GB16551-1996豬瘟檢疫技術規(guī)范.pdf

中華 人 民 共 和 國 國 家 標 準G B 1 6 5 5 1 一 1 9 9 6豬瘟檢疫技術規(guī)范T e c h n i c a l c o d e o f q u a r a n t i n e f o r1 主題內(nèi)容與適用范圍本標準規(guī)定了豬瘟群體檢疫、 個體檢疫、 實驗室檢驗、 綜合判定和檢疫后處理的技術規(guī)范。本標準適用于豬瘟的檢疫。2 引用標準 G B 1 6 5 4 8 -1 9 9 6 畜禽病害肉 尸及其產(chǎn)品無害化處理規(guī)程3 群體檢疫3 門經(jīng)核實已按規(guī)定接種合格的豬瘟疫苗， 注射后一月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)疑似豬瘟的患豬， 并處在免疫有效期內(nèi)， 可認為免疫符合要求。如未接種疫苗， 或接種不符合要求， 或接種后又發(fā)現(xiàn)疑似豬瘟的病豬， 必須進行補充免疫接種， 至免疫有效期開始未發(fā)生異常， 可認為免疫合格; 如免疫接種后再發(fā)生疑似豬瘟患豬，必須進行臨床檢查、 解剖檢查和實驗室檢查， 在排除豬瘟染疫的可能性之后， 方可認為免疫合格。3 . 2 檢查全群的健康狀況， 有否異常表征。如發(fā)現(xiàn)豬群中被檢豬只體溫在4 0 . 5 以上， 倦怠、 食欲不振、 精神萎頓， 可視粘膜充血、 出血或有不正常分泌物、 發(fā)給、 便秘腹瀉交替， 或其他疑似豬瘟的癥狀， 作可疑豬瘟對待， 全群隔離飼養(yǎng)， 作進一步診斷。 此外， 仔豬有衰弱、 震顫或發(fā)育不良等現(xiàn)象時， 可懷疑母豬攜帶豬瘟病毒， 應進行實驗室確診。13 對群體中檢出的可疑患豬可抽樣進行解剖檢查， 下述病變作為綜合診斷定性的依據(jù)之一: a腎皮質色澤變淡， 有點狀出血; b ， 淋巴結外觀充血腫脹， 切面周邊出血， 呈紅白 相間的“ 大理石祥” ; c . 脾臟不腫大， 邊緣發(fā)現(xiàn)楔狀梗死區(qū); d . 喉頭、 膀朧有小點出血; e . 全身出血性變化， 多呈小片或點狀; f回盲瓣、 回腸、 結腸形成“ 鈕扣狀腫” ( 慢性豬瘟) ; 9 . 公豬包皮積尿。3 . 4 經(jīng)檢疫認為免疫合格， 臨床檢查無異常; 或發(fā)現(xiàn)疑似病例， 經(jīng)解剖檢查、 實驗室檢驗等綜合性診斷，證明不是豬瘟， 應作為非豬瘟群對待。 但易地飼養(yǎng)時， 必須先隔離兩周以上， 經(jīng)觀察無異常方準與當?shù)刎i群混養(yǎng)。4 個體檢疫 豬只作為單個檢疫對象時， 應進行認真的個體檢疫。4 . 1 個體檢疫的內(nèi)容包括: a . 查明產(chǎn)地有否疫情或查驗產(chǎn)地檢疫證明; b . 查驗防疫證明;國家技術監(jiān)督局1 9 9 6 一 1 0 一 0 3 批準1 9 9 7 一 0 2 一 0 1 實施G B 1 6 5 5 1 一 1 9 9 6 c . 臨床檢查。4 . 2 如上述三項均無疑問， 可作為豬瘟非疫豬對待。4 . 3 如4 . l c 項無問題， 而4 . l a , b 兩項有問題， 可再次補充免疫接種， 隔離 1 5日 無異常按非豬瘟豬對待。如免疫后有可疑癥狀， 應繼續(xù)隔離觀察， 如仍不能確診， 須進行解剖檢查和實驗室檢驗。