《核酸的結(jié)構(gòu)》PPT課件.ppt

第二節(jié) 核酸的結(jié)構(gòu),一、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu),定義 核酸中核苷酸的排列順序。 由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱(chēng)為堿基序列。,可以用堿基序列表示核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu),核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu),核苷酸間的連接鍵是： 3， 5-磷酸二酯鍵 相間排列的戊糖和磷酸構(gòu)成主鏈，堿基是有秩序連接的側(cè)鏈基團(tuán) 線性核酸鏈都有一個(gè)3-末端和一個(gè)5-末端 可以堿基序列表示核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu),核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)寫(xiě)表示,5 pApGpTpGpCpT-OH 3,5 A G T G C T 3,核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)書(shū)寫(xiě)規(guī)則,用p表示磷酸基團(tuán)。p在核苷左側(cè)時(shí)，表示磷酸與糖環(huán)的5 -羥基結(jié)合；在右側(cè)表示與3 -羥基結(jié)合。 舉例：pApCpGpU pApCp GpU:表示水解后C的3 -羥基連有磷酸基； pApC pGpU:表示水解后C的3 -羥基是游離的 P可省略，用字母表示。pACGU,簡(jiǎn)寫(xiě)式的讀向是從左到右，堿基序列是5到3,二、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)-雙螺旋結(jié)構(gòu),（一）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景,堿基組成分析 Chargaff 規(guī)則：A = T G C,堿基的理化數(shù)據(jù)分析 A-T、G-C以氫鍵配對(duì)較合理； 其他組合易相互排斥；如 G:T,DNA纖維有相似的X-線衍射圖譜， 說(shuō)明DNA可能有共同的空間結(jié)構(gòu)。,Chargaff規(guī)則： （1）A=T （2）G=C （3）A+C=G+T （4）A+G=C+T,（二） DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn) （Watson, Crick, 1953）,DNA分子由兩條相互平行但走向相反的脫氧多核苷酸鏈組成，兩鏈以-脫氧核糖-磷酸-為骨架，以右手螺旋方式繞同一公共軸盤(pán)。 堿基對(duì)糖苷鍵的角度差異，使得形成大溝及小溝相間排列。大溝和小溝處堿基基團(tuán)分布不同，可以與蛋白質(zhì)特異作用。兩個(gè)核苷酸間的夾角36,（二） DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn),堿基垂直螺旋軸居雙螺旋內(nèi)側(cè)，與對(duì)側(cè)堿基形成氫鍵配對(duì)（互補(bǔ)配對(duì)形式：A=T; GC） 。堿基在一條鏈上的排列順序不受任何限制。但根據(jù)堿基配對(duì)原則，一條核苷酸鏈序列可決定另一條互補(bǔ)鏈的序列。 雙螺旋的直徑為2nm，相鄰堿基平面距離0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10對(duì)堿基。DNA分子大小常用堿基對(duì)數(shù)（bp）表示,堿基互補(bǔ)配對(duì),T,A,G,C,堿基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行,（二） DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn) （Watson, Crick, 1953）,大多數(shù)天然DNA屬于雙鏈DNA,某些病毒中DNA屬于單鏈DNA. 氫鍵維持雙鏈橫向穩(wěn)定性，堿基堆積力維持雙鏈縱向穩(wěn)定性。,DNA，雙螺旋，正反向，互補(bǔ)鏈。 A對(duì)T，GC連，配對(duì)時(shí)，用氫鍵(AT2，GC3) 十堿基，轉(zhuǎn)一圈，螺距34點(diǎn)中間。 堿基力和氫鍵，維持螺旋結(jié)構(gòu)堅(jiān)。 PS: AT2，GC3：指AT之間二個(gè)氫鍵，GC間三個(gè). 螺距34點(diǎn)中間即3.4。,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)記憶歌訣,堿基堆積力形成疏水環(huán)境（主要因素） 。 堿基配對(duì)的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。 磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽(yáng)離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負(fù)電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。 堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。,穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素,類(lèi)型 結(jié)晶狀態(tài) 螺距 堿基距離 每圈 旋轉(zhuǎn) (nm) (nm) bp數(shù) 方向 A 相對(duì)濕度75% 2.3 0.255 11 右手 DNA鈉鹽 B 相對(duì)濕度92% 3.4 0.34 10 右手 DNA鈉鹽 C 相對(duì)濕度66% 3.1 0.332 9.3 右手 DNA鋰鹽 Z d(GCGCGC) 4.5 0.37 12 左手,三、 DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的其他類(lèi)型,DNA單鍵可以旋轉(zhuǎn)，所以DNA會(huì)呈現(xiàn)不同二級(jí)結(jié)構(gòu)類(lèi)型,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性,Z型DNA,B型DNA,A型DNA,DNA的其他結(jié)構(gòu)類(lèi)型,二重對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)： 一條鏈堿基序列的正讀與另一條鏈 堿基序列的反讀相同。（回文順序） 2. 鏡像重復(fù) 此重復(fù)序列可能形成三螺旋DNA結(jié)構(gòu)。 三螺旋結(jié)構(gòu)可以阻止DNA的體外合成。 3. 四鏈結(jié)構(gòu) 由串聯(lián)重復(fù)的鳥(niǎo)苷酸鏈構(gòu)成。4條主鏈平行排列。,（一）定義 DNA雙螺旋通過(guò)扭曲和折疊所形成的特定構(gòu)象。 包括： 不同二級(jí)結(jié)構(gòu)單元間的相互作用 單鏈與二級(jí)結(jié)構(gòu)單元間的相互作用 DNA的拓?fù)涮卣?超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式。,第四節(jié) DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu),超螺旋結(jié)構(gòu)(supercoil) DNA雙螺旋鏈再盤(pán)繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。 超螺旋DNA結(jié)構(gòu)致密，增加了其穩(wěn)定性。,正超螺旋(positive supercoil) 盤(pán)繞方向與DNA雙螺旋方向相同 ,可增加螺旋圈數(shù)。DNA復(fù)制時(shí)，可在拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用下消除正超螺旋的扭曲張力。,負(fù)超螺旋(negative supercoil) 盤(pán)繞方向與DNA雙螺旋方向相反 ，可減少螺旋圈數(shù)。解開(kāi)負(fù)超螺旋，雙螺旋部分區(qū)域會(huì)形成單鏈區(qū)。生物體內(nèi)以負(fù)超螺旋存在,意義 DNA超螺旋結(jié)構(gòu)整體或局部的拓?fù)鋵W(xué)變化及其調(diào)控對(duì)于DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程具有關(guān)鍵作用。,（二）環(huán)狀DNA的三種典型構(gòu)象,（1）、 松弛環(huán)形DNA（開(kāi)環(huán)DNA) 超螺旋DNA的一條鏈斷裂，釋放扭曲張力形成的DNA （2）、 解鏈環(huán)形DNA (線性DNA) 超螺旋DNA的兩條鏈均斷裂形成的DNA （3）、 正超螺旋與負(fù)超螺旋DNA,連環(huán)數(shù)（linking number , L） DNA雙螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù) 扭轉(zhuǎn)數(shù)（twisting number , T） DNA分子中的Watson-Crick螺旋數(shù)目，以T表示 超螺旋數(shù)（纏繞數(shù) , writhing number , W）,L=T+W,（三）拓?fù)洚悩?gòu)酶 改變DNA拓?fù)洚悩?gòu)體的L值。 拓?fù)洚悩?gòu)酶酶I（解旋酶） 能使雙鏈負(fù)超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成松馳形環(huán)狀DNA，每次催化使L值增加1。 拓?fù)洚悩?gòu)酶酶II（促旋酶） 能使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成負(fù)超螺旋形DNA，每次催化使L減少2。,核小體由DNA鏈連在一起形成念珠狀結(jié)構(gòu),（四）真核生物染色體的結(jié)構(gòu),1、染色體,真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其基本單位是 核小體(nucleosome)。,DNA的存在形式,核小體的組成及性質(zhì),1. 核小體的組成 DNA：在組蛋白核心外面纏繞1.75圈（約146bp） 組蛋白：H1 H2A，H2B H3 H4,2. 核小體核心顆粒含H2A, H2B,H3和H4各兩分子。