微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課題設(shè)計方案

海南師范大學(xué) 從環(huán)境中分離放線菌實(shí)驗(yàn)設(shè)計方案專業(yè)：生物科學(xué)班級：2010級一班組長：陳麗娟組員：李萬蕊、曹露露、朱嘉寧時間：2012年5月24日3一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)從土壤中分離放線菌的方法。2、練習(xí)、掌握微生物接種、移植和培養(yǎng)的基本技術(shù)。掌握無菌操作技術(shù)。3、掌握無菌操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理 放線菌是原核生物，是重要的抗生素產(chǎn)生菌，在土壤中的數(shù)量僅次于細(xì)菌，尤其在有機(jī)質(zhì)豐富、透氣性好的中性到微堿性土壤中的數(shù)量較多1。土壤顆粒的分散程度對于分離放線菌也有影響。錢恒段等2報道，用膽酸鈉處理土壤懸液后土壤分散效果較好，且優(yōu)于純蒸餾水。這可能是因?yàn)槟懰徕c對土壤腐殖質(zhì)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力從而有利于破壞土壤團(tuán)聚結(jié)構(gòu)。據(jù)楊宇容等3報道,重鉻酸鉀對土壤真菌、細(xì)菌的抑制作用較明顯，然而對放線菌并無抑制作用。而且其價格低廉，如安德榮等4報道其可作為理想的放線菌分離抑制劑。徐成勇等5實(shí)驗(yàn)證明酵母膏、SDS（十二烷基硫酸鈉）也有抑菌的作用。本實(shí)驗(yàn)所用方法為綜合徐成勇等5及錢恒段等2實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得。三、實(shí)驗(yàn)材料1、樣品 干燥的營養(yǎng)基質(zhì)豐富的苗圃土2、儀器鏟子、牛皮紙、搪瓷杯、錐形瓶、玻璃棒、燒杯、小試劑瓶、標(biāo)簽紙、移液管、接種環(huán)、試管、記號筆、酒精燈、電子天平、電爐、恒溫培養(yǎng)箱、加壓蒸汽滅菌鍋、電熱干燥烘箱3、培養(yǎng)基及試劑配制（1）培養(yǎng)基（高氏一號瓊脂+重酪酸鉀培養(yǎng)基)配制:配方：可溶性淀粉20g、K2HPO4 0.5g、1mol/LNaOH、MgSO47H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO47H2O 0.01g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml、250mg重酪酸鉀、PH7.27.4。步驟：用搪瓷杯先量取500ml自來水在電爐上加熱。根據(jù)配方，依次稱取各種藥品加入搪瓷杯中，攪拌均勻?？扇苄缘矸鄯Q入燒杯中，加入50ml自來水調(diào)成糊狀，待培養(yǎng)液煮沸時加入淀粉糊，邊加邊攪拌，防止糊底。之后，加入瓊脂煮沸至完全溶化，補(bǔ)足1000ml水量。接著，緩慢加入NaOH液，邊加入邊攪勻培養(yǎng)液，然后用PH試紙測其酸堿值，調(diào)PH至7.27.4。趁熱分裝于8個三角瓶中，塞好棉塞。用牛皮紙包扎好，貼好標(biāo)簽。最后，高壓蒸汽滅菌，121滅菌30min.（2）試劑配制： 1mol/LNaOH、6%酵母膏和用5 mmol / L 磷酸緩沖液稀釋的0.05% SDS 四、實(shí)驗(yàn)方案1、土樣的采集及處理（1）方法：在苗圃，按對角交叉（五點(diǎn)法）取樣。先出去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取210cm處的土壤于疊好的牛皮紙袋里。將土樣放入三角瓶中，加入少量膽酸鈉，再加適量蒸餾水振蕩溶解制成土壤懸浮液。調(diào)節(jié)稀釋液的PH為7，略微加熱后冷卻至40。之后，再加6%酵母膏和用5 mmol / L 磷酸緩沖液稀釋的0.05% SDS震蕩20min。（2）原理：放線菌在較干燥的，營養(yǎng)基質(zhì)較豐富的中性或微堿性土壤中分布較多；膽酸鈉有利于分散土壤顆粒；一定濃度的酵母膏和SDS有抑制細(xì)菌、真菌的作用。（3）注意：所取的土樣不可過濕，防止樣品中雜菌過多；至土壤稀釋液時要振蕩充分，是土樣與水充分混合，將菌分散。2、 器材滅菌蒸汽滅菌制備無菌水。干熱滅菌9個錐形瓶、平皿10個、玻璃棒3個、移液管3個、10個試管3、 分離（1）方法：將處理后的土壤懸浮液稀釋100倍備用。加熱已制備并滅菌好的高氏合成1號瓊脂+重酪酸鉀培養(yǎng)基，在無菌條件下倒10個平板然后，貼好標(biāo)簽，冷卻。用平板稀釋法6（稀釋度從10-3到10-5,濃度設(shè)置見）將菌種接種在高氏合成1號瓊脂+重酪酸鉀的平板培養(yǎng)基上,28培養(yǎng)57d。（2）原理：見上文實(shí)驗(yàn)原理。（3）注意：稀釋樣品時要在無菌條件下進(jìn)行；每個稀釋度做23個培養(yǎng)皿，并做好標(biāo)記；實(shí)驗(yàn)中要留一個空白對照；注意劃線時的操作。 4、純化（1）方法：57天后，加熱培養(yǎng)基，倒斜面。選擇挑取效果較好的菌落用接種環(huán)接種于高氏1號斜面，28培養(yǎng)57d。（2）原理：放線菌的群體特征7：小型、干燥、不透明、與培養(yǎng)基連接緊密，難以挑取，表面呈致密的絲絨狀，上有一薄層彩色“干粉”，正反面顏色不一致，邊緣瓊脂平面有變形。（3）注意：實(shí)驗(yàn)過程要做好標(biāo)記。五、實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果由于時間有限，不能對土樣進(jìn)行風(fēng)干，可能會影響分離得到的放線菌的純度。而且可能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行不到純化這一步，僅停留在分離就必須終止實(shí)驗(yàn)。但是由于預(yù)先對土樣進(jìn)行的充分的處理，培養(yǎng)時也選用了針對放線菌的培養(yǎng)基并且加入了有效的抑制劑，即使沒有純化，分離后也可達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。參考文獻(xiàn)1 趙斌,何紹江,等.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)M.北京:科學(xué)技術(shù)出版社,2002.2 錢恒段,淑蓉.放線菌選擇性分離方法綜述 J .安徽農(nóng)學(xué)通報,Anhui Agri.Sci.Bull.2011,17（15):6061.3 楊宇容,徐麗華,李啟任等.放線菌分離方法的研究 J .微生物學(xué)通報,1995,22(2):8891.4 安德榮,慕小倩,劉翠娟,趙文軍,等.土壤拮抗放線菌的分離和篩選 J .微生物學(xué)雜志,2002,22(5):13.5 徐成勇,袁野,黎丹輝,夏歡耕,諸葛健.選