4 . 4 如4 . l a , b 兩項無間題， 4 . l c 項有問題應隔離觀察， 如仍不能確診， 須作解剖檢查和實驗室檢驗。5 實驗室檢驗5 . 1 有下列情形之一者應進行實驗室檢驗: a . 產(chǎn)地定期檢疫; b非疫區(qū)對從外地引進的豬進行全群檢查或抽檢; c . 發(fā)現(xiàn)疑似豬瘟患豬或“ 非典型豬瘟” ， 母豬繁殖障礙和仔豬先天性痙攣病例須予確診; d . 原認為非疫群中或從非疫區(qū)引進豬群中發(fā)現(xiàn)可疑豬瘟或病毒攜帶者， 須予確診; e . 發(fā)現(xiàn)疑似豬瘟暴發(fā)流行， 在采取緊急防治措施的同時須作出確切診斷， 或解除封鎖前須查明豬體帶毒情況; f 有重大疫病( 如非洲豬瘟) 嫌疑須作出鑒別診斷; S . 交易雙方共同要求， 或農(nóng)牧主管部門要求進行確診; h . 經(jīng)群體檢疫或個體檢疫， 需要進一步確診者。52 下述方法， 其試驗結果可作為檢疫定性的依據(jù)之一。5 . 2 . 1 兔體交叉免疫試驗， 見附錄A ( 補充件) 。5 . 2 . 2 免疫酶染色試驗， 見附錄B ( 補充件) 。5 . 2 . 3 病毒分離與增毒試驗， 見附錄C ( 補充件) 。5 . 2 . 4 直接免疫熒光抗體試驗， 見附錄D ( 補充件) 。 價6 綜合判定 發(fā)病不分年齡、 季節(jié)， 臨床癥狀明顯， 解剖檢查病變典型， 用 5 . 2 中任一試驗獲陽性結果; 或臨床癥狀和發(fā)病情況不詳， 尸體解剖檢查病變典型, 5 . 2 中所列任一試驗獲陽性結果; 發(fā)病情況、 臨床癥狀、 病理變化不詳、 不明顯或不典型， 但 5 . 2 中所列試驗的兩項獲陽性結果; 這些情況均可判定為豬瘟病毒感染豬。了 檢疫后處理在群體或個體檢疫中， 凡經(jīng)綜合判定為豬瘟者， 其群體或個體一律按G B 1 6 5 4 8 處理。G B 1 6 5 5 1 一 1 9 9 6 附錄A兔體交叉免疫試驗 ( 補充件) 將病豬的淋巴 結和脾臟， 磨碎后用生理鹽水作1 : 1 0 稀釋， 對3 只健康家兔作肌肉注射， 5 m L / 只，另設3只不注射病料的對照兔， 間隔5 d對所有家兔靜脈注射 1: 2 0的豬瘟兔化病毒( 淋巴脾臟毒) ，1 m L / 只。 2 4 h 后， 每隔6 h 測體溫一次， 連續(xù)測9 6 h ， 對照組2 / 3 出現(xiàn)定型熱或輕型熱， 試驗成立。 試驗組的試驗結果判定見表A i . 表 A 1 兔體交叉免疫試驗結果判定接種病料后體溫反應接種豬瘟兔化弱毒后體溫反應結果判定含豬瘟病毒+不含豬瘟病毒+含豬瘟兔化病毒十+含非豬瘟病毒熱原性物質注: “ +” 表示多于或等于三分之二的動物有反應 附錄B免疫酶染色試驗 ( 補充件)B 1 解剖檢查時采病畜扁桃體、 脾、 腎、 淋巴結作壓印片或冰凍切片。標本自 然干燥后， 在2 %戍二醛和甲醛等量混合液中固定 1 0 m i n ， 干后， 置冰箱內(nèi)待檢。 操作方法:B 1 門將標本浸入。0 1 %過氧化氫或 0 . 0 1 %迭氮鈉的T r i s - H C I 緩沖液中， 室溫下作用3 0 m i n ,B 1 . 2 用p H 7 . 4 0 . 0 2 m o l / L 磷酸緩沖鹽水漂洗5 次， 每次3 m i n ， 風干。B 1 . 