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園藝植物生物技術(shù),第八章 園藝植物基因的分離克隆,主要內(nèi)容,文庫(kù)篩選法 圖位克隆技術(shù) 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法 基因差異表達(dá)技術(shù) 同源序列法 基因芯片技術(shù),第一節(jié) 文庫(kù)篩選,園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建 園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 目的基因的篩選,一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,(一)基因文庫(kù)的定義及類型 1.定義 一組DNA或cDNA序列克隆的集合體。 2. 類型 基因組文庫(kù): 植物基因組全部DNA片段組成的基因文庫(kù),反映基因組的全部遺傳信息。 cDNA文庫(kù): 將某一特定組織表達(dá)的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA組成的基因文庫(kù)，每個(gè)克隆只含1種mRNA信息,足夠數(shù)目克隆則包含細(xì)胞全部mRNA信息。 cDNA便于克隆和大量擴(kuò)增,不像基因組DNA含有內(nèi)含子很難表達(dá)。,一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,(二) 構(gòu)建的植物基因組文庫(kù)需要滿足的條件 文庫(kù)能夠覆蓋整個(gè)基因組; 插入的DNA片段比較大; 文庫(kù)易于保存且較穩(wěn)定,一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,(三) 載體的制備 1.完整的基因組文庫(kù)所需要篩選的重組子數(shù)目 N=In(1-P)/In(1-f) N,重組子的數(shù)量;P,所要求的概率;f,某一插入片段與相應(yīng)生物基因組大小的比值. 要以0.99的概充獲得番茄基因組(9.5108bp)20kb的插入片段,所需要篩選的重組子數(shù)為: N=In(1-0.99)/In1-(2104/9.5108)=2.2105,2. 載體的選擇 a)質(zhì)粒載體可承載15kb DNA左右片段(有效范圍為10kb) b)載體可承載25kb DNA左右片段(有效范圍為15kb) c)Cosmid載體可承載45kb DNA左右片段(有效范圍為40kb),一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,3.載體制備 要求:純度高,去磷酸效果好 去磷酸化是為了提高載體和目標(biāo)片段的連接效率 純度如果不高則會(huì)在重組克隆中含有大量的細(xì)菌基因組DNA,影響文庫(kù)的質(zhì)量.,一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,(四) 大片段基因組DNA的制備 要求:一般提取的DNA相對(duì)分子量至少應(yīng)該是文庫(kù)最終平均插入片段長(zhǎng)度的3-5倍 如插入片段達(dá)到100kb以上,則要求提取的基因組DNA 分子量要達(dá)到500kb以上 實(shí)踐證明:提取的基因組DNA分子量越大,得到的重組克隆的插入片段越大,一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,基因組DNA 的不完全酶切 1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合擇的限制性內(nèi)切酶 1) 四個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/256 2) 六個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/4096 2. 分離目的酶切片段大小的確定 1)克隆單個(gè)基因:10kb 2)克隆基因族:20kb,一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,基因組DNA 的不完全酶切 3. DNA不完全酶切條件的確定 1) 確定限制酶用量,改變酶切時(shí)間 2) 固定酶切時(shí)間,改變限制酶的用量,一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,DNA的不完全酶切,(五)大片段DNA(酶切片段)與克隆載體連接 1. 酶切片段的分離與純化 1)低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段 2)試劑盒回收目的片段,一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,(五)大片段DNA(酶切片段)與克隆載體連接 2.克隆載體連接 連接體系中的四種連接方式: 載體自連; 載體和基因組DNA片段連接;基因組DNA片段的自連和基因組片段之間連接 只有基因組DNA和載體之間的連接才是所需要的,如何提高它們之間的連接效率是連接反應(yīng)的關(guān)鍵. 可以通過調(diào)整載體與基因組DNA的比例來(lái)達(dá)到較好的效果.