《發(fā)酵工程3上》PPT課件.ppt

第三章 菌種選育與培養(yǎng),第一節(jié) 重要工業(yè)微生物的分離及菌種要求 第二節(jié) 工業(yè)微生物菌種的選育 第三節(jié) 工業(yè)微生物菌種的衰退、復壯與保藏 第四節(jié) 種子的擴大培養(yǎng),第一節(jié) 重要工業(yè)微生物的分離及菌種要求,微生物資源非常豐富，廣泛分布于土壤、水和空氣中，尤以土壤中最多。 有的微生物從自然界中分離出來就能被利用，有的需要對分離到的野生菌株進行人工誘變，得到突變株才能被利用。 當前發(fā)酵工業(yè)所用的菌種總趨勢是從野生菌轉(zhuǎn)向變異菌，自然選育轉(zhuǎn)向代謝育種，從誘發(fā)基因突變轉(zhuǎn)向基因重組的定向育種。 由于生物工業(yè)本身的發(fā)展以及遺傳工程的介入，藻類、病毒等也正在逐步變?yōu)楣I(yè)生產(chǎn)用的微生物。,一、工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物,細菌（bacteria） 酵母菌（yeast） 霉菌（mould） 放線菌（actinomycetes） 擔子菌（basidiomycetes） 藻類（algae）,枯草芽胞桿菌、醋酸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌等， 用于生產(chǎn)淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等,單細胞真核生物，常用啤酒酵母、假絲酵母、類酵母等， 用于釀酒、制造面包、生產(chǎn)脂肪酶以及可食用、藥用和飼料用酵母菌體蛋白等,根霉、毛霉、犁頭霉、紅曲霉、曲霉、青霉等，用于生產(chǎn)多種酶制劑、抗生素、有機酸及甾體激素等,能產(chǎn)生多種抗生素，如鏈霉素、紅霉素、金霉素、慶大霉素等，常用菌種來自鏈霉菌屬、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬等,通常所說菇類（mushroom）微生物，用于多糖、橡膠物質(zhì)和抗癌藥物的開發(fā),用作人類保健食品和飼料，如螺旋藻、柵列藻； 可通過藻類將CO2轉(zhuǎn)變?yōu)槭?，或獲取氫能,二、微生物工業(yè)對菌種的要求,原料廉價、生產(chǎn)迅速、目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。 易于控制培養(yǎng)條件，酶活性高，發(fā)酵周期較短。 抗雜菌和噬菌體的能力強。 菌種遺傳性能穩(wěn)定，不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素，保證安全生產(chǎn)。,目前，隨著微生物工業(yè)原料的轉(zhuǎn)換和新產(chǎn)品的不斷出現(xiàn)，勢必要求開拓更多新品種。盡管微生物工業(yè)用的菌種多種多樣，但作為大規(guī)模生產(chǎn)，對菌種有下列要求：,三、重要工業(yè)微生物的分離,分離 是指從含微生物的樣品（如土壤、水等）中獲得純的或混合的培養(yǎng)物，是篩選具有潛在工業(yè)應用價值的微生物的第一個階段，接著才能從以上分離物中篩選出那些能產(chǎn)生所需產(chǎn)物或具有某種生化反應的菌種。,有時可以設計出一種在分離階段便能識別所需菌種的方法；也可用特定的分離方法先進行分離，隨后再去識別所需的生產(chǎn)菌株。,定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。 采樣：有針對性地采集樣品。 增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。 分離：利用分離技術得到純種。 發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。,工業(yè)微生物分離的程序：,A 采樣對象,以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。,1、采樣,從自然界篩選,以溫度適中，雨量不多的秋初為好。 在選好適當?shù)攸c后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。,B 采樣季節(jié),C采樣方式,2、增殖培養(yǎng),為了容易分離到所需的菌種，讓無關的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。