NY-T401-2000脫毒馬鈴薯種薯(苗)病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程.pdf

B 1 5. 1 1中 華 人 民 共 和 國 農(nóng) 業(yè) 行 業(yè) 標(biāo) 準(zhǔn)N Y / T 4 0 1 -2 0 0 0脫毒馬鈴薯種薯( 苗) 病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程Ru l e s f o r v i r u s d e t e c t i o n o f v i r u s - f r e e s e e d ( s e e d l i n g ) p o t a t o e s2 0 0 0 一 0 9 一 2 2 發(fā)布2 0 0 0 一 1 2 一 0 1 實(shí)施中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā) 布N Y / T 4 0 1 -2 0 0 0前言 為了有效地實(shí)施對(duì)脫毒馬鈴薯種薯質(zhì)量檢驗(yàn)和管理， 規(guī)范脫毒馬鈴薯種薯市場(chǎng)， 促進(jìn)馬鈴薯脫毒技術(shù)推廣， 實(shí)現(xiàn)脫毒種薯病毒檢測(cè)的規(guī)范化、 標(biāo)準(zhǔn)化， 特制定本規(guī)程。 本規(guī)程在參照國內(nèi)外馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)最新研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上， 結(jié)合當(dāng)前國內(nèi)生產(chǎn)實(shí)際， 力求達(dá)到快速、 準(zhǔn)確、 可操作性強(qiáng)的檢測(cè)要求。檢測(cè)對(duì)象主要選擇生產(chǎn)上發(fā)生分布范圍廣、 危害 性大的病毒。 檢測(cè)方法主要采用指示植物檢測(cè)和雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附 檢測(cè)方法， 而類病毒檢測(cè)采用指示植物檢測(cè)、 往返電泳或反轉(zhuǎn)錄一 聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法 。 本規(guī)程內(nèi)容包括脫毒馬鈴薯種薯( 苗) 病毒檢測(cè)的適用范圍、 檢測(cè)對(duì)象、 抽樣方法、 檢測(cè)方法和質(zhì)量要求。 本標(biāo)準(zhǔn)的附錄 A、 附錄 B 、 附錄C都是標(biāo)準(zhǔn)的附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位: 農(nóng)業(yè)部植物脫毒種苗質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心( 濟(jì)南) 、 山東省植物保護(hù)總站。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人: 孫作文、 王同偉、 商明清、 楊勤民、 徐魯、 劉敬東。中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)脫毒馬鈴薯種薯( 苗) 病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程N(yùn) Y / T 4 0 1 -2 0 0 0Ru l e s f o r v i r u s d e t e c t i o n o f v i r u s - f r e e s e e d ( s e e d l i n g ) p o t a t o e s1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了脫毒馬鈴薯種薯、 組培苗的病毒檢測(cè)方法和操作規(guī)程。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于脫毒馬鈴薯種薯、 組培苗的病毒檢測(cè)。2 引用標(biāo)準(zhǔn) 下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條文， 通過在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本標(biāo)準(zhǔn)出版時(shí)， 所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會(huì)被修訂， 使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。 