(載體與外源片段的比例為1:5-1:15),一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,基因組DNA片段3凹端的不完全補(bǔ)平的策略,(六)載體的遺傳轉(zhuǎn)化 電轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)化大腸桿菌使用最普通的一種手段 插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低 (七)克隆的挑取、驗(yàn)證 從文庫(kù)中隨機(jī)挑選一定量的克隆，搖菌，提取質(zhì)粒DNA，酶切脈沖電泳檢查插入片段的大小，并根據(jù)數(shù)目計(jì)算空載率。 細(xì)胞器DNA的污染會(huì)降低文庫(kù)的實(shí)際容載量，一般用線粒體和葉綠體的探針對(duì)文庫(kù)進(jìn)行檢測(cè)。,一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,(八) 文庫(kù)的擴(kuò)增、分裝及保存 1.基因組DNA文庫(kù)的保存 1)影印濾膜保存法,一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,(八) 文庫(kù)的擴(kuò)增、分裝及保存 2.文庫(kù)在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存 1)從瓊脂糖平板上挑取已長(zhǎng)出的克隆子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混合的細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-70儲(chǔ)存(加終濃度為25%的甘油). 缺點(diǎn):因文庫(kù)菌落生長(zhǎng)的不均勻性而導(dǎo)致文庫(kù)中某些特定的序列過多或過少.,一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,(八) 文庫(kù)的擴(kuò)增、分裝及保存 2.文庫(kù)在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存 2) 從平板上挑選單個(gè)克隆子接各種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-70或-25 下保存 缺點(diǎn)：需要保存的克隆子數(shù)過多，工作量大,一、園藝植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,真核生物基因組DNA十分龐大,其復(fù)雜程度是mRNA的100倍左右，而含有大量的重復(fù)序列。采用電泳分離和雜交的方法，都難以直接分離到目的基因。這是從染色體DNA為出發(fā)材料直接克隆目的基因的一個(gè)主要困難。高等生物一般具有105種左右不同的基因，但在一定時(shí)間階段的單個(gè)細(xì)胞或個(gè)休中，都只有15%左右的基因得以表達(dá)，產(chǎn)生約15000種不同的mRNA分子?？梢姡蒻RNA出發(fā)的cDNA克隆,其復(fù)雜程度要比直接從基因組克隆簡(jiǎn)單得多.,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,(一)普通cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 純化mRNA樣品的制備 選擇特定發(fā)育階段的特定組織為分離mRNA的材料。 mRNA的純化：利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴與olgo(dT)互補(bǔ)雜交,使mRNA固定在固相介質(zhì)上,再將mRNA洗脫下來(lái),制備出純屬化的mRNA樣品. mRNA樣品完整性的檢測(cè):根據(jù)28S和18S rRNA電泳條帶的亮度判斷RNA的完整性，從而間接地判斷mRNA的完整性。 如果28S rRNA條帶的亮度是18S的2倍,RNA樣品完整。 如果2條帶的亮度反過來(lái)，說(shuō)明RNA樣品部分降解。 如果無(wú)清晰的條帶，說(shuō)明RNA樣品已經(jīng)嚴(yán)重降解。,mRNA純化,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,(一)普通cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 2. cDNA第一鏈的合成 關(guān)鍵是獲得大量完整的cDNA拷貝 影響因素：模板mRNA的質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄酶、引物。 反轉(zhuǎn)錄酶：禽源(AMV)和鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLV)。 AMV：除具有DNA聚合酶活性外，還有很強(qiáng)的Rnase H酶活性。 M-MuLV: Rnase H活性比AMV低,但反轉(zhuǎn)錄效率比AMV低。 Superscript反轉(zhuǎn)錄酶:除去了MMLV的Rnase H活性,更能保證cDNA第一鏈的全長(zhǎng)和高產(chǎn)。 引物常用oligo(dT)和隨機(jī)六聚體核苷酸。,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,(一)普通cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 3. 