2013.4.15瘧原蟲血片制作染色.pptVIP

2019/6/30,1,瘧原蟲血片制作及染色技術(shù),湖北省疾病預(yù)防控制中心,血片制作所需設(shè)備,載玻片 具有磨砂面，且規(guī)格是玻片寬度乘長度在25.2*75.2mm，厚度1mm1.2mm為好。 推玻片 有專用的。但現(xiàn)在一般選擇邊緣光滑整齊的載玻片替代推玻片。 采血針 使用一次性的采血針。 玻片盒 木制/塑料均可以。 75%酒精棉球 用于采血部位的消毒。 記號筆/B2鉛筆 用于載玻片上編寫號碼。 Whatman(沃特曼)903號；將濾紙切成10*2cm大小的紙片，以口徑為1.2cm的大孔管，在濾紙上壓出兩個圓形印跡備用。,2019/6/30,3,載玻片的清洗,載玻片 用以涂制血膜的載玻片，必須清潔無油跡。有油跡的載玻片涂制的厚血膜容易脫落，薄血膜涂不均勻。 新玻片處理 應(yīng)浸于有液態(tài)洗滌劑清水中1020分鐘，然后用干凈棉巾逐個擦拭，再用清水沖洗干凈，晾干后用干凈柔軟的棉巾擦亮備用。也可以95%的乙醇浸泡510分鐘，再用紗布擦干擦亮備用。 舊玻片處理 用過的玻片浸泡洗滌劑溶液中12天或者浸泡于煮沸好的5%肥皂水中12小時，逐個擦去玻片上的舊血膜痕跡，用清水漂洗干凈擦干擦亮。 洗凈載玻片處理 每1020張用白紙包好或者裝原玻片盒里再放入塑料袋內(nèi)，保存于干燥環(huán)境中備用。,2019/6/30,4,取血部位及方法,取血部位及方法 取血部位以耳垂較為合適，也可在手指末端采血，嬰兒可從拇趾或足跟取血。先用75%酒精棉球消毒取血部位后，以一次性采血針迅速刺入取血部位12毫米深，然后用左手大拇指、食指和右手中指協(xié)同擠出血滴。,2019/6/30,5,采血時間,取血時機(jī) 現(xiàn)癥病人一般可隨時取血，瘧疾普查時可不考慮取血時機(jī)。但在診斷或需要某期瘧原蟲作標(biāo)本時，則應(yīng)掌握適宜的取血時機(jī)。 間日瘧在寒熱發(fā)作時，外周血液中主要可見環(huán)狀體期；發(fā)作后數(shù)小時，環(huán)狀體發(fā)育到滋養(yǎng)體期，瘧色素形成，形態(tài)較易辯認(rèn)，為診斷瘧疾的有利時機(jī)；3648小時，可檢出裂殖體；發(fā)作一、二次后，配子體出現(xiàn)較多。 惡性瘧較理想的取血時間是在發(fā)作后至20小時內(nèi)取血，初發(fā)患者退熱后常查不到瘧原蟲。,涂制血膜規(guī)則,用于檢查瘧原蟲的血涂片有兩種：一種是將血液涂呈薄膜狀，稱薄血膜；一種是血液涂成圓盤狀，稱厚血膜。薄血膜上的血細(xì)胞要求平輔在玻片上面。 涂片順序，先厚后??；位置分配，血片自左向右：薄-厚-標(biāo)簽；推薄片用玻片短邊。,制作厚血膜,制作薄血膜,2019/6/30,7,厚血膜血量及涂片法,厚血膜 用推片的一角，從取血部位刮取約45微升血量（相當(dāng)于火柴頭大小），使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)24圈，涂成直徑0.81厘米大小圓形厚血膜，血膜厚薄均勻，過厚易于脫落，過薄達(dá)不到檢出率的要求。,2019/6/30,8,薄血膜血量及涂片法,薄血膜 取潔凈的載玻片2張，1張平置在桌上，以左手拇指，食指夾持載玻片兩端（手指切勿接觸玻片表面），用另一張邊緣平滑（最好為磨口邊緣）的載玻片做推片，用推片一端邊緣的中點(diǎn)從取血部分刮取約11.5微升的血量（相當(dāng)于1/4火柴頭大小），使血滴與平置的載玻片接觸，并形成2535度夾角，待血液向兩側(cè)擴(kuò)展約2厘米寬度時，均勻而迅速地輕輕向左推出（約2.5厘米長）且邊緣帶有“舌狀”的薄血膜。,2019/6/30,9,涂制厚、薄血膜的位置,通常是將厚、薄血膜涂在一張載玻片上。方法是將載玻片分為3等分（留出標(biāo)簽或磨砂面位置后的3等分）。厚血膜涂在載玻片靠近標(biāo)簽或磨砂面方向的右1/3中央處，圓形、厚薄均勻、邊緣整齊。薄血膜涂在載玻片1/2至左1/3的中部位置，舌狀、厚薄均勻。,2019/6/30,10,血片編號,血膜制成后，立即將受檢者的個人編號寫在玻片磨砂面上（血片的編號要與血檢登記本上編號一致）以防差錯。