G B 7 3 3 1 -1 9 8 7 馬鈴薯種薯產(chǎn)地檢疫規(guī)程 G B 1 8 1 3 3 -2 0 0 0 馬鈴薯脫毒種薯3定義 本標(biāo)準(zhǔn)采用下列定義。3 . 1 脫毒苗 應(yīng)用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的再生試管苗， 經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)不帶馬鈴薯x病毒( P V X ) 、 馬鈴薯Y病毒( P V Y) 、 馬鈴薯S病毒( P VS ) 、 馬鈴薯卷葉病毒( P L R V) 等病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒( P S TV d ) ， 才確認(rèn)是脫毒苗。3 . 2 脫毒種薯 從繁殖脫毒苗開始， 經(jīng)逐代繁殖增加種薯數(shù)量的種薯生產(chǎn)體系生產(chǎn)出來的。 脫毒種薯 分為基礎(chǔ)種薯和合格種薯兩類。 基礎(chǔ)種薯是指用于生產(chǎn)合格種薯的原原種和原種; 合格種薯是指用于生產(chǎn)商品薯的種薯。3 . 2 . 1 基礎(chǔ)種薯( 分為三級(jí))3 . 2 . 1 . 1 原原種 p r e - e l i t e 用脫毒苗在容器內(nèi)生產(chǎn)的微型薯( m i c r o t u b e r ) 和在防蟲網(wǎng)室、 溫室條件下生產(chǎn)出的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯或小薯( rn i n i t u b e r ) .3 . 2 . 1 . 2 一級(jí)原種 e l i t e I 用原原種作種薯， 在良好隔離條件下生產(chǎn)出的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯3 . 2 . 1 . 3 二級(jí)原種 e l i t e II 用一級(jí)原種作種薯， 在良 好隔離條件下生產(chǎn)出的 符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯。3 . 2 . 2 合格種薯( 分為二級(jí))3 . 2 . 2 . 1 一 級(jí)種薯 c e rt i f i e d g r a t e I 用二級(jí)原種作種薯， 在隔離條件下生產(chǎn)出的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯。3 . 2 - 2 . 2 二級(jí)種薯 c e r t i f ie d g r a t e II中華人民共和國農(nóng)業(yè)部 2 0 0 0 一 0 9 一 2 2 批準(zhǔn)2 0 0 0 一 1 2 一 0 1實(shí)施 1N Y/ T 4 0 1 -2 0 0 0 用一級(jí)種薯作種薯， 在隔離條件下生產(chǎn)出的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯。3 病毒病株允許率 脫毒種薯繁殖田中病毒病株的允許比率。檢 測(cè)對(duì)象馬鈴薯x病毒( P o t a t o v i r u s X , P V X ) ;馬鈴薯Y病毒( P o t a t o v ir u s Y, P V Y ) ;馬鈴薯 S病毒( P o t a t o v i r u s S , P V S ) ;馬鈴薯卷葉 病毒( P o t a t o l e a f r o l l v i r u s , P L R V ) ;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒( P o t a t o s p i n d l e t u b e r v i r o i d , P S T V d ) ,抽樣組培苗抽樣1 脫毒核心材料: 每株必須檢測(cè)。2 擴(kuò)繁苗: 隨機(jī)抽取 1 0 o -2 0 0 的擴(kuò)繁苗檢測(cè)。 田間抽樣田 間抽樣數(shù)量及抽樣時(shí)期應(yīng)符合G B 1 8 1 3 3 -2 0 0 0 中6 . 2 的規(guī)定。商品種薯抽樣沒有經(jīng)過田間檢驗(yàn)的種薯必須進(jìn)行塊莖檢驗(yàn)。