雙鏈cDNA的合成 自身引導(dǎo)合成法 利用新合成的單鏈cDNA 3末端反轉(zhuǎn)所形成的發(fā)夾的雙鏈部分作為引物，引導(dǎo)DNA聚合酶以cDNA為模板，合成互補(bǔ)的第二鏈cDNA，反應(yīng)結(jié)束后，用S1核酸酶降解發(fā)夾環(huán)的單鏈部分，即可得到雙鏈的cDNA片段。 主要缺點(diǎn)是在用S1核酸酶去除發(fā)夾環(huán)時(shí)的反應(yīng)條件要求極為苛刻，難以控制，目前已極少采用。,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,(一)普通cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 3. 雙鏈cDNA的合成 置換合成法 利用Rnase H將雜交雙鏈中的mRNA降解,形成多段仍與cDNA第一鏈保持雜交的RNA片段. 利用這些RNA片段作為引物,引導(dǎo)合成第二鏈cDNA. 隨著合成產(chǎn)物的延伸,除5末端的RNA引物外,所有作為引物的RNA片段均被新合成的互補(bǔ)鏈所置換. 通過DNA連接酶作用,將各段互補(bǔ)鏈連接成完整DNA鏈。 除去殘存的5末端RNA片段，并用T4DNA聚合酶削平3端突出的單鏈cDNA,得到一個(gè)雙鏈形式的cDNA片段. 該方法直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物,避免了中間處理和純化過程造成的cDNA損失,是目前合成cDNA第二鏈的常用方法.,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,(一)普通cDNA的合成 3. 雙鏈cDNA的合成 同聚物引導(dǎo)法 在第一鏈的3端用末端轉(zhuǎn)移酶加上一段同聚體dG。 以oligo(dC)為引物合成第二鏈. 該法最大的缺點(diǎn)是獲得的cDNA5端上游有一段dG:dC殘基,可能會(huì)抑制表達(dá)過程中DNA的轉(zhuǎn)錄.但該法在最佳條件下可高交克隆mRNA的5端序列.,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,(一)普通cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 4. 雙鏈cDNA的克隆 cDNA的修飾 為了提高雙鏈cDNA片段與載體的連接效率,需要對(duì)cDNA進(jìn)行修飾,即給平端的雙鏈cDNA片段添加銜接頭。 所謂銜接頭是人工合成的含有限制酶酶切位點(diǎn)的短雙鏈DNA片段，或者一端為限制酶粘性末端的雙鏈DNA片段。用前一種銜接頭連接后，為了避免限制酶對(duì)cDNA片段內(nèi)部可能出現(xiàn)的酶切位點(diǎn)的切割,在添加銜接頭之前,文庫(kù)cDNA需經(jīng)甲基化酶處理。 添加后一類型的銜接頭時(shí)，不必對(duì)文庫(kù)cDNA進(jìn)行修飾.,合成接頭和銜接頭,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,(一)普通cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 4. 雙鏈cDNA的克隆 cDNA的克隆 將制備的cDNA成功克隆到載體中去的關(guān)鍵問題是cDNA和載體的比例. 必須尋找一個(gè)適當(dāng)?shù)谋壤员苊鈫蝹€(gè)重組體中含有多個(gè)串聯(lián)cDNA分子或產(chǎn)生過高的非重組背景. 為提高連接反應(yīng)效率,可在連接混合物中加適量PEG 8000. 建成的cDNA文庫(kù)一般應(yīng)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定并擴(kuò)增,以利多次篩選并長(zhǎng)期保存.,cDNA文庫(kù)構(gòu)建流程示意圖,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,(一)普通cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 6. 普通cDNA文庫(kù)存在的主要不足 低豐度表達(dá)序列在文庫(kù)中出現(xiàn)的幾率很低,要想得到低豐度表達(dá)基因,至少要篩選106個(gè)克隆. 構(gòu)建普通cDNA文庫(kù)所需的mRNA量比較大,達(dá)到數(shù)微克. 篩選普通cDNA文庫(kù)的工作復(fù)雜,需要很長(zhǎng)時(shí)間,限制了基因克隆的速度.,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,(二)新型cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 1. PCR介導(dǎo)的cDNA文庫(kù) 原理: 以cDNA第一鏈為模板,設(shè)計(jì)一組引物,通過PCR擴(kuò)增獲得多拷貝雙鏈cDNA。 優(yōu)點(diǎn)：增加低豐度mRNA的克隆機(jī)會(huì);利用僅有的幾個(gè)細(xì)胞或微量的mRNA建立較大的cDNA文庫(kù)。 缺點(diǎn)：PCR合成的片段一般較短，大片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增困難；擴(kuò)增過程中錯(cuò)誤摻入率甚高；由于PCR對(duì)短片段的擴(kuò)增效率高于長(zhǎng)片段，故mRNA的原始豐度難以在文庫(kù)中體現(xiàn)。 