醇溶液(1+9 9) , 振蕩2m i n,6 0水浴超聲提取3 0m i n,45 0 0r/m i n離心5m i n。上清液于6 0旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干, 加入2m L乙酸溶液(1%) 充分溶解殘渣, 轉(zhuǎn)移至1 0m L聚丙烯離心管中, 加入8m LP B S溶液稀釋, 用氫氧化鈉溶液(1m o l/L) 調(diào)節(jié)p H至78, 待凈化。1 8.3 試樣凈化將免疫親和柱回溫至室溫, 去掉親和柱堵頭, 放出柱內(nèi)保存液后, 移入1 0m L待凈化液。凈化液全部流出后, 用1 0m L水淋洗, 適當(dāng)施壓擠干柱內(nèi)液體。用4m L乙酸-甲醇溶液(2+9 8) 洗脫, 收集的洗脫液于5 0氮氣吹干, 用乙酸溶液(1%) 溶解并定容至1m L, 經(jīng)0.2 2m的水相微孔濾膜過濾, 濾液供液相色譜-熒光法分析。1 8.4 儀器參考條件1 8.4.1 液相色譜參考條件液相色譜參考條件列出如下:a) 色譜柱:C1 8柱, 柱長2 5 0mm, 內(nèi)徑4.6mm, 粒徑5m, 或等效柱。b) 流動相: 乙腈-乙酸銨緩沖液(5+9 5, 體積比) 。c) 流速:1.0m L/m i n。d) 柱溫:3 0。e) 檢測波長: 激發(fā)波長3 8 5n m, 發(fā)射波長5 0 5n m。G B5 0 0 9.2 0 62 0 1 61 0 f) 進樣量:4 0L。1 8.4.2 柱后衍生參考條件柱后衍生參考條件列出如下:a) 衍生溶液: 氫氧化鈉(4m o l/L) 。b) 衍生溶液流速:0.5m L/m i n。c) 衍生管溫度:1 1 0。1 8.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入液相色譜中, 測定相應(yīng)的峰面積, 以標(biāo)準(zhǔn)工作液中河豚毒素的濃度為橫坐標(biāo), 以河豚毒素色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖參見圖C.2。1 8.6 試樣溶液的測定將試樣待測液注入液相色譜中, 以保留時間進行定性( 試樣待測液中河豚毒素色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比, 偏差在2.5%之內(nèi)) , 測定相應(yīng)的峰面積, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣待測液中河豚毒素的濃度。1 8.7 空白實驗除不加試樣外, 均按上述測定步驟進行。1 9 分析結(jié)果的表述試樣中河豚毒素的含量按式(3) 計算:X=(C-C0)Vfm(3) 式中:X 試樣中河豚毒素的含量, 單位為微克每千克(g/k g) ;C 試樣待測液中河豚毒素的濃度, 單位為微克每升(g/L) ;C0 空白待測液中河豚毒素的濃度, 單位為微克每升(g/L) ;V 定容體積, 單位為毫升(m L) ;f 稀釋倍數(shù);m 試樣的稱樣量, 單位為克(g) 。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。2 0 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的1 5%。2 1 其他本方法的檢出限為5 0g/k g, 定量限為1 5 0g/k g。G B5 0 0 9.2 0 62 0 1 61 1 第四法 酶聯(lián)免疫吸附法2 2 原理試樣中的河豚毒素經(jīng)提取、 脫脂后與定量的特異性抗體反應(yīng), 多余的游離抗體則與酶標(biāo)板內(nèi)的包被抗原結(jié)合, 然后加入酶標(biāo)二抗與結(jié)合到酶標(biāo)板上的抗體反應(yīng), 加入底物顯色, 與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較測定河豚毒素含量。2 3 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 實驗用水為G B6 6 8 2規(guī)定的一級水。2 3.1 試劑2 3.1.1 抗河豚毒素單克隆抗體。2 3.1.2 牛血清白蛋白(B S A) 。