連接核心顆粒的DNA片段結(jié)合一分子H1,串珠狀核小體結(jié)構(gòu),染色體的形成,串珠狀結(jié)構(gòu),螺線管,突環(huán),微帶,染色體（DNA的長(zhǎng)度壓縮近10000倍）,常染色質(zhì)：間期細(xì)胞核中壓縮程度較低的，轉(zhuǎn)錄活性較高的染色體 異染色質(zhì)：壓縮程度較高，轉(zhuǎn)錄活性較低的染色體,串珠狀核小體,DNA雙螺旋片段,染色質(zhì)纖維,伸展形染色質(zhì)片段,密集形染色質(zhì)片段,整個(gè)染色體,2、序列特異性DNA結(jié)合蛋白（SDBP),指染色體中含有的非組蛋白，其主要與特異的DNA序列結(jié)合,SDBP種類(lèi)： 高遷移率蛋白（HMG)、轉(zhuǎn)錄因子、DNA聚合酶、RNA聚合酶、參與基因表達(dá)調(diào)控的蛋白質(zhì)、染色體骨架蛋白等,DNA的功能,DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的信息基礎(chǔ)。,基因從結(jié)構(gòu)上定義，是指DNA分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。,第五節(jié) DNA和基因組,一、基因和基因組的概念,基因：一段有功能的DNA片段，生物細(xì)胞中DNA分子的最小功能單位（交換單位）。 DNA分子中最小的功能單位,結(jié)構(gòu)基因：為RNA或蛋白質(zhì)編碼的基因,調(diào)節(jié)基因：只有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能，并不轉(zhuǎn)錄 生成RNA的基因 間隔序列：既不轉(zhuǎn)錄生成RNA，也沒(méi)有調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能的序列,基因組：某物質(zhì)所含的全套遺傳物質(zhì),二、病毒和細(xì)菌基因組的特點(diǎn),1、共同點(diǎn) 基因組較小，只有一個(gè)環(huán)形或線性的DNA分子 多數(shù)序列用來(lái)編碼蛋白質(zhì)，基因間的間隔序列很短 功能相關(guān)的基因常串聯(lián)在一起，由共同的調(diào)控元件調(diào)控，并轉(zhuǎn)錄成同一mRNA分子，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，稱(chēng)為操縱子。,2. 病毒基因組的特點(diǎn),1）病毒基因組可以由DNA或RNA組成，但每種病毒只含一種核酸（單、雙鏈，環(huán)形、線性）。,2）根據(jù)合成蛋白質(zhì)的方式分類(lèi)：,正鏈病毒：RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后， 直接指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成 負(fù)鏈病毒：RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，先合成與其堿基序列互補(bǔ)的RNA, 再指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成 雙鏈病毒：RNA為雙鏈，在宿主細(xì)胞中先以負(fù)鏈為模板合成正鏈RNA來(lái)指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，隨后合成負(fù)鏈RNA, 構(gòu)成雙鏈RNA，并和蛋白質(zhì)組裝成新的病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒：RNA進(jìn)入宿主后，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，合成與其互補(bǔ)的DNA（cDNA), cDNA轉(zhuǎn)錄生成mRNA指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。,3）重疊基因 一段可以編碼多個(gè)肽鏈的核酸序列 重疊基因普遍存在，超過(guò)基因總量的10%,3. 細(xì)菌基因組的特點(diǎn),細(xì)菌染色體有一環(huán)形或線性DNA分子，只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn) 編碼蛋白質(zhì)的基因是單拷貝的，但rRNA基因是多拷貝的 基因組有多種調(diào)控區(qū)和少量重復(fù)序列 基因組中存在可移動(dòng)的DNA序列（轉(zhuǎn)座子）,三、真核生物基因組特點(diǎn),基因組較大 核基因由多條線性染色體構(gòu)成，每條染色體含有一線性DNA分子，DNA分子含有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。 不存在操作子 功能相關(guān)的基因組成基因簇，基因是在多種調(diào)控因子的作用下協(xié)調(diào)表達(dá)。,3. 存在大量的重復(fù)序列,高度重復(fù)序列 中度重復(fù)序列 低度重復(fù)序列 單一序列（非重復(fù)序列）,4. 有斷裂基因,大多數(shù)為蛋白質(zhì)編碼的基因都含有不編碼的內(nèi)含子和編碼的外顯子。 內(nèi)含子將基因分割成斷裂基因（不連續(xù)基因） 真核生物的基因組含有大量重復(fù)序列和內(nèi)含子，外顯子所占比例較小。（人類(lèi)：1.5%）,第六節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)與功能,1. 