應(yīng)用：適合于克隆來(lái)源困難的組織或細(xì)胞的基因。,(二)新型cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 2. 標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù) 定義:某一特定組織或細(xì)胞的所有表達(dá)基因均包含其中,且含量相等的cDNA文庫(kù)。 優(yōu)點(diǎn)： 增加了克隆豐度極低的mRNA的機(jī)會(huì)。 能發(fā)現(xiàn)普通cDNA探針?biāo)荒馨l(fā)現(xiàn)的稀有轉(zhuǎn)錄區(qū)。 能估計(jì)大多數(shù)基因的表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)組織特異性基因。,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,(二)新型cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 2. 標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù) 構(gòu)建方法 用基因組DNA做選擇雜交,所捕獲的cDNA豐度與對(duì)應(yīng)的基因組DNA豐度一致,其缺點(diǎn)是約20%的非單一拷貝基因在構(gòu)建的文庫(kù)中豐度偏高。 根據(jù)cDNA退火的二級(jí)動(dòng)力學(xué)特征，即稀有拷貝的cDNA較豐度拷貝的cDNA復(fù)性或雜交慢,使未復(fù)性部分的單鏈cDNA漸趨等化。,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,(二)新型cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 3. 染色體或區(qū)域特異性cDNA文庫(kù) 用某一染色體或基因組區(qū)DNA與合成的cDNA池或已構(gòu)建的cDNA文庫(kù)雜交,將捕獲的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,便可構(gòu)建染色體或區(qū)域特異性cDNA文庫(kù)。 其中的cDNA或定位于該染色體上或與之有同源性。 染色體顯微切割技術(shù)的發(fā)展使得構(gòu)建的文庫(kù)更狹窄，更具特異性。,二、園藝植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,(二)新型cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 4. 消減cDNA文庫(kù) 又稱差示文庫(kù),常用于克隆不同組織或同一組織在不同的生理狀態(tài)下表達(dá)有差異的基因. 在一定條件下用過量不含目的基因的驅(qū)動(dòng)(driver)與含有目的基因的試驗(yàn)方(tester)進(jìn)行雜交,將含有目的基因的未雜交部分收集后構(gòu)建相應(yīng)的文庫(kù)。 由于消減cDNA文庫(kù)的富集作用,使所需篩選的克隆數(shù)減少幾十到上百倍.,基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較,基因組DNA文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn),相對(duì)于cDNA文庫(kù), 基因組文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn): cDNA克隆只能反映著mRNA的分子結(jié)構(gòu),沒有包括基因組的間隔序列; cDNA文庫(kù)中, 不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著mRNA的分布狀態(tài),即:高豐度mRNA的cDNA克隆,所占比例較低,分離基因困難; 從cDNA克隆中,不能克隆到基因組DNA中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)段序列，不能用于研究基因編碼區(qū)外側(cè)調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能。,cDNA文庫(kù)的主要優(yōu)點(diǎn),cDNA文庫(kù)以mRNA為材料,特別適用天某些mRNA病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離. cDNA文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行。 每一個(gè)cDNA文庫(kù)都含有一種mRNA序列,這樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率就會(huì)比較低,因此,陽(yáng)性雜交信號(hào)一般是有意義的,由此選擇出來(lái)的陽(yáng)性克隆將會(huì)含有目的基因. cDNA文庫(kù)可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的基因的克隆,直接應(yīng)用于基因工程操作. cDNA克隆還可用于真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究.,cDNA克隆的主要缺點(diǎn),cDNA文庫(kù)所包含的遺傳信息要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于基因組DNA文庫(kù),并且受細(xì)胞來(lái)源或發(fā)育時(shí)期的影響。 