2 3.1.3 包被抗原: 牛血清白蛋白-甲醛-河豚毒素連接物(B S A - HCHO - T T X) ,-2 0保存。2 3.1.4 辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體。2 3.1.5 冰乙酸(CH3C OOH) 。2 3.1.6 氫氧化鈉(N a OH) 。2 3.1.7 乙酸鈉(CH3C OON a) 。2 3.1.8 乙醚(C4H1 0O) 。2 3.1.9 N,N-二甲基甲酰胺(C3H7NO) 。2 3.1.1 0 3,3 ,5,5 -四甲基聯(lián)苯胺(TMB,C1 6H2 0N2) 。2 3.1.1 1 碳酸鈉(N a2C O3) 。2 3.1.1 2 碳酸氫鈉(N a HC O3) 。2 3.1.1 3 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。2 3.1.1 4 十二水合磷酸氫二鈉(N a2H P O41 2 H2O) 。2 3.1.1 5 氯化鈉(N a C l) 。2 3.1.1 6 氯化鉀(K C l) 。2 3.1.1 7 過氧化氫(H2O2) 。2 3.1.1 8 吐溫- 2 0(C5 8H1 1 4O2 6) 。2 3.1.1 9 一水合檸檬酸(C6H8O7H2O) 。2 3.1.2 0 硫酸(H2S O4) 。2 3.2 試劑配制2 3.2.1 乙酸鈉溶液(0.2m o l/L) : 稱取1 6.4 0g乙酸鈉, 加水溶解并定容至10 0 0m L。2 3.2.2 乙酸溶液(0.2m o l/L) : 量取1 1.5m L冰乙酸注入水中, 并定容至10 0 0m L。2 3.2.3 乙酸鹽緩沖液(p H4.0) : 將乙酸鈉溶液(0.2m o l/L) 和乙酸溶液(0.2m o l/L) 按2比8的體積比混合均勻。2 3.2.4 磷酸鹽緩沖液(P B S溶液,p H7.4) : 分別稱取磷酸二氫鉀0.2 0g、 十二水合磷酸氫二鈉2.9 0g、氯化鈉8.0 0g、 氯化鉀0.2 0g, 加水溶解并定容至10 0 0m L。G B5 0 0 9.2 0 62 0 1 61 2 2 3.2.5 包被緩沖液(p H9 .6) : 分別稱取碳酸鈉1 .5 9g和碳酸氫鈉2 .9 3g, 加水溶解并定容至10 0 0m L。2 3.2.6 封閉液: 稱取2.0g B S A, 加P B S溶液溶解并定容至10 0 0m L。2 3.2.7 P B S - T洗液:吸取0.5m L吐溫- 2 0至9 0 0m LP B S溶液中, 并用P B S溶液定容至10 0 0m L。2 3.2.8 抗體稀釋液: 稱取1.0gB S A, 加P B S溶液溶解并定容至10 0 0m L。2 3.2.9 檸檬酸溶液(0.1m o l/L) : 稱取2 1.0 1g一水合檸檬酸, 加水溶解并定容至10 0 0m L。2 3.2.1 0 磷酸氫二鈉溶液(0 .2m o l/L) : 稱取7 1 .6g十二水合磷酸氫二鈉, 加水溶解并定容至10 0 0m L。2 3.2.1 1 底物緩沖液: 將檸檬酸溶液(0.1m o l/L) 、 磷酸氫二鈉溶液(0.2m o l/L) 和水按2 4.32 5.75 0的體積混合均勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配。2 3.2.1 2 TMB儲存液: 稱取2 0 0m gTMB, 用2 0m LN,N-二甲基甲酰胺溶解,4避光保存。2 3.2.1 3 底物溶液: 將7 5LTMB儲存液、1 0m L底物緩沖液和1 0L過氧化氫混合。2 3.2.1 4 硫酸溶液(2m o l/L) : 吸取1 0 6m L硫酸, 緩緩加入5 0 0m L水中, 并用水稀釋至10 0 0m L。2 3.2.1 5 乙酸溶液(0.1%) : 吸取1m L冰乙酸加入到9 9 9m L水中, 混勻。2 3.2.1 6 氫氧化鈉溶液(1m o l/L) : 稱取4 0g氫氧化鈉, 加水溶解并定容至10 0 0m L。2 3.2.1 7 抗河豚毒素單克隆抗體工作液: 抗河豚毒素單克隆抗體用抗體稀釋液稀釋至工作濃度。2 3.2.1 8 辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體工作液: 用抗體稀釋液將辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體稀釋至工作濃度。