堿基組成 A、G、C、U （AU/GC） 稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解 多為單鏈結(jié)構(gòu); 少數(shù)局部自身回折形成雙螺旋（40%70%), 不能配對(duì)的堿基形成突環(huán) 分子較小,組成特點(diǎn),RNA通常是單鏈線形分子(一級(jí)結(jié)構(gòu)) 2. 自身回折形成局部雙螺旋(二級(jí)結(jié)構(gòu)) 3. 進(jìn)而折疊（三級(jí)結(jié)構(gòu)） 4.多數(shù)形成核蛋白復(fù)合物（四級(jí)結(jié)構(gòu)） 如：核糖體、拼接體、編輯體等。,結(jié)構(gòu)特點(diǎn),核糖核苷酸通過(guò) 3，5，-磷酸二酯鍵相連形成長(zhǎng)鏈,RNA的種類(lèi)、分布、功能,除了上述三種RNA外，細(xì)胞的不同部位存在的許多其他種類(lèi)的小分子RNA，統(tǒng)稱(chēng)為非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。,核糖體,RNA,核內(nèi)不均一,RNA,核內(nèi)小,RNA,細(xì)胞核和胞液,線粒體,功,能,rRNA,mRNA,mt,rRNA,tRNA,mt,mRNA,mt,tRNA,HnRNA,SnRNA,SnoRNA,scRNA/7SL,-,RNA,核糖體組分,蛋白質(zhì)合成模板,轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸,成熟,mRNA,的前體,參與,hnRNA,的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn),rRNA,的加工、修飾,蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成,的信號(hào)識(shí)別體的組分,RNA,信使RNA,轉(zhuǎn)運(yùn)RNA,RNA,核內(nèi)小,胞漿小RNA,細(xì)胞核和胞液,線粒體,功,能,rRNA,mRNA,mt,rRNA,tRNA,mt,mRNA,mt,tRNA,HnRNA,SnRNA,SnoRNA,scRNA/7SL,-,RNA,蛋白質(zhì)合成模板,轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸,的前體,的加工、修飾,蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成,的信號(hào)識(shí)別體的組分,核仁小RNA,含量,80 5 10-15,一、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的結(jié)構(gòu)與功能,tRNA占細(xì)胞RNA總量的15%，在細(xì)胞核內(nèi)形成，分子量最小； tRNA在細(xì)胞質(zhì)中將氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體-mRNA中，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成； 細(xì)胞內(nèi)有50種以上的tRNA； tRNA分子較小，沉降系數(shù)平均為4S。,由7090個(gè)核苷酸組成 含 1020% 稀有堿基 3末端為 CCA-OH 5末端大多數(shù)為G 具有 TC,（一）tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn),稀有堿基,（二）tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)三葉草型模型,1,2,3,反密碼子環(huán),反密碼子,載運(yùn)氨基酸,四環(huán)四臂,氨基酸臂：由7對(duì)bp組成，富含G， 末端為CCA，接受活化AA 二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)） 由814個(gè)核苷酸組成，含有二氫尿嘧啶核苷（D），與氨基酰tRNA合成酶的結(jié)合有關(guān) 反密碼環(huán)：識(shí)別mRNA上的密碼子 可變環(huán)：大小是tRNA分類(lèi)的重要指標(biāo) 假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核苷環(huán)（T C環(huán)）： 含有保守的T C順序，可識(shí)別核蛋白體上的rRNA, 促使tRNA與核蛋白體結(jié)合,（三） tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu) 倒L形,tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)像倒寫(xiě)的字母“L” 氨基酸臂和T C臂同軸排列，形成12bp的連續(xù)雙螺旋 反密碼子臂和D臂同軸排列，跟氨基臂所在軸垂直 D環(huán)和T C環(huán)組成倒L的轉(zhuǎn)角，兩環(huán)間的氫鍵和堿基堆積力穩(wěn)定了轉(zhuǎn)角構(gòu)象 D環(huán)， T C環(huán)和可變環(huán)中核苷酸殘基形成了特定的堿基對(duì)，穩(wěn)定了tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu),tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn),tRNA的功能： 結(jié)合活化氨基酸（ 3-CCA-OH ），搬運(yùn)氨基酸到核糖體 識(shí)別mRNA密碼子。 