cDNA文庫(kù)雖能反映mRNA的分子結(jié)構(gòu)和功能信息,但不能直接獲得基因內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面信息。 在cNDA文庫(kù)中,相應(yīng)于高豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例比較高,分離起來(lái)比較容易,而相應(yīng)于低豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例則比較低,因此,分離也就比較困難。,三、目的基因的篩選,1. 根據(jù)目的基因的核苷酸序列篩選 根據(jù)基因序設(shè)計(jì)引物,以基因組DNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄的cNDA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.如果得到的只是基因部分序列,可以將其克隆至載體,作為探針篩選cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)獲得全長(zhǎng)基因. 用探針直接篩選庫(kù),若能得到其它植物已分離的相關(guān)基因,則可以直接用作探針篩選cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù),獲得研究植物的目的基因.,三、目的基因的篩選,2. 根據(jù)目的基因的核苷酸序列篩選 如果已知基因表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的氨基酸序列,就可以反推出原來(lái)基因的核苷酸序列。 從N端對(duì)10多個(gè)連續(xù)的氨基酸進(jìn)行序列測(cè)定，選擇連續(xù)6個(gè)以上簡(jiǎn)并程度最低的氨基酸，按各種可能的序列結(jié)構(gòu)合成寡核苷酸探針庫(kù)，從cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)中篩選全長(zhǎng)的基因. 缺點(diǎn):在實(shí)驗(yàn)中得到純度高、數(shù)量足夠的目的基因表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))是很困難的,蛋白質(zhì)測(cè)序也花費(fèi)較高,難度較大.,三、目的基因的篩選,3. PCR法篩選基因文庫(kù) 將基因文庫(kù)分裝96孔培養(yǎng)板. 培養(yǎng)一段時(shí)間后，分別從同一行或同一列孔中吸取少量培養(yǎng)物合并。 以此混合物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)凝膠電泳的結(jié)果判定相應(yīng)行或列混合孔中是否含有陽(yáng)性克隆。 對(duì)含有陽(yáng)性克隆的行或列孔中培養(yǎng)物再次分裝，經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。 如此反復(fù)操作，直至獲得陽(yáng)性克隆。,第二節(jié) 圖位克隆技術(shù),一、分離基因的程序 二、優(yōu)缺點(diǎn),一、分離基因的程序,(一) 圖位克隆技術(shù)的定義及原理 定義:根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上的位置進(jìn)行基因克隆的一種方法. 原理:首先找到一個(gè)是以與目標(biāo)基因相連的DNA分子標(biāo)記,然后通過染色體步移技術(shù)克隆分離出目標(biāo)基因. 當(dāng)基因與標(biāo)記之間的距離小于基因組文庫(kù)中克隆的平均插入片段大小時(shí),就要可直接篩選到含有目標(biāo)基因的克隆,這種方法稱為染色體登陸(chromosome landing ),一、分離基因的程序,(二) 分離基因的程序 目的基因的初步定位 利用分子遺傳圖譜確定與目的基因連鎖的分子標(biāo)記。 目的基因區(qū)域的物理作圖 將分子標(biāo)記之間的遺傳距離（cM）轉(zhuǎn)化為物理距離(堿基數(shù)),構(gòu)成該基因區(qū)域的物理圖譜. 構(gòu)建并篩選含有大插入片段的基因組文庫(kù). 用與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選大片段基因組文庫(kù)，獲得陽(yáng)性克隆。,一、分離基因的程序,(二) 分離基因的程序 構(gòu)建目的基因區(qū)域跨疊克隆群 以陽(yáng)性克隆的末端作為探針篩選基因組文庫(kù)，獲得含有目標(biāo)基因兩側(cè)分子標(biāo)記的大片段跨疊群 目的基因的精細(xì)定位和染色體登陸 以目標(biāo)基因兩側(cè)的分子標(biāo)記為探針，通過染色體登陸獲得含目標(biāo)基因的陽(yáng)性克隆。 外顯子的分離和鑒定 利用篩選cDNA文庫(kù),外顯子捕捉等技術(shù)獲得候選基因，通過功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確定目標(biāo)基因。