2 3.3 標(biāo)準(zhǔn)品河豚毒素(C1 1H1 7N3O8,C A S號:4 3 6 8 - 2 8 - 9) , 純度9 8%, 或經(jīng)國家認證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。2 3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制2 3.4.1 河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0g/L) : 準(zhǔn)確稱取適量河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品, 用乙酸鹽緩沖液(p H4.0) 溶解并定容, 配成濃度為1.0g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液, 密封后4保存?zhèn)溆谩? 3.4.2 河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液: 將河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0g/L) 用P B S溶液配制成濃度分別為50 0 0.0g/L、25 0 0.0g/L、10 0 0.0g/L、5 0 0.0g/L、2 5 0.0g/L、1 0 0.0g/L、5 0.0g/L、2 5.0g/L、1 0.0g/L、5.0g/L、1.0g/L、0.5g/L、0g/L的河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液, 現(xiàn)用現(xiàn)配。2 3.5 材料定量濾紙。2 4 儀器和設(shè)備2 4.1 全波長光柵酶標(biāo)儀或配有4 5 0n m濾光片的酶標(biāo)儀。2 4.2 電子天平: 感量0.1m g和0.0 1g。2 4.3 高速離心機:1 20 0 0r/m i n。2 4.4 組織勻漿器。2 4.5 3 7恒溫培養(yǎng)箱。2 4.6 溫控磁力攪拌器。2 5 分析步驟注:為避免毒素的危害, 應(yīng)戴手套進行操作。移液器吸頭等用過的器材、 廢棄的提取液等應(yīng)在氫氧化鈉溶液(1m o l/L)中浸泡1h以上, 以使毒素分解。G B5 0 0 9.2 0 62 0 1 61 3 2 5.1 試樣制備對新鮮或冷凍后解凍的樣品, 用水清洗魚體表面的污物, 濾紙吸干魚體表面的水分后用剪刀將魚體分解成肌肉、 肝臟、 腸道、 皮膚、 卵巢( 雄性為精囊) 等部分, 各部分組織分別用水洗去血污, 濾紙吸干表面的水分后稱重。2 5.2 試樣提取將待測河豚魚組織用剪刀剪碎, 加入5倍體積的乙酸溶液(0.1%) 即1g組織中加入乙酸溶液(0.1%)5m L , 用組織勻漿器磨成糊狀。取相當(dāng)于5g河豚組織的勻漿糊( 即2 5m L) 于燒杯中, 置溫控磁力攪拌器上邊加熱邊攪拌, 達到1 0 0 時持續(xù)1 0 m i n后取下, 冷卻至室溫后,80 0 0r/m i n離心1 5m i n, 快速過濾于1 2 5m L分液漏斗中。濾紙殘渣用2 0m L乙酸溶液(0.1%) 分次洗凈, 合并洗液, 置溫控磁力攪拌器上邊加熱邊攪拌, 達到1 0 0時持續(xù)3m i n后取下,80 0 0r/m i n離心1 5m i n, 合并上清液。加入等體積的乙醚振搖脫脂, 靜置分層后, 放出水層至另一分液漏斗中并以等體積乙醚再重復(fù)脫脂一次, 將水層放入1 0 0m L錐形瓶中, 于3 5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除其中殘存的乙醚, 將提取液移入5 0m L容量瓶中。用氫氧化鈉溶液(1m o l/L) 調(diào)p H至6.57.0, 并用P B S溶液定容至5 0m L, 立即用于檢測( 每毫升提取液相當(dāng)于0.1g河豚組織試樣) 。當(dāng)日不能檢測的提取液經(jīng)減壓濃縮去除其中殘存的乙醚后不調(diào)p H, 密封后-2 0冷凍保存, 在檢測前調(diào)節(jié)p H并定容至5 0m L, 立即檢測。2 5.3 測定2 5.3.1 包被酶標(biāo)微孔板用包被抗原包被酶標(biāo)板,1 2 0L/孔,4靜置1 2h。