參與蛋白質(zhì)的翻譯。,rRNA的特點(diǎn) rRNA占細(xì)胞RNA總量的80%，分子量最大 核糖體由40%的蛋白質(zhì)和60%的rRNA組成 rRNA自身的構(gòu)象決定了核糖體亞基的形態(tài) 催化肽鍵合成的是rRNA 蛋白質(zhì)維持rRNA構(gòu)象，起輔助作用,二、核蛋白體RNA的結(jié)構(gòu)與功能,rRNA的功能 參與組成核蛋白體，催化肽鍵的形成。,rRNA的種類(lèi)（根據(jù)沉降系數(shù)）,真核生物 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA,原核生物 5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA,復(fù)雜的多環(huán)多臂結(jié)構(gòu),大腸桿菌16s rRNA,核蛋白體的組成,三、信使RNA的結(jié)構(gòu)與功能,結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 1. mRNA占細(xì)胞總RNA的3%-5%，含量最少 2. mRNA編碼區(qū)的核苷酸序列決定蛋白質(zhì)的氨基酸序列 3. mRNA分子中含有非編碼區(qū),4. 大多數(shù)真核mRNA的5末端均在轉(zhuǎn)錄后加上一個(gè)7-甲基鳥(niǎo)苷，同時(shí)第一個(gè)核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-。 mRNA的帽子結(jié)構(gòu)可保護(hù)mRNA免受核酸酶從5端的降解，并在翻譯起始中起重要作用。,5. 大多數(shù)真核mRNA的3末端有200多個(gè)腺苷酸殘基的結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為多聚A尾。其作用在于增加mRNA的穩(wěn)定性和維持其翻譯活動(dòng)。,5末端帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppN 3末端有多聚腺苷酸尾巴結(jié)構(gòu)(polyA) 單順?lè)醋樱ㄒ粭lmRNA鏈上有一個(gè)編碼區(qū)）,真核生物、原核生物mRNA一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn),（1）真核細(xì)胞mRNA,真核生物mRNA的共價(jià)結(jié)構(gòu),原核生物mRNA為多順?lè)醋樱瑹o(wú)修飾堿基。 （多順?lè)醋觤RNA：一條mRNA鏈上有多個(gè)編碼區(qū)）,（2）原核細(xì)胞mRNA,原核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯同時(shí)進(jìn)行，不需剪接和加工，直接指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成 真核生物先在核內(nèi)合成包含內(nèi)含子和外顯子的mRNA前體，形成分子大小不均一的核內(nèi)不均一RNA(hnRNA)。 hnRNA通過(guò)剪接和加工，轉(zhuǎn)化為成熟的mRNA, 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。,真核生物、原核生物mRNA成熟過(guò)程的特點(diǎn),內(nèi)含子 (intron),真核生物mRNA成熟過(guò)程,外顯子 (exon),真核生物,原核生物,mRNA的功能 把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。,四、snRNA和snoRNA,核小RNA（ snRNA）含量及分布 主要存在于細(xì)胞核中，含量占總RNA量的0.1%1%。 snRNA存在形式及作用 snRNA均與蛋白質(zhì)相連，以核糖核蛋白的形式存在。 在hnRNA的剪接、細(xì)胞分裂和分化、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸及構(gòu)成染色體等方面起作用。,核仁小RNA（snoRNA)： 位于核仁，幾十幾百個(gè)堿基。 snoRNA參與rRNA前體的加工以及部分核苷酸的甲基化修飾。,五、反義RNA和RNA干擾,反義RNA（asRNA)的特性 asRNA在翻譯水平上抑制基因表達(dá)，還可抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。 asRNA穩(wěn)定性較差。 RNA干擾（RNAi) 利用雙鏈RNA抑制特定基因表達(dá)的技術(shù)。 （應(yīng)用一段與asRNA序列互補(bǔ)的RNA，兩者構(gòu)成雙鏈，穩(wěn)定性增強(qiáng)，抑制率增加）,六、非編碼RNA的多樣性,高等生物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有97%以上是不編碼蛋白質(zhì)的。 非編碼RNA（ncRNA）：不編碼蛋白質(zhì)，以RNA形式發(fā)揮作用。