菌種及其擴(kuò)大培養(yǎng)4學(xué)時(shí).pptVIP

1,生物反應(yīng)工程 陳宏文 博士 華僑大學(xué)生物工程與技術(shù)系,2,第二章 菌種及其擴(kuò)大培養(yǎng),引言 種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與種子要求 2.1 實(shí)驗(yàn)室種子制備 2.2 生產(chǎn)車間種子制備 2.3 影響種子質(zhì)量的因素 2.4 種子質(zhì)量控制措施,目前工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵發(fā)酵罐容積已達(dá)幾十立方米或幾百立方米。如按百分之十左右的種子量計(jì)算，就要投入幾立方米或幾十立方米的種子。 要從保藏在試管中的微生物菌種逐級(jí)擴(kuò)大為生產(chǎn)用種子，是一個(gè)由實(shí)驗(yàn)室制備到車間生產(chǎn)的過程。 種子液質(zhì)量的優(yōu)劣 對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)起著關(guān)鍵性的作用,3,4,種子擴(kuò)大培養(yǎng) 將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。,5,種子擴(kuò)培的目的 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種 縮短發(fā)酵時(shí)間、提高設(shè)備利用率、保證生產(chǎn)水平,6,種子的要求 活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長(zhǎng)，延遲期短 生理狀況穩(wěn)定 總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求 無雜菌污染 保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力,7,種子制備一般工藝流程,實(shí)驗(yàn)室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實(shí)驗(yàn) 室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成。,生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，一般在工程上歸 為發(fā)酵車間管理。,8,21 實(shí)驗(yàn)室種子制備,211 種子保藏 212 菌種移接,菌種保藏的意義,菌種 微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料 世代時(shí)期很短，傳代過程中易發(fā)生變異、死亡 造成工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化、使優(yōu)良菌種丟失。 菌種保藏是微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分 要采用最合適的保存方法使菌種的變異和死亡減少到最低限度,9,10,一般手段 保持培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分在最低水平 缺氧狀態(tài) 干燥 低溫 菌種保藏方法 斜面冰箱保藏法（低溫） 沙土管保藏法（缺營(yíng)養(yǎng)、低溫） 石蠟油封存法（缺氧、低溫） 真空冷凍干燥保藏法（缺營(yíng)養(yǎng)、缺氧、干燥、低溫） 液氮超低溫保藏法（缺營(yíng)養(yǎng)、缺氧、干燥、超低溫）,2.1.1 種子保藏,斜面冰箱保藏法（低溫） 短期、過渡的保藏方法 新鮮斜面接種后，置最適條件下培養(yǎng)到菌體或孢子生長(zhǎng)豐滿后，放在4C冰箱保存。 一般保存期為三個(gè)月到六個(gè)月。,11,沙土管保藏法（缺營(yíng)養(yǎng)、低溫） 適合于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物。制備方法： 將沙與土洗凈烘干過篩后，按沙與土的比例為12：1混合均勻，分裝于小試管中，裝料高度約為1厘米左右，121C間歇滅菌三次，滅菌試驗(yàn)合格后烘干備用。一般沙用80目過濾，土用80一100目過篩。 將斜面孢子制成孢子懸浮液接入沙土管中或?qū)⑿泵骀咦庸蜗轮苯优c沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱內(nèi)保存。一般保存期為一年左右。,12,石蠟油封存法（缺氧、低溫） 向培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，倒入一層滅過菌的石蠟油，用量高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可適用于不能利用石蠟油作碳源的細(xì)菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期約一年左右。 真空冷凍干燥保藏法（缺營(yíng)養(yǎng)、缺氧、干燥、低溫） 將微生物制成懸浮液，與保護(hù)劑混合； 放在特制的安培管，用低溫酒精或干冰（-15C），使其迅速凍結(jié)，在低溫下用真空泵抽干； 最后將安培管真空熔封，井低溫保藏。 菌種可以保存很長(zhǎng)時(shí)間，一般5年左右。,13,液氮超低溫保藏法 （缺營(yíng)養(yǎng)、缺氧、干燥、超低溫） 原理：用液氮能長(zhǎng)期保存菌種。這是因?yàn)橐旱臏囟瓤蛇_(dá)-196C，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其新陳代謝作用停止的溫度(-130C)，此時(shí)菌種的代謝活動(dòng)已停止，化學(xué)作用亦隨之消失。 