2 5.3.2 抗體抗原反應(yīng)將抗河豚毒素單克隆抗體工作液分別與不同濃度的河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液等體積混合于2m L試管內(nèi),4靜置1 2h或3 7溫育2h, 備用。此溶液用于制作河豚毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將抗河豚毒素單克隆抗體工作液與試樣提取液等體積混合于2m L試管內(nèi),4靜置1 2h或3 7溫育2h, 備用。此溶液用于測定試樣中河豚毒素的含量。2 5.3.3 封閉已包被的酶標(biāo)板用P B S - T洗液洗滌3次( 每次浸泡3m i n) 后, 加封閉液封閉,2 0 0L/孔, 置3 7溫育2h。2 5.3.4 顯色及測定封閉后的酶標(biāo)板用P B S - T洗液洗滌3次( 每次浸泡3m i n) , 加入2 5.3.2中制備好的抗原抗體反應(yīng)液( 在酶標(biāo)板的適當(dāng)孔位加抗體稀釋液作為陰性對照) ,1 0 0L/孔,3 7 溫育2h, 酶標(biāo)板用P B S - T洗液洗滌3次( 每次浸泡3m i n) 后, 加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體工作液,1 0 0L/孔,3 7 溫育1h, 酶標(biāo)板用P B S - T洗液洗滌5次( 每次浸泡3m i n) , 加新配制的底物溶液,1 0 0L/孔,3 7 溫育1 5m i n后, 每孔加入5 0L硫酸溶液(2m o l/L) 終止顯色反應(yīng), 在波長4 5 0n m處測定吸光度值。2 5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作根據(jù)2 5.3.4中獲得的河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度值, 以河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的濃度的對數(shù)值( 以1 0為底的對數(shù)值) 為橫坐標(biāo), 以河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的吸光度值與0g/L的河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)工G B5 0 0 9.2 0 62 0 1 61 4 作液的吸光度值的比值為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 5.5 空白實驗除不加試樣外, 均按上述測定步驟進行。2 6 分析結(jié)果的表述試樣中河豚毒素含量按式(4) 計算:X=cVfm(4) 式中:X 試樣中河豚毒素的含量, 單位為微克每千克(g/k g) ;c 由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣待測液中河豚毒素的濃度, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;V 定容體積, 單位為毫升(m L) ;f 稀釋倍數(shù);m 試樣的稱樣量, 單位為克(g) 。2 7 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的2 0%。2 8 其他本方法的檢出限為3g/k g, 定量限為1 0g/k g。G B5 0 0 9.2 0 62 0 1 61 5 附 錄 A河豚毒素致小鼠死亡時間與鼠單位換算及小鼠體重校正系數(shù) 河豚毒素致小鼠死亡時間與鼠單位換算及小鼠體重校正系數(shù)見表A.1和表A.2。表A.1 河豚毒素致小鼠死亡時間-鼠單位(MU) 換算表致死時間分: 秒鼠單位(MU)致死時間分: 秒鼠單位(MU)致死時間分: 秒鼠單位(MU)4:0 0 :0 5 :1 0 :1 5 :2 0 :2 5 :3 0 :3 5 :4 0 :4 5 :5 0 :5 55:0 0 :0 5 :1 0 :1 5 :2 0 :2 5 :3 0 :3 5 :4 0 :4 5 :5 0 :5 56:0 0 :1 0 :2 0 :3 0 :4 0 :5 06.1 35.8 05.5 24.1 15.0 64.8 54.6 74.5 24.3 54.2 24.0