DB33T599-2006水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質譜法.doc

DB33/T 2002浙江省質量技術監(jiān)督局 發(fā)布2006-02-08實施2006-01-05發(fā)布水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質譜法Determination of the metabolites of Nitrofuran Antibiotics residues in aquatic productsLC-MS/MS methodDB33/T 599-2006DB33浙江省地方標準ICS 67.050B 501DB33/T 5992006前 言本標準附錄A為資料性附錄。本標準由浙江省海洋與漁業(yè)局提出并歸口。本標準起草單位：浙江省水產(chǎn)質量檢測中心。本標準主要起草人：張海琪、何中央、王揚、鄭重鶯、丁雪燕、應永飛。I水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質譜法1 范圍本標準規(guī)定了水產(chǎn)品中呋喃它酮的代謝物5-甲基嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮（簡稱AMOZ，下同）、呋喃西林的代謝物氨基脲（簡稱SEM，下同）、呋喃妥因的代謝物1-氨基-2-內酰脲（簡稱AHD，下同）和呋喃唑酮的代謝物3-氨基-2-噁唑烷基酮（簡稱AOZ，下同）殘留量的液相色譜-串聯(lián)質譜的測定方法。本標準適用于水產(chǎn)品中呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物、呋喃妥因代謝物和呋喃唑酮代謝物殘留量的檢驗。本標準規(guī)定呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物、呋喃妥因代謝物和呋喃唑酮代謝物的檢測限均為0.50 g/kg。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3 原理樣品中殘留的硝基呋喃類抗生素代謝物在酸性條件下水解，用2-硝基苯甲醛衍生化，經(jīng)固相萃取柱凈化后液相色譜-串聯(lián)質譜法測定，內標法定量。4 試劑除非另有說明，僅使用分析純試劑。4.1 水：GB/T 6682規(guī)定的一級水。4.2 甲醇：色譜純。4.3 乙腈：色譜純。4.4 乙酸乙酯：色譜純。4.5 磷酸氫二鉀。4.6 甲酸：優(yōu)級純。4.7 二甲亞砜：優(yōu)級純。4.8 鹽酸：優(yōu)級純。4.9 氫氧化鈉：優(yōu)級純。4.10 2-硝基苯甲醛（2-NBA）：純度99%。4.11 磷酸氫二鉀溶液：0.5 mol/L。稱取5.7 g磷酸氫二鉀（4.5），用水溶解，定容至50 mL。4.12 鹽酸溶液：0.2 mol/L。量取17 mL濃鹽酸（4.8）用水定容至1 000 mL。4.13 氫氧化鈉溶液：1 mol/L。稱取40 g氫氧化鈉(4.9)，用水溶解，定容至1 000 mL。4.14 2-硝基苯甲醛溶液：8.0 g/L。稱取80 mg 2-硝基苯甲醛（4.10）溶于10 mL二甲亞砜(4.7)，臨用前配制。4.15 Oasis HLB固相萃取柱或相當者：60 mg，3 mL。使用前分別用3 mL乙酸乙酯、3 mL甲醇和5 mL水預處理，保持柱體濕潤。4.16 AMOZ、SEM、AHD、AOZ及同位素內標物AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-D3和SCA-13C-15N2標準物質：純度98%。4.17 標準儲備溶液：0.10 mg/mL。準確稱取四種硝基呋喃類代謝物標準物質及四種相應的同位素內標物，分別用甲醇配成0.10 mg/mL的標準貯備溶液。-18避光保存，保存期為三個月。4.18 混合標準儲備溶液：1 g/mL。吸取四種硝基呋喃類代謝物標準儲備溶液（4.17），用甲醇配成1 g/mL。-18避光保存，保存期為三個月，使用前回溫到室溫。4.19 混合內標工作溶液：100 ng/mL。吸取四種硝基呋喃類代謝物同位素的標準儲備溶液（4.17），用甲醇配成100 ng/mL。-18避光保存，保存期為三個月，使用前回溫到室溫。4.20 混合標準工作溶液：根據(jù)需要，臨用前吸取一定量的混合標準儲備溶液（4.18），用甲醇稀釋配制適當濃度的混合標準工作液。5 儀器和設備5.1 液相色譜串聯(lián)四極桿質譜儀，配有電噴霧（ESI）離子源。5.2 恒溫振蕩器。5.3 固相萃取裝置。5.4 高速臺式離心機：5 000 r/min。5.5 氮氣吹干儀。5.6 pH計。