,2019/6/30,11,制作血膜的注意事項(xiàng),1. 玻片清洗時，避免玻片碰撞、磨損。制作血膜的載玻片必須完全清潔而毫無油漬或污垢。制片時，手指只能持載片的邊緣，不能接觸玻片表面，以免油污使薄血膜產(chǎn)生空白區(qū)以及厚血膜脫落。作為推片的玻片邊緣一定要平滑，才能使推出的血膜均勻一致。,2019/6/30,12,制作血膜的注意事項(xiàng),2. 剛涂制的血膜要平放在標(biāo)本盒內(nèi)或者實(shí)驗(yàn)臺面上。厚血膜未干前勿使標(biāo)本片傾斜，以免未干的血膜傾向一側(cè)，造成血膜厚薄不均，厚處不易溶血和著色而影響檢查結(jié)果；晾干血膜時應(yīng)注意防塵、防止蒼蠅、蟑螂等昆蟲吮吸血膜，干后應(yīng)及時裝入標(biāo)本盒內(nèi)。新木制標(biāo)本盒需敞開放置一段時間，讓木醇揮發(fā)后才能使用，以免厚血膜血紅蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。,2019/6/30,13,制作血膜的注意事項(xiàng),3. 血膜讓其自然干燥，切忌用太陽曬或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天標(biāo)本盡可能2448小時內(nèi)固定染色；冬天也不能超過72小時。放置時間越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及時染色，薄血膜宜先用甲醇固定（13分鐘）然后用過濾清水或自來水對厚血膜溶血，晾干后包好置干燥器于冰箱內(nèi)保存，用時將干燥器置室溫中12小時后取出染色。,血片的染色 （一）染液的種類及染色原理,染液種類：目前所用的血片染色液，雖然名稱很多，但都是從羅門諾夫斯基氏創(chuàng)造的染液變化過來的?？偟目煞譃樗芤汉途凭芤簝纱箢?，前者包括羅氏、西氏（Simon)、J.S.B氏染液等，后者包括利氏(Leishman)、瑞氏和吉氏染液（被國家推薦使用）等。這些染液中的主要染劑都包含美蘭、伊紅和由美蘭氧化所成的天青，所以稱為多色性染劑。,2019/6/30,15,血片的染色 （一）染液的種類及染色原理,染色原理：伊紅是酸性水溶性鈉鹽，美蘭是堿性水溶性鹽酸鹽，當(dāng)它們各自溶化水中時，就離解為帶陽電和陰電的離子。伊紅主要離解為酸性的陽離子，在遇到堿性的蛋白質(zhì)如血紅蛋白、嗜伊紅白血球顆粒等即可結(jié)合成不易溶于水的沉淀物染成紅色。美蘭主要離解為堿性的美蘭離子，美蘭就與瘧原蟲、淋巴和大單核細(xì)胞的胞漿、嗜堿性白細(xì)胞的顆粒等酸性蛋白質(zhì)結(jié)合染成蘭色。,2019/6/30,16,血片的染色 （一）染液的種類及染色原理,染色原理：美蘭與伊紅都不能使原蟲和白細(xì)胞的核著色，必須由天青作為媒介（染媒）才能使其著色。天青雖然也是堿性染劑，但又具有染媒作用，使原蟲核和白細(xì)胞核等原來只能染上極淡蘭色的結(jié)構(gòu)染上顯著的酸性染劑伊紅，這樣，就使白細(xì)胞粗大的核染成顯著的既蘭又紅的紫蘭色，而較小或菲薄的原蟲核和淋巴細(xì)胞原漿中的顆粒染成紫紅色。,2019/6/30,17,血片的染色 （一）染液的種類及染色原理,注意：蛋白質(zhì)是二性電解質(zhì)，當(dāng)其處于較等電點(diǎn)為酸的溶液中時，便呈堿的作用，即與酸或陰離子結(jié)合，這就說明為何在染液偏酸時，伊紅的著色力強(qiáng)，使紅細(xì)胞著色鮮艷而淋巴細(xì)胞和原蟲的胞漿著色不顯著；反之，蛋白質(zhì)在偏堿的溶液中呈酸的作用而中和堿基，也就說明為何染液偏堿時，紅細(xì)胞和嗜伊紅白細(xì)胞的顆粒等被染成紫蘭色。 伊紅在水溶液內(nèi)遇到美蘭或天青，即可互相化合而產(chǎn)生沉淀從而失去染色力，因此，吉氏染液的母液絕對不能進(jìn)水。,2019/6/30,18,血片的染色 （二）吉氏染液母液配置方法,取吉氏粉0.5克置于研缽中，加少量甘油充分研磨，再加再磨，至25毫升加完為止，倒入60或100毫升帶有玻塞的有色玻瓶中。