,二、優(yōu)缺點(diǎn),主要應(yīng)用于基因組較小、分子標(biāo)記連鎖圖密度較高和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)比較穩(wěn)定成熟的植物。 對(duì)于基因組較大，重復(fù)序列較多的園藝植物，圖位克隆法要步移大量的DNA片段，投資大，效率低；而DNA大片段插入文庫(kù)含有許多嵌套克隆或克隆后的重排現(xiàn)象等原因，使得染色體步移十分困難。 對(duì)于這些植物，可以通過構(gòu)建高密度的分遺傳圖譜和尋找物理距離目的基因很近的分子標(biāo)記，使得染色體步移的距離大大縮小。,第三節(jié) 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法,一、轉(zhuǎn)座子的分類 二、分離基因的程序 三、優(yōu)缺點(diǎn) 四、T-DNA標(biāo)簽法,一、轉(zhuǎn)座子的分類,（一）轉(zhuǎn)座子的定義與功能 1. 定義 染色體上一段可以移動(dòng)的DNA序列，可以從一個(gè)基因座位轉(zhuǎn)移到另一個(gè)基因座位。 2. 功能 當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到某個(gè)功能基因的內(nèi)部或鄰近位點(diǎn)時(shí)，就會(huì)使插入位置的基因失活并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型；而當(dāng)轉(zhuǎn)座子切離時(shí)，又使目的基因恢復(fù)活性。,一、轉(zhuǎn)座子的分類,（二）轉(zhuǎn)座子的分類 1。DNA轉(zhuǎn)座子 通過DNA復(fù)制和直接切離兩種方式獲得可轉(zhuǎn)移片段，重新插入基因組DNA中。 2。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 由RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座子，即作為DNA的轉(zhuǎn)座子首先被轉(zhuǎn)錄為RNA，再借助反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成DNA，插入到新的染色體位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座過程的。,二、分離基因的程序,采取農(nóng)桿菌介導(dǎo)等適當(dāng)轉(zhuǎn)化方法反轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入目標(biāo)植物，設(shè)法將轉(zhuǎn)座子插入到目標(biāo)基因內(nèi)部或鄰近位點(diǎn)，引起表型突變。 通過表型篩選獲得純合突變株。 構(gòu)建純合突變株的核基因組文庫(kù)。 以轉(zhuǎn)座地子片段作為探針，從該基因組文庫(kù)中篩選含轉(zhuǎn)座子片段的克隆。 以該克隆作探針，篩選另一正常植株的核基因組文庫(kù)，獲得完整的正常目的基因。,三、優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法可在不了解基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和表達(dá)模式的情況下分離植物基因。 局限性 該技術(shù)的前提條件是要篩選出轉(zhuǎn)座子插入的突變體。在實(shí)際操作中，由于轉(zhuǎn)座頻率往往很低，因此，需要篩選的突變體群體較大。 對(duì)于那些須在特定環(huán)境或特定發(fā)育階段才有突變表型的基因，往往由于看不到明顯的突變表型而被忽略。 由于基因的功能補(bǔ)償?shù)葯C(jī)制的作用，即使有些基因產(chǎn)生了插入突變，也可能看不到突變表型，因而不能運(yùn)用該方法。,T-DNA標(biāo)簽法,原理：T-DNA能夠從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定地整合到植物宿主的基因組中，從而使整合位置上的基因失活或產(chǎn)生突變，通過T-DNA上的標(biāo)記基因（如GUS等基因）就可檢測(cè)突變位置，得到與T-DNA相連的DNA片段，以此制備探針篩選野生型基因文庫(kù)，就可得到與突變相應(yīng)的完整基因。 缺點(diǎn) 由于T-DNA的可移動(dòng)性，不易獲得較穩(wěn)定的突變遺傳系。 由于高等植物基因組中大量的重復(fù)序列存在，也降低了獲得目標(biāo)突變體的效率，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。,第四節(jié) 基因差異表達(dá)技術(shù),一、mRNA差異顯示技術(shù) 二、抑制性消減雜交技術(shù) 三、代表性差異分析法 四、基因表達(dá)系列分析 五、cDNA-AFLP技術(shù),一、mRNA差異顯示技術(shù),1. 原理 根據(jù)大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA的3端具有poly(A)結(jié)構(gòu),利用含oligo(dT)的寡聚核苷酸作為引物，將總mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后通過PCR技術(shù)和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離差異cDNA片段,從而篩選出目的基因.,一、mRNA差異顯示技術(shù),2. 