,（1）施加選擇壓力的分離方法,富集液體培養(yǎng) 富集培養(yǎng)是指能增加混合菌群中所需菌株的數(shù)量的一種技術。方法的要領是給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長或不利于其他菌株生長的條件。例如，供給特殊的基質(zhì)或加入某些抑制劑。,3、培養(yǎng)分離,固體培養(yǎng)基的使用 該方法常用于分離某些酶產(chǎn)生菌，其選擇培養(yǎng)基中常含有該酶的作用底物。,抗生素產(chǎn)生菌的篩選 抗生素可作為分離步驟中的選擇壓力,（2）隨機分離方法,生長因子產(chǎn)生菌的篩選 生長因子如氨基酸和核苷酸等的生產(chǎn)不能作為分離步驟中的選擇壓力，可用隨機辦法分離產(chǎn)生菌，并通過隨后的篩選試驗檢驗出產(chǎn)生菌。,多糖產(chǎn)生菌的篩選 可從菌落的粘稠外觀識別這類產(chǎn)生菌。,盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這一步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應進一步應用，而且控制得細一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。,4、篩選,采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得到適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。,5、毒性試驗,自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應當十分當心，尤其與食品工業(yè)有關的菌種，更應慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。,第二節(jié) 工業(yè)微生物菌種的選育,用發(fā)酵法生產(chǎn)產(chǎn)品，首先要有一個良好的菌種，因此必須進行菌種選育工作 菌種選育工作大幅度提高了微生物發(fā)酵的產(chǎn)量，促進了微生物發(fā)酵工業(yè)的迅速發(fā)展 通過菌種選育，抗生素、氨基酸、維生素、藥用酶等產(chǎn)物的發(fā)酵產(chǎn)量提高了幾十倍、幾百倍、甚至幾千倍 菌種選育在提高產(chǎn)品質(zhì)量、增加品種、改善工藝條件和產(chǎn)生菌的遺傳學研究等方面也發(fā)揮了重大作用 菌種選育的目的是改良菌種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求,一、自然選育,在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工誘變處理，根據(jù)菌種的自發(fā)突變而進行菌種篩選的過程，叫做自然選育或自然分離。 引起自發(fā)突變的原因：多因素低劑量的誘變效應；互變異構效應。 自然選育包括從自然界分離獲得菌株和根據(jù)菌種的自發(fā)突變進行篩選而獲得菌種。,自然選育的方法與第一節(jié)介紹的微生物的分離方法相近，不同之處在于分離和篩選是同步進行的。,宇宙空間的各種短波輻射、自然界普遍存在的一些低濃度誘變物質(zhì)、微生物自身代謝活動中產(chǎn)生的誘變物質(zhì)。,四種堿基的酮基（酮式或烯醇式）和氨基（氨基式或亞氨基式）的互變異構。,1. 從自然界分離獲得菌株,一般包括以下幾個步驟：采樣、增殖培養(yǎng)、純種分離和性能測定等。,2. 從自發(fā)突變體中獲得菌株,變異是育種的基礎。 自然突變是指自然條件下出現(xiàn)的基因變化。 自發(fā)突變的頻率較低，因此自然選育篩選出來的菌種，不能滿足育種工作的需要。因而不能僅停留在“選”種，還要進行“育”種。如通過誘變劑處理菌株，就可以大大提高菌種的突變頻率，擴大變異幅度，從中選出具有優(yōu)良特性的變異菌株誘變育種。,二、誘變選育,使用誘變劑進行人工誘變能提高突變頻率和擴大變異譜，具有速度快、方法簡便等優(yōu)點，是當前菌種選育的一種主要方法，使用普遍。 誘發(fā)突變隨機性大，必須與大規(guī)模的篩選工作相配合才能受到良好的效果。 誘變育種的主要環(huán)節(jié)：,以合適的誘變劑處理大量而均勻分散的微生物細胞懸浮液（細胞或孢子）以引起絕大多數(shù)細胞致死的同時，使存活個體中DNA堿基變異頻率大幅度提高； 用合適的方法淘汰負效應變異株，選出極少數(shù)性能優(yōu)良的正變異株，以達到培育優(yōu)良菌株的目的。