6 測定步驟6.1 提取稱取10 g均質試樣（精確到0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入100 L內標工作溶液（4.23），分別加入25 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液和0.5 mL衍生劑（4.14），渦旋混合1 min，置于37恒溫振蕩器中保持16h。6.2 凈化將上述提取溶液（6.1）取出放置至室溫，加入1 mL 0.5 mol/L磷酸氫二鉀溶液（4.11），用1 mol/L 氫氧化鈉溶液（4.9）調節(jié)溶液pH范圍至7.07.4，以4 500 r/min的速度離心15 min，上清液過已Oasis HLB或相當?shù)墓滔噍腿≈?.15），調節(jié)流速小于等于2 mL/min，待樣液全部通過固相萃取柱后用3 mL水洗固相萃取柱，棄去全部流出液。負壓下抽干固相萃取柱10 min，再用6mL乙酸乙酯洗脫被測物，洗脫液全部收集于10 mL離心管中，并在氮氣吹干儀上40水浴吹干，1mL乙腈與0.4%甲酸水溶液（10+90）溶解殘渣，過0.2 m濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質譜測定。6.3 測定6.3.1 色譜條件a) 色譜柱：Zorbax XDB C18柱（150 mm2.1 mm5 m）或相當者；b) 柱溫：35；c) 進樣量：40 L；d) 流動相及流速見表1。6.3.2 質譜條件a) 離子源：電噴霧離子源（ESI）；b) 掃描方式：正離子掃描；c) 檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；d) 霧化氣（NEB）、氣簾氣（CUR）、輔助加熱氣（AUX）、碰撞氣（CAD）均為高純氮氣；使用前應調節(jié)各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求；e) 噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能等電壓值應優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度；f) Q1，Q3均為單位分辨率（UNIT）；g) 定性離子對、定量離子對、采集時間（Dwell）見表2。表1 液相色譜梯度洗脫條件時間（min）流速（L/min）0.4%甲酸水溶液（%）乙腈（%）0.0020070303.0020070303.0125025758.0025025758.01200703015.002007030表2 四種硝基呋喃代謝物的監(jiān)測離子對硝基呋喃代謝物名稱定量離子對（m/z）定性離子對（m/z）采集時間（ms）AMOZ335/291335/262100；100SEM209/166209/192100；100AHD249/134249/17850；100AOZ236/134236/104100；50AOZ-D4240/13450AMOZ-D5340/296100AHD-D3252/13450SCA-13C-15N2212/1951006.3.3 液相色譜-串聯(lián)質譜測定6.3.3.1 定性測定在相同試驗條件下，樣品中待測物與同時檢測的標準物質具有相同的保留時間，并且非定量離子對與定量離子對色譜峰面積的比值相對偏差小于30%，則可判定為樣品中存在該殘留。6.3.3.2 定量測定按照6.3.1和6.3.2液相色譜-串聯(lián)質譜條件測定樣品和混合標準工作溶液（6.1.4），以色譜峰面積按內標法定量，以AMOZ-D5 （m/z 340/296）計算AMOZ（m/z 335/291）的濃度，以SCA-13C-15N2（m/z 212/195）計算SEM（m/z 209/166）的濃度，以AHD-D3（m/z 252/134）計算AHD（m/z 249/134）的濃度，以AOZ-D4（m/z 240/134）計算AOZ（m/z 236/134）的濃度。 在上述色譜條件下標準溶液的提取離子流圖參見附錄A.1。6.4 空白試驗除不加試樣外，均按上述測定步驟進行。7 結果計算測定結果可由計算機按內標法自動計算，也可按式（1）計算，計算結果需扣除空白值。（1）式中：X 樣品中待測組分殘留量，單位為微克每千克（g/kg）；C AMOZ、SEM、AHD或AOZ標準工作溶液的濃度，單位為微克每升（g/L）；Csi 標準工作溶液中內標物的濃度，單位為微克每升（g/L）；C i0 樣液中內標物的濃度，單位為微克每升（g/L）；A00 樣液中AMOZ、SEM、AHD或AOZ的峰面積；As AMOZ、SEM、AHD或AOZ標準工作溶液的峰面積；Asi 標準工作溶液中內標物的峰面積；Ai 樣液中內標物的峰面積；V 樣品定容體積，單位為毫升（mL）；W 樣品稱樣量，單位為克（g）。注：報告測定結果至小數(shù)二位。8 方法檢測限、準確度和精密度8.1 方法檢測限本方法在水產(chǎn)品中AMOZ、AOZ、S