基本步驟 從不同植物或組中提取總mRNA. 用oligo(dT)12MN為引物(其中,M=G/C/A,N=G/C/T/A),在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,將mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA. 用與反轉(zhuǎn)錄相同的錨定引物和由10個(gè)堿基組成的隨機(jī)引物對(duì)生成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳在相鄰泳道上分析,找到差異表達(dá)的cDNA條帶. 加收差異表達(dá)的條帶,將其作為探針進(jìn)行Northern雜交或篩選cDNA文庫(kù),獲得差異表達(dá)的基因全長(zhǎng).,一、mRNA差異顯示技術(shù),3. 優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 在基因序列未知的情況下，直接用來(lái)鑒定和克隆差異表達(dá)基因，具有簡(jiǎn)便，快速，RNA用量少，效率高等優(yōu)點(diǎn)。 主要用于比較兩種以上特定生理狀態(tài)或不同發(fā)育階段的mRNA樣品間基因表達(dá)的差異. 缺點(diǎn) 假陽(yáng)性特別高，可達(dá)70%，增加了后續(xù)工作的難度。 由于PCR的敏感性，mRNA差異顯示技術(shù)重復(fù)性較差. 擴(kuò)增片段較小(110-500bp),不能代表差異表達(dá)的基因. 只能擴(kuò)增靠近Poly(A)mRNA3端不大于600bp的區(qū)域。 對(duì)高拷貝mRNA有較強(qiáng)的傾向性，不能用于低拷貝的mRNA.,二、抑制性消減雜交技術(shù),1. 原理 以抑制PCR為基礎(chǔ)的cDNA消減雜交. 所謂抑制PCR是利用非目標(biāo)基因片段兩端的長(zhǎng)方向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，無(wú)法作為模板與引物配對(duì)，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴(kuò)增。,二、抑制性消減雜交技術(shù),2.基本步驟 提取含有目的基因的待測(cè)組織(tester)和不含目的基因的對(duì)照組織(driver)的mRNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA. 用限制性內(nèi)切酶將兩種不同的cDNA切割為小片段. 將test cDNA分為兩份,分別連接不同的接頭。 用過量的driver cDNA分別與這兩種test cDNA進(jìn)行第一次消減雜交,會(huì)產(chǎn)生:單鏈tester,雙鏈tester/tester,雙鏈tester/driver,單鏈driver及 雙鏈driver/driver,二、抑制性消減雜交技術(shù),2. 基本步驟 混合兩份雜交樣品,并加入新的變性driver cDNA進(jìn)行第二次消減雜交,從而形成一種新的雜交組分,即分別含有不同接頭的雙鏈cDNA分子(tester-adaptor 1/tester-adaptor 2). 補(bǔ)平變性后分子的黏性末端. 以接頭1和接頭2序列為引物對(duì)其進(jìn)行第一輪PCR。 用與接頭內(nèi)側(cè)序列互補(bǔ)的另一對(duì)引物進(jìn)行第二輪PCR，富集差異表達(dá)的目的基因片段。 用第二輪PCR產(chǎn)物構(gòu)建相應(yīng)的差減cDNA文庫(kù)，克隆差異表達(dá)基因。,二、抑制性消減雜交技術(shù),優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 假陽(yáng)性率大大降低，陽(yáng)性檢出率為50%以上； 目的序列富集程度較高，且豐度相對(duì)一致，確保了低豐度表達(dá)的cDNA有被檢測(cè)的可能極大地提高了檢測(cè)效率; 靈敏度高,重復(fù)性強(qiáng). 缺點(diǎn): 需要較多的起始材料的mRNA,因而某些特殊樣本不容易獲得; 更多地依賴于PCR技術(shù); 不能同時(shí)對(duì)數(shù)個(gè)材料進(jìn)行比較; 材料之間存在的過多差異及小片段缺失也不能有效地被檢測(cè).,三、代表性差異分析法,1. 原理 以差減雜交為基礎(chǔ)，從基因組水平篩選和克隆基因的方法； 充分利用了PCR反應(yīng)中雙引物以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈模板，而單引物僅以線性形式擴(kuò)增單鏈模板這一特性，并通過降低cDNA群體復(fù)雜性和多次更換cDNA兩端接頭等方法,特異地?cái)U(kuò)增目的基因片段.,三、代表性差異分析法,2. 基本步驟 分別提取試驗(yàn)組T和驅(qū)動(dòng)組D的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后加上接頭，以接頭特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶切除去接頭后，給T組酶切產(chǎn)物連上新的接頭，使之區(qū)別于D組的cDNA. 