1 根據(jù)種薯不同存放方式， 采用分層設(shè)點(diǎn)取樣或隨機(jī)取樣法， 抽樣數(shù)量見表 1 , 表1 抽樣數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)表5515.1515.2種薯總量， k g抽樣百分率， %抽樣最低數(shù)量, k g簇 1 0 0 0 06 1 01 0 0 1 0 0 0 03 - 5注:不足抽樣最低數(shù)量的全部作為混合樣品。. 2 將第一次抽取的樣品混合后， 進(jìn)行二次抽樣， 隨機(jī)抽取 1 0 %的混合樣品檢測(cè)。檢測(cè)方法指示植物檢測(cè)法按G B 7 3 3 1 -1 9 8 7 中F 4 規(guī)定的方法執(zhí)行。 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)法檢測(cè)方法見附錄A.往返電 泳檢測(cè)法或反轉(zhuǎn)錄一 聚合酶鏈反應(yīng)( R T - P C R ) 檢測(cè)法用于檢測(cè)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒， 檢測(cè)方法見附錄B和附錄C,質(zhì)t要求凡指示植物檢測(cè)、 酶聯(lián)免疫檢測(cè)、 往返電泳檢測(cè)或 R T - P C R檢測(cè)呈陽性反應(yīng)者為帶毒種薯( 苗) 。各級(jí)種薯病株病毒允許率應(yīng)符合G B 1 8 1 3 3 -2 0 0 。 中第5 章的 規(guī)定。N Y/ T 4 0 1 -2 0 0 0 附錄A ( 標(biāo)準(zhǔn)的附錄)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)法A 1 溶液配制 所用化學(xué)試劑為 分析純級(jí)規(guī)格， 用水為蒸餾水。A l . 1 洗滌緩沖液( P B S T , p H 7 . 4 ) 氯化鈉( N a C I ) 8 . 0 0 g 磷酸二氫鉀( K H 2 P O 4 ) 0 . 2 0 g 磷酸氫二鈉( N a 2H P 0 , 1 2 H , 0 ) 2 . 9 3 g ( 或N a 2 H P 0 , 1 . 1 5 g ) 氯化鉀( K C I ) 0 . 2 0 g 吐溫- 2 0 ( Twe e n - 2 0 ) 0 . 5 0 mL 溶于蒸餾水中， 定容至1 0 0 0 m l , , 4 保存A 1 . 2 抽提緩沖液( P H 7 . 4 ) 2 0 . 0 0 g 聚乙 烯A 比 咯烷酮( MWz n o a 。 一 。 。 。 。 ) 溶于1 0 0 0 m L P B S T中。A1 . 3 包被緩沖液( p H 9 . 6 ) 碳酸 鈉( N a , C 0 , ) 1 . 5 9 g 碳酸氫鈉( N a H C O , ) 2 . 9 3 g 疊氮 鈉( N a N O 0 . 2 0 g 溶于蒸餾水中， 定容至1 0 0 0 m L , 4 保存。A l . 4 封板液 牛血 清白蛋白( 或脫脂奶粉)2 . 0 0 g 聚乙 烯A 比 咯烷酮( M Wz u u 。 一 ; 。 。 。 。 )2 . 0 0 g 溶于1 0 0 mL P B S T中， 4 保存。A 1 . 5 酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液 牛血清白蛋白( 或脫脂奶粉)0 . 1 0 g 聚乙 烯毗咯烷酮( MW- -4 - 0 1 . 0 0 g 疊氮 鈉( N a N , ) 0 . 0 1 g 溶于1 0 0 mL P B S T中， 4 保存。A 1 . 6 底物緩沖液 二乙醇胺9 7 m L 疊氮鈉( N a N , ) 0 . 2 0 g 溶于 8 0 0 m L蒸餾水中， 用 2 m o l / I鹽酸調(diào) p H至 9 . 8 ， 定容至 1 0 0 0 mL , 4 保存。A1 . 7 底物溶液( 現(xiàn)用現(xiàn)配) 0 . 0 5 g 4 - 硝基苯酚磷酸鹽溶于5 0 m L 底物緩沖 液中。A 2 樣品制備 取樣品 0 . 5 -1 . 0 g ， 加入 5 m L抽提緩沖液， 研磨, 4 0 0 0 r / m i n離心5 min ， 取上清液備用A 3 操作步驟A 3 . T 包被抗體: 每孔加 1 0 0 k L用包被緩沖液按工作濃度稀釋的抗體， 3 7 0C 保濕孵育 2 -4 h或 4 保 3N Y / T 4 0 1 -2 0 0 0濕過夜。A 3 . 2 洗板 : 用洗滌緩沖液洗板 4 次， 每次 3 - 5 min ,A 3 . 3 封板: 每孔加2 0 0 S L封板液， 3 4 保濕孵育 1 一2 h oA 3 . 4 洗板 : 同A3 . 2 ,A 3 . 5 包被樣品: 每孔加 樣品1 0 0 p L , 3 4 0C 保濕孵育2 -4 h 或4 保濕過夜。 