,按ncRNA的功能分類(lèi) 催化RNA（cRNA)：核酶，有催化功能并參與RNA的加工 類(lèi)似mRNA的RNA： 指導(dǎo)RNA（gRNA): 指導(dǎo)mRNA編輯的小RNA分子 tmRNA：既可以轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸，又可以作為模板 端粒酶RNA: 作為染色體端粒復(fù)制的模板 信號(hào)識(shí)別顆粒（SRP）：參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn) 微小RNA（miRNA): 參與基因表達(dá)和個(gè)體發(fā)育的調(diào)控 小干擾RNA（siRNA): 在RNA干擾中介導(dǎo)靶mRNA降解,ncRNA的分類(lèi),2. 按ncRNA的分布分類(lèi),核小RNA（snRNA） 剪接體snRNA U7-snRNA 核仁小RNA（snoRNA) 最豐富的ncRNA, 參與rRNA及其他RNA的加工成熟 胞質(zhì)小RNA（scRNA） 位于細(xì)胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的合成過(guò)程 Cajal 小體小RNA（CBs） 參與核糖甲基化和假尿嘧啶形成,3. 按ncRNA的大小分類(lèi),2125nt的ncRNA 包括miRNA家族和小干擾RNA家族，參與基因表達(dá)。 100200nt的ncRNA 參與細(xì)菌細(xì)胞的翻譯調(diào)節(jié) 大于10000nt的ncRNA 參與高級(jí)真核生物的基因沉默,RNA既可以作為遺傳物質(zhì)，又可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的使命,RNA可能是DNA和蛋白質(zhì)的共同祖先； 生物進(jìn)化早期可能是一個(gè)由RNA主導(dǎo)的世界,核 酸 的 理 化 性 質(zhì),第 七 節(jié),一、核酸一般理化性質(zhì),（一）核酸的水解,酸、堿、酶水解 水解位點(diǎn)在磷酸二酯鍵和糖苷鍵 DNA/RNA對(duì)酸/堿的耐受程度有差別 堿性條件下，RNA可被稀堿水解；而DNA變性，但不被水解；可用此法測(cè)定RNA的堿基組成或去除RNA雜質(zhì) 酸性條件下，糖苷鍵不穩(wěn)定，嘌呤與脫氧核糖間的糖苷鍵最易被水解；故對(duì)核酸部分水解時(shí)，很少采用酸水解,（二）核酸的酸堿性質(zhì),1、堿基的解離,具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，能發(fā)生酮式/烯醇式互變 堿基都具有弱堿性（主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻(xiàn)）,2、核苷的解離 戊糖可增強(qiáng)堿基的解離 核糖中的羥基也可發(fā)生解離 3、核苷酸的解離 磷酸基使核苷酸具有很強(qiáng)的酸性,核酸為兩性物質(zhì)，通常具有較強(qiáng)的酸性（在中性溶液中帶負(fù)電荷）； DNA等電點(diǎn)為44.5；RNA等電點(diǎn)為22.5,DNA是白色線性高分子，粘度極大；RNA為白色粉末，粘度較小 DNA和RNA均微溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，常用乙醇從溶液中沉淀核酸 加熱時(shí)，D核糖濃鹽酸苔黑酚 綠色 D-2脫氧核糖酸二苯胺 藍(lán)紫色,（三）核酸的其他理化性質(zhì),二、核酸的紫外吸收性質(zhì),堿基含有共軛雙鍵，可強(qiáng)烈吸收250290nm處的紫外光，最大吸收峰260nm左右 核酸紫外吸收性質(zhì)的應(yīng)用 可利用紫外光照相來(lái)定位測(cè)定核酸在細(xì)胞和組織中的分布 每摩爾堿基在一定PH下的紫外吸收值為定值，故利用此性質(zhì)可定量堿基或堿基衍生物在純?nèi)芤褐械暮?利用堿基的紫外吸收性質(zhì)可確定其在色譜和電泳譜上的位置 載體（淺藍(lán)色熒光）， 核酸區(qū)（暗區(qū)）,增色效應(yīng) 將核酸水解為核苷酸，紫外吸收值會(huì)增加30%40%，這種現(xiàn)象稱(chēng)為增色效應(yīng),原因：雙螺旋結(jié)構(gòu)中，堿基有規(guī)律的緊密堆積降低了其對(duì)紫外光的吸收,DNA或RNA的定量 OD260=1.0相當(dāng)于 50g/ml雙鏈DNA 40g/ml單鏈DNA（或41.67g/ml RNA） 20g/ml寡核苷酸 DNA濃度（g/ml)=OD260 50; RNA濃度(g/ml)= OD260 41.67 2.判斷核酸樣品的純度 DNA純品: OD260/OD280 = 1.8 RNA純品: OD260/OD280 = 2.0 含雜蛋白及苯酚，比值會(huì)降低,OD260的應(yīng)用,三、 核酸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素, 堿基堆積力 堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，堿基平面間的范德華力和疏水作用力共同組成堿基堆積力，是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要因素。 堿基配對(duì)的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。 環(huán)境中的正離子 磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的正離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負(fù)電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。