3 將標本置于濕盒內(nèi)， 滴加1 : 1 0 酶標記抗體， 覆蓋標本面上， 置3 7 作用4 5 m i n .B 1 . 4 用p H 7 . 4 0 . 0 2 m o l / L磷酸緩沖鹽水一 1 %吐溫緩沖液漂洗5 次， 每次2 -3 m i n .B 1 . 5 將標本放入D A B ( 4 一 二甲氨基偶氮苯) T r i s - H C I 液內(nèi)， 置 3 7 C 溫箱作用 3 m i n .B 1 . 6 用p H 7 . 4 0 . 0 2 m o l / L 磷酸緩沖鹽水沖洗3 -4 次， 每次2 - 3 m i n ， 再用無水酒精、 二甲 苯脫水，封片檢查。B 1 . 7 用顯微鏡檢查， 如細胞漿染成深褐色為陽性; 黃色或無色為陰性。 豬瘟兔化弱毒接種的豬組織細胞漿成微褐色， 與強毒株感染有明顯區(qū)別。 附錄c病毒分離與增毒試驗 ( 補充件) 本試驗可用來分毒和擴增病毒數(shù)量以提高檢疫的敏感性。c l 將2 g扁桃體或脾臟， 剪成小塊， 加上滅菌砂在乳缽中研成勻漿。 用H a n k s 液或ME M配成2 0 懸G B 1 6 5 5 1 一 1 9 9 6液， 加上青霉素( 使終濃度為5 0 0 單位/ m L ) 和鏈霉素( 使終濃度為5 0 0 p g / m L ) ， 室溫下放置 1 h ,3 0 0 0 r / m i n 離心1 5 m i n ， 取用上清液。C 2 將P K 1 5 單層細胞用胰酶消化分散后， 8 0 0 r / m i n 離心1 0 m i n ， 用含無B V D V的5 %胎牛血清的ME M配成2 X1 0 個細胞/ m L懸液。C 3 9 份細胞懸液( C 2 ) 加1 份病料懸液( C 1 ) 接種于轉瓶或微量細胞培養(yǎng)板。 另設不加病料的對照若干瓶( 孔) ， 于接種后 1 , 2 , 3 d ， 分別將2 瓶( 孔) 培養(yǎng)物及 1 瓶( 孔) 對照用H a n k s 液或ME M洗滌2 次， 每次 5 m i n ， 用冷丙酮固定 1 0 m i n ,C Q 進行免疫酶染色或免疫熒光染色， 鏡檢。 附錄D直接免疫熒光抗體試驗 ( 補充件)D 1 采樣 群體檢疫中， 待檢可疑豬不少于三例， 其中至少二例為早期患豬， 剖殺后或從活體摘取口 愕扁桃體。后期病豬剖殺后采扁桃體和腎臟。個體檢疫中， 剖殺可疑豬采扁桃體和腎臟。所采組織樣品必須新鮮。D 2 送檢 采樣后應盡快送檢， 如當日 不能送出， 必須凍結保存， 避免組織腐敗、 自 溶。D 3 切片 將樣品組織塊修切出1 c mxl c m的面， 不經(jīng)任何固定處理， 直接凍貼于冰凍切片托上( 組織塊太小時， 如活摘的扁桃體可用冰凍切片機專用的包埋劑或化學漿糊包埋) ， 進行切片。切片厚度要求5 -7 p m。將切片展貼于。 . 8 -1 m m厚的潔凈載玻片上。D Q 固定 將切片置純丙酮中固定1 5 m i n 。取出立即放入 。 . 0 1 m o l / L , p H 7 . 2 的磷酸緩沖鹽水中， 輕輕漂洗3 -4 次。取出， 自 然干燥后， 盡快進行熒光抗體染色。D 5 熒光抗體染色 將豬瘟熒光抗體滴加于切片表面， 置濕盒內(nèi)于3 7 作用3 0 m i n 。取出后放人磷酸緩沖鹽水中充分漂洗， 再用。5 m o l / L , P H 9 . 0 -9 . 5 碳酸鹽緩沖甘油封固 蓋片( 0 . 1 7 m m厚) 。 染色后應盡快鏡檢。 必要付可低