,出發(fā)菌株的選擇,工業(yè)上用來進行誘變處理的菌株，稱為出發(fā)菌株（parent strain）。 一般有三種：,從自然界分離得到的野生型菌株； 通過生產(chǎn)選育，已有一定的生產(chǎn)性狀，對生產(chǎn)環(huán)境有較好的適應性，正突變可能性較大； 已經(jīng)誘變過的菌株，負突變可能性較大。,菌懸液的制備,前培養(yǎng),誘變,變異菌株的分離和篩選,1、誘變選育的程序,2、誘變育種方案設計,誘變育種方案包括突變的誘發(fā)、突變株的篩選和突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn)。,這些環(huán)節(jié)是相互聯(lián)系，缺一不可的。,（1）出發(fā)菌株的選擇,選擇單倍體純種作為出發(fā)菌株，借以排除異核體或異質(zhì)體的影響。 不僅選產(chǎn)量高的，還要考慮其他因素，如產(chǎn)孢子早而多，色素多或少，生長速度快等有利于合成發(fā)酵產(chǎn)物的特性。 選擇對誘變劑敏感且變異幅度廣的菌株作為出發(fā)菌株，可以提高變異頻率，而且高產(chǎn)突變株的出現(xiàn)率也大。,（2）誘變劑的種類和選擇,A、誘變劑,各種射線，如紫外線（焦耳）、X射線（庫侖/千克）、射線、射線、射線和超聲波等,直接與DNA發(fā)生化學反應：甲基磺酸乙酯（EMS）、亞硝基胍、氮芥、亞硝酸等 堿基類似物：5-溴尿嘧啶（BU）是胸腺嘧啶的類似物 引起移碼突變：吖啶類染料,要根據(jù)誘變劑作用機制，結合菌種特性來考慮選擇哪種誘變劑 ，同時要考慮菌種特性和遺傳穩(wěn)定性。同時還要參考出發(fā)菌株原有的誘變系譜來選擇誘變劑。 對遺傳穩(wěn)定的菌株，最好采用以前未使用過的、突變譜較寬的、誘變率高的強誘變劑進行復合處理，然后再采用一些作用較緩的誘變劑處理； 對遺傳不穩(wěn)定的菌株，首先進行自然分離，劃分菌落類型，從中選擇效價高的、性能好的一類菌落作為誘變處理的出發(fā)菌株。采用溫和誘變劑或?qū)υ擃惥鷦┻M行繼續(xù)處理，從中篩選突變體。,嘧啶的 5位上溴原子代替甲基后可較多地出現(xiàn)烯醇式的嘧啶。 酮式的BU代替了胸腺嘧啶T而使A:T堿基對變?yōu)锳:BU，在下一次DNA復制中烯醇式的BU*和鳥嘌呤G配對而出現(xiàn)G:BU堿基對，最后在又一次復制中G和C配對而終于出現(xiàn)G:C堿基對，完成了堿基的置換。,合適的劑量：能增加變異幅度，又能促使變異向正變范圍移動的劑量。 劑量的選擇和誘變因素的使用隨菌種的不同而異，因此需從工作中總結、摸索來確定。,誘變處理劑量的選擇是一個比較復雜的問題，一般正突變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負突變則較多出現(xiàn)于偏高劑量中。 對于經(jīng)過多次誘變而提高了產(chǎn)量的菌株，在較高劑量負突變率更高。 因此，目前處理劑量已從以前采用的死亡率9099減低為7080。,各種化學誘變劑常用的劑量和處理時間,B、影響誘變效果的因素,出發(fā)菌株的遺傳特性； 誘變劑； 菌種的生理狀態(tài)； 被處理菌株的預培養(yǎng)條件； 誘變處理時的外界條件等。,微生物容易發(fā)生變異和染菌，同時一般絲狀菌的野生菌株多為異核體。生產(chǎn)菌在不斷移代過程中，菌絲間接觸、融合后，易產(chǎn)生異核體、部分結合子、雜合二倍體及自然突變株等。這些都會造成細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的異質(zhì)化，使遺傳性狀不穩(wěn)定。通過純種分離，從中挑選所需的優(yōu)良菌株。常用劃線分離和稀釋分離法，并結合顯微鏡操縱器分離單孢子,細菌在對數(shù)期誘變處理效果較好；霉菌或放線菌的分生孢子一般都處于休眠狀態(tài)，所以培養(yǎng)時間的長短對孢子影響不大，但稍加萌發(fā)后的孢子則可提高誘變效率；對不產(chǎn)孢的真菌，可直接采用年幼的菌絲體進行誘變處理。,誘變處理前，將細胞在添加嘌呤、嘧啶等堿基或酵母膏的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2060min，再進行誘變處理，則變異率可大幅度提高。