同時(shí)設(shè)陰 性、 目 標(biāo)病毒的陽性和空白對(duì)照， 可根據(jù)需要設(shè)置重復(fù)。A 3 . 6 洗板: 用洗滌緩沖 液洗板4 - 8 次， 每次3 - 5 m i n aA 3 . 了 包被酶標(biāo)抗體: 每孔加1 0 0 p L 用抗體稀釋緩沖液稀釋到工作濃度的堿性磷酸酷酶標(biāo)記抗體.3 7 0 C 孵育 2 -4 h ,A3 . 8 洗板 : 同 A3 . 2 .A 3 . 9 加底物溶液: 每孔加1 0 0 p L , 3 7 保濕條件下反應(yīng)1 h ,A l 1 0 酶聯(lián)檢測(cè): 用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定 4 0 5 n m的光吸收值( O D , o , ) ， 記錄反應(yīng)結(jié)果。陽 。斷 T :& ffl ljg pp O D aa,PA , t Xf M 0 D O D a, 、 2 為 陽 性 附錄B( 標(biāo)準(zhǔn)的附錄)往返電泳檢測(cè)法B 1 溶液配制 所用化學(xué)試劑為分析純級(jí)規(guī)格， 用水為燕餾水。B 1 . 1 抽提緩沖液( p H 7 . 5 ) 三羚甲基氨基甲 烷( T r i s ) 6 . 0 6 g 乙二胺四乙 酸( E D T A) 1 . 8 6 g 氯化 鈉( N a C D 5 . 8 4 g 溶于8 0 0 m L蒸餾水中， 用鹽酸調(diào)p H至7 . 5 ， 定容至1 0 0 0 m L , 4 保存。B 1 - 2 TB E電泳緩沖液( p H8 . 3 ) T r i s 1 0 . 7 8 g 硼酸5 . 5 0 g EDTA 0 . 9 3 g 溶于蒸餾水中， 定容至1 0 0 0 m L , 4 保存。B 1 . 3 5 %聚丙烯酞胺凝膠配方 3 0 %丙烯酸胺一 甲 叉雙丙烯酞胺儲(chǔ)備液( 丙烯酞胺: 甲 叉雙丙烯酞 胺=2 9 0 1 ) 7 . 5 m L N, N, N , N 一 四甲基乙二胺( T E ME D) 原液0 . 0 4 5 mL 2 0 %過硫酸錢( 現(xiàn)用現(xiàn)配)0 . 4 m L 1 O XTB E緩沖液4 . 5 mL 加燕 餾水至4 5 m L ,B 1 . 4 顯影液 氫氧 化鈉6 . 4 0 9 硼氫化鈉0 . 4 0 g 甲醛1 . 6 m LN Y / T 4 0 1 -2 0 0 0 溶于4 0 0 mL蒸餾水中。B l . 5 指示染料溶液 4 0 0 o 蔗糖， 0 . 0 3 %的二甲苯藍(lán)。B 2 樣品制備13 2 . 1 研磨 : 取 。 . 5 -1 . 0 g 待檢樣品， 加人 2 mL抽提緩沖液, 2 m L用抽提緩沖液飽和的酚、 少許十二烷基磺酸鈉( S D S ) , 1 -2 滴2 - 疏基乙醇， 研磨， 同時(shí) 設(shè)陰 性對(duì)照、 陽 性對(duì)照。B 2 . 2 離心: 加入 2 mL氯仿一 異戊醇( 2 4: 1 ) ， 繼續(xù)研磨 2 m i n , 4。 。 。 r / mi n 離心1 5 mi n ， 收集上清液。B 2 . 3 沉淀: 取上清液加入 3 m o l / L醋酸鈉使其終濃度為 3 0 0 mm o l / L， 并加人 3 倍體積 9 5 %的冷乙醇， 冰浴1 h , 1 0 0 0 0 r / m in 離心 1 5 m i n ， 收集沉淀抽干。B 2 . 4 回 溶: 取用4 0 0 p L T B E緩沖液溶解沉淀， 備用。B 3 往 返電泳B 3 . 1 制板 : 取潔凈的電泳板， 1 %瓊脂糖封底 ， 制成 5 %聚丙烯酸胺凝膠板。B 3 . 2 加樣: 取2 0 p L制備好的樣品， 加人5 I L 指示染料溶液混勻后加入樣品槽。B 3 . 3 第一向電泳: 在 3 8 0 V電壓下電泳至二甲苯藍(lán)距膠底約 1 c m時(shí)停止電泳。B 3 . 4 第二向電泳: 更換新的電泳緩沖液( 7 5 C ) ， 交換正負(fù)極， 在6 5 C 溫箱內(nèi)、 3 8 0 V電壓下電泳至二甲苯藍(lán)距膠底約 1 c m時(shí)停止電 泳， 取下膠板染色。B 4 染色B 4 . 1 固定: 將膠板在固定液( 1 0 %乙醇, 0 . 5 %乙酸) 中固定 1 5 mi n或過夜。B 4 . 2 染色: 在 。 . ”%的硝酸銀溶液中染色 2 0 mi n ,B 4 . 3 漂洗: 用蒸餾水漂洗4次， 每次 3 - 5 m i n .B 4 . 4 顯影: 在顯影液中顯色 1 0 m i n .B 4 . 5 增色: 在7 . 