,四、DNA的變性(denaturation),（一）定義：在某些理化因素作用下，雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，DNA雙鏈解開(kāi)成兩條單鏈無(wú)規(guī)則線團(tuán)狀態(tài)的過(guò)程。,變性時(shí)，某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子高級(jí)結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及生物活性發(fā)生改變。 但不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級(jí)結(jié)構(gòu)不變,核酸降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯鍵的斷裂,DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂,DNA變性,影響核酸變性的因素： 過(guò)量酸，堿，加熱（一般75）， 變性試劑如尿素、酰胺， 某些有機(jī)溶劑（如乙醇、丙酮等）,變性后理化性質(zhì)的改變：,OD260增高、粘度下降、比旋度下降、 浮力密度升高、酸堿滴定曲線改變、 生物活性喪失,RNA變性：從螺旋到線團(tuán)之間的轉(zhuǎn)變 RNA的變性引起的性質(zhì)變化沒(méi)有DNA明顯,核酸變性引起紫外吸收值的增加-增色效應(yīng),DNA的紫外吸收光譜,完全變性后核酸紫外吸收值增加： 天然DNA 2540%、RNA 約1.1% 實(shí)質(zhì)：堿基暴露,由于變性或降解引起核酸紫外吸收增加的現(xiàn)象稱(chēng)增色效應(yīng),OD260 : 單核苷酸單鏈DNA雙鏈DNA,1. 解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA稀鹽溶液的過(guò)程中以溫度對(duì)A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱(chēng)為解鏈曲線。,（二）核酸的熱變性及Tm,變性過(guò)程是“躍變式”的，而非漸變,2. Tm：變性是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱(chēng)為DNA的解鏈溫度，又稱(chēng)熔解溫度(melting temperature, Tm)。其大小與G+C含量成正比。,雙鏈RNA比雙鏈DNA穩(wěn)定，Tm高大約20 C 一般DNA Tm 值在85 - 90 C之間,3. 影響Tm的因素,G-C含量：G-C含量越高，Tm越高 經(jīng)驗(yàn)公式:（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 溶液的離子濃度：濃度越低，Tm越低 離子溶液的PH PH大于11.3時(shí)，堿基不能形成氫鍵，DNA完全變性；PH小于5.0，DNA易脫嘌呤 變性劑：變性劑可破壞氫鍵，使Tm下降,五、DNA的復(fù)性,1. DNA復(fù)性(renaturation)的定義 在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱(chēng)為復(fù)性。 DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。,減色效應(yīng) DNA復(fù)性時(shí)，其紫外吸收降低,變性和復(fù)性是可逆的， 將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。 熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過(guò)程稱(chēng)為退火(annealing) 。退火溫度Tm25,2. 影響復(fù)性的因素,復(fù)性的溫度：Tm25是合適的溫度，不宜太低 單鏈片段的濃度：濃度越高，碰撞頻率越高，復(fù)性越快 單鏈片段的長(zhǎng)度：片段越大，錯(cuò)配率越高，復(fù)性越慢 單鏈片段的復(fù)雜度：重復(fù)序列越多，復(fù)雜度越小，越易 形成互補(bǔ)區(qū)，復(fù)性速度越快 溶液的離子濃度：維持一定的正離子濃度，消除磷酸基負(fù)電荷引起的斥力，可加快復(fù)性,六、 核酸的分子雜交,熱變性的DNA在復(fù)性過(guò)程中，具有堿基序列部分互補(bǔ)的不同的DNA之間或DNA與RNA之間形成雜化雙鏈的現(xiàn)象。這樣形成的新分子稱(chēng)為雜交DNA分子。 核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。,探針,探針技術(shù)：在核酸雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種用于研究和診斷的新技術(shù)。 探針(probe)：經(jīng)同位素或熒光標(biāo)記的具有特定堿基序列的單鏈核苷酸聚合體。 探針可用于：基因診斷、致病基因的定位、Southern blotting、Northern blotting、原位雜交、DNA芯片技術(shù)等臨床實(shí)踐和科研。,核酸分子雜交是根據(jù)兩條核酸單鏈在一定條件下可按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈的原理，用已知的單鏈核苷酸片段作為探針檢測(cè)樣本中是否存在與其互補(bǔ)的同源核酸序列的方