,（3）突變的誘發(fā),A、誘變劑接觸DNA分子 B、DNA損傷的修復 C、從前突變到突變 D、從突變到突變型,光復活作用 切補修復 重組修復 SOS修復系統(tǒng) DNA多聚酶的校正作用,（表型延遲：誘變劑一般只作用于DNA雙鏈中的某一條單鏈，故某一突變還是無法反映在當代的表型上，只有當經(jīng)過DNA的復制和細胞分裂后，這一變異才會在表型上表達出來，于是出現(xiàn)了不純菌落。）,（4）篩選的方法,A、營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選方法,營養(yǎng)缺陷型菌株的工業(yè)應用價值：在直鏈式合成途徑中，營養(yǎng)缺陷型突變株可積累中間產(chǎn)物；分支代謝途徑中，可通過解除協(xié)同反饋調(diào)節(jié)而使另一分支末端產(chǎn)物積累。,與營養(yǎng)缺陷突變有關的三類遺傳型個體： 營養(yǎng)缺陷型：經(jīng)誘變產(chǎn)生的一些合成能力出現(xiàn)缺陷，而必須在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應有機養(yǎng)分才能正常生長的變異菌株。如：lys -， bio- 野生型：自然界分離到的任何微生物，在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株，為該微生物的野生型。 如：lys + ; bio + ; 原養(yǎng)型 ：指營養(yǎng)缺陷型突變菌株回復突變或重組后產(chǎn)生的菌株，與野生型的表型相同。,與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關的三類培養(yǎng)基,基本培養(yǎng)基（MM）-：凡是能滿足野生型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。 完全培養(yǎng)基（CM）+：滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株生長的天然或半合成培養(yǎng)基。 補充培養(yǎng)基（SM）x：在MM中有針對性地加入一或幾種營養(yǎng)成分以滿足相應營養(yǎng)缺陷型菌株生長的合成培養(yǎng)基。,篩選方法,一般經(jīng)誘變后，再經(jīng)中間培養(yǎng)、淘汰野生型、檢出營養(yǎng)缺陷型、確定生長譜等。,淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法等。,（1）抗生素法： 細菌用青霉素法：細菌細胞壁的主要成分為肽聚糖，而青霉素能抑制細胞壁肽聚糖鏈之間的交鏈，阻止合成完整的細胞壁。處在生長繁殖過程的細菌對青霉素十分敏感，因而被抑制或殺死，但不能抑制或殺死處于休止狀態(tài)的細菌。將誘變處理后的菌懸液分離加有抗生素的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后野生型細胞由于正常生長繁殖而被殺死，營養(yǎng)缺陷型細胞因不能生長而被保留下來，達到富集目的。 酵母菌和霉菌用制霉素法：制霉素作用于真菌細胞膜上的甾醇，引起細胞膜的損傷，殺死生長繁殖過程的真菌，起到富集營養(yǎng)缺陷型的作用。,CM或SM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，克服表型延遲,（2）菌絲過濾法 真菌和放線菌等絲狀菌的野生型孢子在基本培養(yǎng)基中能萌發(fā)長成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型的孢子則不能萌發(fā)。把誘變處理后的孢子移入到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)10h左右，使野生型孢子萌發(fā)的菌絲剛剛肉眼可見，用滅菌的脫脂棉、濾紙或玻璃漏斗除去菌絲。繼續(xù)培養(yǎng)，每隔34h過濾一次，重復34次，最大限度地除去野生型細胞。然后稀釋、涂皿分離。 （3）差別殺菌法 利用芽孢桿菌類的芽孢和營養(yǎng)體對熱敏感性的差異，讓誘變后的細菌形成芽孢，然后把處在芽孢階段的細菌移到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一定時間，野生型芽孢萌發(fā)，而營養(yǎng)缺陷型芽孢不能萌發(fā)。此時將培養(yǎng)物加熱到80，維持一定時間，野生型細胞大部分被殺死，缺陷型則得以保留，起到了濃縮作用。,營養(yǎng)缺陷型菌株的檢出方法有：逐個測定法、夾層平板法、限量營養(yǎng)法和影印接種法等。