操作方法： 安培管的要求 菌種準(zhǔn)備及分裝 凍結(jié)（常溫過渡到低溫） 重新培養(yǎng)（迅速解凍）,14,15,21 實(shí)驗(yàn)室種子制備,211 種子保藏 212 菌種移接,16,1）搖瓶液體培養(yǎng) ：產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)、孢子發(fā)芽慢（灰色鏈霉菌）和不產(chǎn)孢子的菌種（谷氨酸棒狀桿菌、釀酒酵母） 2）茄子瓶固體培養(yǎng) ：產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的菌種（產(chǎn)黃青霉菌） 3）茄子瓶斜面培養(yǎng) ：不產(chǎn)孢子的菌種（細(xì)菌）,2.1.2 菌種移接,17,2.2 生產(chǎn)車間種子制備,221 菌種移接 222 種子罐級(jí)數(shù)的確定 223 接種齡與接種量 224 種子質(zhì)量判斷,18,搖瓶菌絲體：火焰保護(hù)接種或壓差法 孢子懸浮液：微孔接種法 種子罐之間或發(fā)酵罐之間：壓差法（由種子 接種管道進(jìn)行移種，防止接受罐表壓降至零， 否則會(huì)引起染菌。）,2.2.1 菌種移接,BIOSTAT Aplus The compact, autoclavable fermentor |bioreactor,19,BIOSTAT Bplus Integrated system design for convenience research,21,22,221 菌種移接 222 種子罐級(jí)數(shù)的確定 223 接種齡與接種量 224 種子質(zhì)量判斷,2.2 生產(chǎn)車間種子制備,23,種子罐級(jí)數(shù)： 是指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。 種子罐級(jí)數(shù)確定的依據(jù) 級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模 菌體生長(zhǎng)特性 接種量的大小 級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級(jí)。 在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級(jí)數(shù)的確定是非常重要的一個(gè)方面,2.2.2 種子罐級(jí)數(shù)的確定,24,一級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（二級(jí)發(fā)酵）： 茄子瓶斜面或搖瓶種子經(jīng)過一次種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，接入發(fā)酵罐作為種子，這稱為一級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)。 如谷氨酸生產(chǎn)菌（生長(zhǎng)較快、接種量少）: 茄子斜面 32培養(yǎng)710h 種子罐 發(fā)酵罐 搖瓶種子 108109個(gè)/ml,2.2.2 種子罐級(jí)數(shù)的確定,25,二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（三級(jí)發(fā)酵）： 茄子瓶斜面或搖瓶種子經(jīng)過兩次種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，接入 發(fā)酵罐作為種子，這稱為二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)。 如青霉素生產(chǎn)菌（生長(zhǎng)較慢）： 27 27 孢子懸浮液 發(fā)芽罐 繁殖罐 發(fā)酵罐 40h 10-24h （50噸） 一級(jí)種子罐 二級(jí)種子罐,2.2.2 種子罐級(jí)數(shù)的確定,26,三級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（四級(jí)發(fā)酵）： 鏈霉素生產(chǎn)菌（更慢） 一級(jí)發(fā)酵： 孢子或菌絲體直接接入發(fā)酵罐中發(fā)酵，稱一級(jí)發(fā)酵。 一般是實(shí)驗(yàn)室小型發(fā)酵罐（5-30L）。,2.2.2 種子罐級(jí)數(shù)的確定,種子罐的級(jí)數(shù)越少 越有利于簡(jiǎn)化工藝和控制 減少由于多次移種而帶來染菌的機(jī)會(huì) 但也必須考慮盡量延長(zhǎng)發(fā)酵罐生產(chǎn)產(chǎn)物的時(shí)間，縮短由于種子發(fā)芽、生長(zhǎng)而占用的非生產(chǎn)時(shí)間，以提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)率（mol產(chǎn)物/L/h）。 雖然種子罐級(jí)數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定，但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖也可相應(yīng)地減少種子罐的級(jí)數(shù)。,27,2.2.2 種子罐級(jí)數(shù)的確定,28,221 菌種移接 222 種子罐級(jí)數(shù)的確定 223 接種齡與接種量 224 種子質(zhì)量判斷,2.2 生產(chǎn)車間種子制備,在種子罐中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲量增加、基質(zhì)消耗及代謝產(chǎn)物的積累，菌絲量不再增加，而逐漸趨于老化。 選擇適當(dāng)?shù)慕臃N齡顯得十分重要。,29,2.2.3 接種齡與接種量,30,接種齡： 指種子罐中培養(yǎng)的菌體，移入下一級(jí)種子罐或發(fā) 酵罐之前在原種子罐中的培養(yǎng)時(shí)間。 