用過量的D組酶切產(chǎn)與經(jīng)修飾過的T組cDNA混合,經(jīng)變性,退火復(fù)性后形成T-D異源雜交分子,T-T同源雜交分子和D-D同源雜交分子. 利用T組新接頭的特異接頭引物時(shí)行PCR擴(kuò)增,T-T同源雜交分將得到有效擴(kuò)增. 重復(fù)2-3次差異雜交步驟,盡可能去除共有序列，對(duì)差異表達(dá)基因片段進(jìn)行更有效的富集。 克隆差異表達(dá)基因.,代表性差異分析法示意圖,三、代表性差異分析法,優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 免去了物方法分離單，雙鏈的繁瑣操作，通過接頭修飾設(shè)計(jì)，借助PCR技術(shù)即能使目的片段得有效擴(kuò)增，減少假陽(yáng)性。 差減雜交在擴(kuò)增后的cDNA群體之間進(jìn)行,不再受供試的mRNA量的限制,拓寬了差減雜交的應(yīng)用范圍. 一次實(shí)驗(yàn)可以分離得到多個(gè)在T組和D組間差異表達(dá)基因的cDNA克隆,并能發(fā)現(xiàn)與表型相關(guān)的異常基因,檢測(cè)基因的上調(diào)和下調(diào)表達(dá).,三、代表性差異分析法,優(yōu)缺點(diǎn) 缺點(diǎn): 目的基因間豐度的差異在數(shù)輪差減雜交后的群體中保留了下來(lái),在后續(xù)的篩選中,高豐度的差異基因容易得到,低豐度的差異基因不易檢出，而低豐度的表達(dá)產(chǎn)物往往代表相對(duì)重要的基因； 分離出來(lái)的差異基因也可能與其表型無(wú)關(guān)，增加了后續(xù)鑒定的工作量； 對(duì)樣品T組和D組的純度要求很高，如果兩組材料間差別較大，則用此方法將達(dá)不到鑒定差別表達(dá)基因的目的。,第五節(jié) 同源序列法,基于同源序列的候選基因法 cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù),一、基于同源序列的候選基因法,1. 基本策略 根據(jù)已知基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，以待分離些基因的植物基因組DNA或cDNA為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并與已知基因進(jìn)行序列比較,從而確定該基因是否為待分離基因。 用已知序列的基因制備探針，篩選待分離基因的植物核DNA或cDNA文庫(kù).再對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,并與已知基因序時(shí)行同源性比較,最后經(jīng)轉(zhuǎn)化鑒定是否為待分離的基因。,一、基于同源序列的候選基因法,2. 需要注意的問題 由于密碼子的簡(jiǎn)并性和不同的同源序列間同源程度的差異,簡(jiǎn)并引物的特異性要設(shè)計(jì)得當(dāng). 由于同源序列并不專屬于某一基因家族,因而擴(kuò)增產(chǎn)物不一定是某一基因家簇成員. 基因家族成員往往成簇存，克隆的基因片段是否為目的基因需進(jìn)一步轉(zhuǎn)鑒定。,二、cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù),1.基本步驟 從GenBank等公共數(shù)據(jù)庫(kù)中,比較分析待克隆基因的保守序列區(qū)段。 以此保守序列設(shè)計(jì)特異或簡(jiǎn)并引物，從待測(cè)植物組織的cDNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得待分離基因的cDNA片段. 通過RACE技術(shù)獲得cDNA的5和3端,并與已知基因序列進(jìn)行同源性比較. 轉(zhuǎn)化鑒定是否為待分離的基因。,二、cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù),2. 3RACE 利用絕大部分mRNA的3末端具有poly(A),以oligo(dT)和一個(gè)接頭組成的接頭引物(adaptor primer,AP)反轉(zhuǎn)錄mRNA,得到加接頭的第一鏈cDNA 根據(jù)已獲得的待分離基因cDNA片段設(shè)計(jì)兩條特異引物GSP1(gene specific primer 1,GSP1)和GSP2，分別與已知的接頭引物進(jìn)行巢式擴(kuò)增，從而獲得該基因的3端。,3RACE技術(shù)示意圖,二、cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù),3. 5RACE 經(jīng)典方法 用待分離基因的反向特異引物GSP反轉(zhuǎn)錄總RNA為第一鏈cDNA,在未知的cDNA的5端加上一個(gè)接頭. 再用GSP和接頭引物PCR擴(kuò)增出待分離基因的5端。 環(huán)化5RACE 設(shè)計(jì)目的基因5磷酸化的反向特異引物GSP0，并在其遠(yuǎn)端(靠近5端)設(shè)計(jì)兩條反向特異引物GSP1和GSP2,，在其近端(靠近3端)設(shè)計(jì)兩條正向特異引物GSP3和GSP4。 用GSP0反轉(zhuǎn)錄總RNA為第一鏈cDNA,然后通過T4 RNA連接酶環(huán)化cDNA,并以此環(huán)化cDNA為模板用GSP1和GSP4與GSP2和GSP3進(jìn)行兩輪巢式PCR擴(kuò)增，從而獲得待分離基因的5端。,5環(huán)化RACE技術(shù)示意圖,二、cDNA末端快速