5 g / L碳酸 鈉溶液中 增色1 0 m i n ， 取出膠板放入固 定液中， 觀察結(jié)果。 陽性判斷: 與陽性對(duì)照相同位置有明顯帶出現(xiàn)的為陽性。 附錄C ( 標(biāo)準(zhǔn)的附錄)反轉(zhuǎn)錄一 聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)法c l 溶液配制 所用化學(xué)試劑為分析純級(jí)規(guī)格。C l . 1 核酸提取緩沖液: 1 o 0 mm o l / L氯化鈉， 1 0 0 m mo l / L T r i s - HC I ( p H9 . 0 ) , 1 0 mm o l / L E D T A,。 . 5 %皂土， 。 . 5 %十二烷基磺酸鈉( S D S ) , 1 0 o 2 - 琉基乙醇。c 1 . 2 1 xT A E緩沖液: 4 0 mmo l / L T r i s - H C I , 2 0 mmo l / L乙酸鈉， 2 mm o l / L E D T A( 用冰乙酸調(diào) p H至 8 . 0 ) 0c 1 . 3 緩沖液 I: 內(nèi)含 。 . 2 m o l / L氯化鈉的 1 X T A E緩沖液。C 1 . 4 緩沖液 I: 內(nèi)含 1 . 5 m o l / L氯化鈉的 1 X T A E緩沖液。C l . 5 5 X c D N A 第 一鏈 合成 緩沖 液: 2 5 0 mmo l / L T r i s - H C I ( p H8 . 3 ) , 3 7 5 mm o l / L氯化 鉀，1 5 0 mmo l / L 氯化鎂, 2 5 0 m mo l / L D T T.C 1 . 6 I O XP C R緩沖液: 1 0 0 m mo l / L T r i s - H C l ( p H8 . 3 ) , 5 0 0 m mo l / L氯化鉀， 1 5 o mmo l / L 氯化鎂，0 . 1 %牛血清蛋白( B S A)C l - 7 s /聚丙烯酞胺凝膠配方NY/ T 4 0 1 -2 0 0 0 3 0 %丙烯酸胺一 甲 叉雙丙烯酞胺儲(chǔ)備液( 丙 烯酞胺: 甲叉雙丙 烯酞胺= 2 9 : 1 ) 9 . 0 rn L l o x丁 A E緩沖液4 . 5 mL N, N, N , N 一 四甲基乙二胺( T E ME D ) 原液0 . 0 4 5 m L 2 0 %過硫酸錢( 現(xiàn)用現(xiàn)配)0 . 4 m L 加蒸餾水至4 5 m L .C 2 模板核酸( P S T V d R N A ) 的制備 取待檢樣品。 . 5 -1 . 0 g ， 在液氮中 研磨， 加2 -3 m L 核酸提取緩沖液研磨勻漿， 加等體積水飽和酚( 內(nèi) 含。 . 1 % 8 - 輕基唆琳) ， 繼續(xù)研磨勻漿， 再加等體積氯仿， 勻漿. 4 C , 8 0 0 0 - 9 0 0 0 r / m i n 離心1 5 m i n .取上 清過 1 X 3 e m D E A E 一 纖維素柱， 先用1 0 m L緩沖液 I 沖洗柱子， 再用緩沖液II 洗 脫， 每次加1 m L ,待洗 脫液有顏色時(shí)開始收集， 直到洗脫液無顏色為止。向 洗脫液中加入3 倍體積的冷乙 醇， 一 2 0 沉淀過夜， 1 0 0 0 0 r / m i n冷凍離心 2 0 mi n 。 取沉淀用 7 5 %的乙醇洗滌， 1 0 0 0 0 r / mi n冷凍離心 1 5 m i n 。 收集沉淀， 干燥后， 用。 . 4 m I . 1 X T A E緩沖液溶解， 即為P S T V d 的 模板核酸樣品。C 3 P C R擴(kuò)增C 3 . 1 引物: 引物 1 ( P I ) 的堿基序列為 5 C G G G T AC C C GT T C A C A C C T3 ， 引物 2 ( P 2 ) 的堿基序列為5 CC GAGCTC GGTCC AGGAGGT3 。C 3 . 2 P C R擴(kuò)增方法C 3 . 2 . 1 c DN A的合成 在0 . 5 m L全子離心管( e p p e n d o r f ) 管中 加入: 模板核酸1 p L , 1 0 p m o l / L 互補(bǔ)引物1 ( P 1 ) 1 p L ， 無菌 重蒸餾水9 p L , 9 5 C 水浴5 m i n 。 然后向 管中加 人下列混合物: 4 0 U 加L r R N a s i n 1 p L , 5 X 第一鏈合成緩沖液4 p L , 1 0 m m o l / L d N T P 1 p L , O . 1 m o l / L D T T 2 p L , 2 0 0 U / p L MML V逆轉(zhuǎn)錄酶1 p L , 4 2 C水 浴保溫1 h ,C 3 . 2 . 2 P C R