通常接種齡以菌體處于生命力極為旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且培養(yǎng)液中菌體量還未達(dá)到最高峰時(shí)為好。 種子過于年輕會(huì)出現(xiàn)： （1）前期生長(zhǎng)緩慢（2）整個(gè)發(fā)酵周期延長(zhǎng) （3）產(chǎn)物開始形成時(shí)間晚。 種子過于衰老：生產(chǎn)能力下降，引起菌絲過早自溶。,2.2.3 接種齡與接種量,2.2.3 接種齡與接種量,不同品種或同一品種的工藝條件不同，其接種齡是不一樣的。 一般要經(jīng)過多次試驗(yàn)、考察其發(fā)酵罐中產(chǎn)量的多少來確定最適的接種齡。,31,接種齡對(duì)嗜堿性芽孢桿菌 產(chǎn)堿性蛋白酶的影響,32,接種量：是指移入的種子液體積（V1）和接種后培養(yǎng)液體積（V1+V2）的比例（V1/ V1+V2）。 接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)繁殖的速度。 一般接種量：5-15，過大過小都不好，最終以實(shí)踐定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認(rèn)為大一點(diǎn)好。,2.2.3 接種齡與接種量,接種量較大：可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖到達(dá)高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來。 這是由于種子量多，同時(shí)種子液中含有大量體外水解酶類，有利于對(duì)基質(zhì)的利用，并且生產(chǎn)菌迅速被占據(jù)了整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境，則對(duì)減少雜菌生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)。 接種量過多：往往使菌絲生長(zhǎng)過快、培養(yǎng)液粘度增加，造成溶解氧不足，而影響產(chǎn)物的合成。 接種量過少：延長(zhǎng)發(fā)酵周期，往往還會(huì)引起其他不正常情況，如產(chǎn)生大量菌絲團(tuán)，而使產(chǎn)量降低。,33,34,接種量對(duì)堿性蛋白酶產(chǎn)生的影響,近年來，生產(chǎn)上多以加大種子量及采用豐富培養(yǎng)基作為獲得高產(chǎn)的措施。 獲得高產(chǎn)的其它措施： 雙種法：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中?？敲顾厣a(chǎn)中采用雙種比單種的發(fā)酵單位提高8%，而且達(dá)到產(chǎn)量高峰的時(shí)間提前。 倒種法：以適宜的發(fā)酵液倒出適量給另一發(fā)酵罐作種子，一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。 鏈霉素酵中，使用倒種法比單種的發(fā)酵單位提高19%。而四環(huán)素發(fā)酵采用雙種效果并不顯著。,35,36,221 菌種移接 222 種子罐級(jí)數(shù)的確定 223 接種齡與接種量 224 種子質(zhì)量判斷,2.2 生產(chǎn)車間種子制備,菌種在種子罐中的培養(yǎng)時(shí)間較短，可供分析的參數(shù)較少，種子的內(nèi)在質(zhì)量難以控制。 為了保證各級(jí)種子移種前的質(zhì)量，除了保證規(guī)定的培養(yǎng)條件外，在過程中還要定期取樣，測(cè)定一些參數(shù)以觀察基質(zhì)的代謝變化及菌絲形態(tài)是否正常。,37,2.2.4 種子質(zhì)量判斷,38,生產(chǎn)中通常測(cè)定的參數(shù)：,pH值； 磷、糖及氨基氮的含量； 菌絲形態(tài)、菌絲濃度、培養(yǎng)液外觀（色素、顆粒等）； 其它如酶活等；,用酶活力來判斷種子的質(zhì)量是一種新的嘗試。如土霉素 發(fā)酵中，種子液的淀粉酶活力與發(fā)酵單位有一定關(guān)系。,39,表 淀粉液化速度同龜裂鏈霉菌合成土霉素能力的關(guān)系,40,2.3.1 原材料質(zhì)量 原料質(zhì)量波動(dòng)是種子質(zhì)量不穩(wěn)定的主要原因 1）產(chǎn)地、品種、加工方法及用量，水質(zhì)硬 度等； 2）原材料質(zhì)量波動(dòng)，起主要作用的是無機(jī)離子含量不同。,2.3 影響種子質(zhì)量的因素,2.3.2 培養(yǎng)條件 1）溫度：顯著影響斜面孢子質(zhì)量 2）濕度：對(duì)斜面孢子質(zhì)量有較大影響 3）通氣量：需要足夠的通氣量 2.3.3 孢子斜面冷藏時(shí)間,41,42,2.4 種子質(zhì)量控制措施,種子質(zhì)量的最終指標(biāo)：考察其在發(fā)酵罐中所表 現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。 首先，必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性； 其次，是提供種于培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌 侵入，以獲得優(yōu)良種子。,1）保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性 檢查穩(wěn)定性方法： 取出少許保藏菌種置于滅菌生理鹽水中，逐級(jí)稀釋，在含有瓊脂培養(yǎng)基的雙碟上涂布培養(yǎng)，菌液稀釋度以雙碟上所生長(zhǎng)的菌落不至過密為宜。挑出形態(tài)整齊、孢子豐滿的菌落進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定其生產(chǎn)能力，以不低于其原有的生產(chǎn)能力為原則，并取生產(chǎn)能力高的菌種備用。 一般，不管用什么方法保藏菌種，一年左右都應(yīng)作自然分離一次。,43,44,2）保證無雜菌侵入通常方法：