,二,B、 抗性突變株的篩選,包括對抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體等的抗性突變株篩選，這些突變型常用來提高某些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。篩選常用梯度平板法（gradient plate）。,抗藥性突變株的應用： 作為菌株的遺傳標記 作為生產(chǎn)菌種（結構類似物抗性變異株）,（5）突變基因的表型,菌種的發(fā)酵產(chǎn)量決定于菌種的遺傳特性和菌種的培養(yǎng)條件。 突變株的遺傳特性改變了，其培養(yǎng)條件也應該作出相應的改變。 在菌種選育過程的每個階段，都需不斷改進培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以鑒別帶有新特點的突變株，使高產(chǎn)基因能在生產(chǎn)規(guī)模下得以表達。,三、常規(guī)的雜交育種,遺傳標記 異核體形成 雜合二倍體的形成 染色體交換和單倍體,四、原生質(zhì)體融合,1. 標記菌株的篩選,供融合用的兩個親株要求性能穩(wěn)定并帶有遺傳標記，以利于融合子的選擇。 采用的遺傳標記一般以營養(yǎng)缺陷型和抗藥性等遺傳性狀為標記。 通過采用多種抗生素及其他藥物，以梯度平板法進行粗選，再用具有抗性的抗性生物制備不同濃度的平板，進行較細的篩選。,2. 原生質(zhì)體的制備,在高滲透壓溶液中，用適當?shù)拿摫诿福毦蚍啪€菌可用溶菌酶或青霉素處理，酵母菌和霉菌可用蝸牛酶或其他相應的脫壁酶）去除細胞壁，剩下的是由細胞膜包裹的原生質(zhì)體。,影響原生質(zhì)體制備的因素：,菌體的預處理 菌體的培養(yǎng)時間 酶濃度 酶解溫度 酶解時間 滲透壓穩(wěn)定劑,用EDTA、甘氨酸、青霉素或D-環(huán)絲氨酸等處理細菌，使菌體細胞壁對酶的敏感性增強。,一般選擇對數(shù)生長后期的菌體，這時細胞正在生長、代謝旺盛，細胞壁對酶解最為敏感。,一般控制在2040。,充足的酶解時間,對于細菌或放線菌一般采用蔗糖、丁二酸鈉；對于酵母菌則采用山梨醇、甘露醇等；對于霉菌則采用KCl和NaCl等。一定濃度的Ca2+、Mg2+等二價陽離子可增加原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性。,3. 原生質(zhì)體的融合和再生,融合是把兩個親株的原生質(zhì)體混合在一起，在融合劑PEG和Ca2+作用下，發(fā)生原生質(zhì)體的融合。 原生質(zhì)體融合后的重組子要成為一個無性繁殖系，首先必須再生，即能重建細胞壁，恢復完整細胞并生長、分裂。,影響原生質(zhì)體融合的因素： 菌體的前處理； 菌體的培養(yǎng)時間； 融合劑的濃度； 融合劑作用的時間； 陽離子的濃度； 融合的溫度； 融合體系的pH值等。,影響原生質(zhì)體再生的因素： 菌種自身的再生性能； 原生質(zhì)體制備的條件； 再生培養(yǎng)基成分； 再生培養(yǎng)條件等。,將用酶處理前的菌體經(jīng)無菌水系列稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基平板上，計出原菌數(shù)A； 將用酶處理后得到的原生質(zhì)體分別經(jīng)如下兩個過程的處理：,用無菌水適當稀釋，在完全培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)計數(shù)，由于原生質(zhì)體在低滲透壓條件下會破裂失活，所以生長出的菌落數(shù)為未形成原生質(zhì)體的原菌數(shù)B； 用高滲液適當稀釋，在再生培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)計數(shù)，生長出的菌落數(shù)為原生質(zhì)體再生的菌數(shù)和未形成原生質(zhì)體的原菌數(shù)之和C。,4. 融合子的選擇,融合子的選擇主要依靠兩個親株的選擇性遺傳標記。 在選擇性培養(yǎng)基上，通過兩個親株的遺傳標記互補而挑選出融合子。 在融合體再生后，進行幾代自然分離、選擇，才能確定真正融合子。,5. 滅活原生質(zhì)體融合技術在育種中的應用,滅活原生質(zhì)體融合技術是指采用熱、紫外線、電離輻射以及某些生化試劑、抗生素等作為滅活劑處理單一親株或雙親株的原生質(zhì)體，使之失去再生能力，經(jīng)細胞融合后，由于損傷部位的互補可以形成能再生的融合體。,該方法可以不用遺傳標記,五、DNA