在研缽中加少量甲醇，洗去甘油染液混入瓶內(nèi)，至25毫升甲醇洗凈缽中甘油染液為止，塞緊瓶塞，充分搖勻，置于5560水浴中或溫箱內(nèi)24小時或室溫內(nèi)35天，多加搖動，即成原液。吉氏染液是目前較優(yōu)良的血膜染劑，即使在炎熱天氣中，亦可經(jīng)久不變。,材料： 1、吉氏粉0.5克 2、甘油25毫升 3、甲醇25毫升,2019/6/30,19,血片的染色 （三）吉氏染液血片染色方法,血膜干燥后，用甲醇或無水酒精固定薄血膜，用過濾清水或自來水對厚血膜溶血，然后再進(jìn)行染色。 成批血片染色：將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀釋液（2毫升原液加中性蒸餾水98毫升稀釋均勻即成），同時對厚薄血膜染色30分鐘（如染液不合標(biāo)準(zhǔn)時，得酌情增減染色時間），然后用清水輕輕將染液沖去，再用清水輕輕沖洗一次，干凈后將血片標(biāo)本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干鏡檢。,2019/6/30,20,血片的染色 （三）吉氏染液血片染色方法,單張血片染色：薄血膜經(jīng)甲醇固定干燥后，用2%吉氏染液稀釋液12毫升，滴入血片標(biāo)本上染色30分鐘左右，或用中性蒸餾水12毫升，加吉氏母液12滴，混合均勻后滴入血片標(biāo)本上，染色2030分鐘，然后用清水輕輕將片上的染液沖洗干凈，晾干鏡檢。,2019/6/30,21,影響染色效果的因素,血片染色好壞除了與玻片是否清潔，血片制作質(zhì)量好壞等有關(guān)外，還受到以下幾個因素的影響： （1）染料溶劑的質(zhì)量 染料、甲醇和甘油如果不純，常使配制的染液偏酸或偏堿而影響染色效果。因此必須用分析純的甲醇和中性甘油，而且在配制時所用的器具必須干凈而無水份。,2019/6/30,22,影響染色效果的因素,（2）染液的新舊 新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力較弱且常呈現(xiàn)偏堿性。染液存放時間越久，染色力越強(qiáng)。通常在染液配制12周后才使用，盛裝染液的瓶子應(yīng)加塞蓋密。以防吸潮而影響染液質(zhì)量。,2019/6/30,23,影響染色效果的因素,（3）染液稀釋后使用時間 吉氏和瑞氏染液的主要成份是美藍(lán)、伊紅和由美藍(lán)氧化產(chǎn)生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊紅遇到美藍(lán)和天青即產(chǎn)生沉淀。因此，必須在稀釋染液當(dāng)時使用，一般在半小時內(nèi)染色力最強(qiáng)。,2019/6/30,24,影響染色效果的因素,（4）染液的稀釋濃度 染液的濃度高其著色就快而深，從而瘧原蟲寄生紅細(xì)胞的薛氏點(diǎn)粗大顯著，但顏色常偏堿；染液濃度過低則染色時間久，顏色偏酸，薛氏點(diǎn)不明顯或消失。,2019/6/30,25,影響染色效果的因素,（5）染色時間 染色時間長染色效果好，反之較差。室溫高則著色快，染色時間可略縮短，氣溫低可適當(dāng)延長。因此染色時間應(yīng)根據(jù)染液的質(zhì)量、新舊、稀釋濃度和氣溫而適當(dāng)增減。,2019/6/30,26,影響染色效果的因素,（6）染色用水 染液的稀釋用水和染色后沖洗用水應(yīng)選擇Ph7.07.2清潔水，通常使用的新鮮的蒸餾水或過濾的冷開水，以及自來水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏堿，可用緩沖蒸餾水調(diào)整。染色后發(fā)現(xiàn)血膜顏色偏藍(lán)（偏堿）或偏紅（偏酸）時，可用與之相反的酸、堿度水沖洗血片予以糾正。,2019/6/30,27,影響染色效果的因素,（7）染色后不要直接將染液殘?jiān)沟?，?yīng)沿玻片或染色缸邊緣加水使染液表面一層溢出，并輕輕沖洗，以免染液色素顆粒沾污染片血膜。,注：用于薄血膜的染色和一般漂洗時，用蒸餾水稀釋至1 000ml，用于厚血膜及同一張玻片上厚血膜與薄血膜的染色時，用蒸餾水稀釋至500ml。,配制pH6.67.4緩沖液兩種貯備液用量表,