生化分離工程實(shí)驗(yàn).ppt

生化分離工程實(shí)驗(yàn),指導(dǎo)老師：何 進(jìn) 教 授 電子郵箱： 聯(lián)系電話助教學(xué)生： 趙有文 劉 舒 胡軼敏 危雅樂 ,菌株的優(yōu)化培養(yǎng),總DNA或RNA的抽提,PCR或RT-PCR擴(kuò)增目的基因,乙醇沉淀回收線性化片斷,大腸桿菌表達(dá)載體pET-28,酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5,挑取轉(zhuǎn)化子并抽提質(zhì)粒驗(yàn)證表達(dá)質(zhì)粒(PCR及酶切驗(yàn)證),檢索感興趣的基因（hfq/fabz）,直接優(yōu)化并合成,連T載測序,結(jié)晶,結(jié)構(gòu)解析,本次試驗(yàn)內(nèi)容,本次試驗(yàn)的主要內(nèi)容,His-Tag系統(tǒng),pMAL系統(tǒng),無細(xì)胞體系,目的基因的背景資料,Hfq,fabZ,Hfq是一個高度保守的RNA結(jié)合蛋白，最初被發(fā)現(xiàn)是作為大腸桿菌RNA噬菌體Q復(fù)制所必需的管家因子?，F(xiàn)在則被認(rèn)為是細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵因子，廣泛參與細(xì)菌多種生命活動的調(diào)控。,大腸桿菌fabZ基因編碼3-羥基脂酰ACP脫水酶，是大腸桿菌中的必須基因，該基因的突變會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。,生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期五）,一，接種 按1%的接種量將兩種菌株分別加入到含抗生素的LB培養(yǎng)基中 ,做好標(biāo)記（寫清組號，菌株信息、抗性），統(tǒng)一放于第八組臺面。,生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期五）,將超凈臺內(nèi)PA瓶中剩余的菌液用槍吸取200 l于1.5 ml離心管中，10000 rpm/min離心1 min，棄上清，加入200 l的無菌水洗滌菌體上殘留的培養(yǎng)基 10000 rpm/min離心1 min，棄上清，然后重懸于40 l滅過菌的去離子水中，100 煮15 min， 10000 rpm/min離心1 min，取上清9.2 l作為菌落PCR的模板。,二，菌液PCR （驗(yàn)證目的基因已轉(zhuǎn)入宿主菌中）,PCR體系,H2O 9.2 l 10 X PCR buffer 2.5 l dNTP 2 .0 l 上游引物 0.5 l 下游引物 0.5 l Taq酶 0.3 l 模板 10 l 總體積 25 l,PCR程序,95 5 min 95 35 s 56 40 s 72 60 s 72 10 min 25 10 min,Cycle 30,注：用質(zhì)粒做陽性對照，水做陰性對照，不用重復(fù)，PCR管上做好標(biāo)記！,The pMAL-c2 series of vectors have an exact deletion of the malE signal sequence, resulting in cytoplasmic expression of the fusion protein. The pMAL-p2 series of vectors contain the normal malE signal sequence, which directs the fusion protein through the cytoplasmic membrane, and the fusion proteins can be exported to the periplasm,三，誘導(dǎo),注：在加入IPTG之前，搖勻菌液并各取1 ml于1.5 ml的離心管中，做好標(biāo)記（組號，菌液名）記作“誘導(dǎo)前”，放于第八組桌面的離心管板中，于20 保存。,四，配試劑,依據(jù)每組發(fā)的紙條進(jìn)行,生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期五）,將加入誘導(dǎo)劑后的菌液再放入37 200 rpm/min的搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)4-5小時后收集菌體。,注：在離心沉淀之前搖勻菌液取1 ml于1.5 ml的離心管中，做好標(biāo)記（組號，菌液名）記作“誘導(dǎo)后” 放在第八組的離心管板上。 離心時用天平嚴(yán)格配平，沉淀重懸后做好標(biāo)記放于第八組桌面上！,六，收菌,組氨酸和Ni-NTA,親和作用原理,6His/Ni-NTA親和純化步驟,系統(tǒng)原理示意圖,pMAL,Ni柱的清洗與保存,用水洗3次（去掉保存的20%乙醇）,充電（裝滿NiSO4，溫和搖動后自然沉降）,洗滌（3次水洗，去掉游離的Ni),平衡（2次的binding buffer洗）,HisTag 蛋白質(zhì)的純化步驟,上樣（每次15ml，樣品要與柱子充分結(jié)合）,加washing buffer（用100%TCA檢測不出沉淀為止）,加 Elution buffer （一般收集8ml）,重復(fù)第48步,第 1步：2倍體積 6 M 鹽酸胍，0.2 M醋酸 第 2步：2倍體積水 第 3步：1倍體積 2% SDS（注意低溫容易析出） 第 4步：1倍體積 25%乙醇 第 5步：1 倍體積 50%乙醇 第 6步：1 倍體積 75%乙醇 第 7步：5 倍體積 100%乙醇 第 8步：1倍體積 75%乙醇 第 9步：1倍體積 50%乙醇 第 10步：1倍體積 25%乙醇 第 11步：1倍體積水 第 12步：5倍體積 100 mM EDTA，pH8.0 第 13步：3倍體積水,由于 EDTA處理后仍可有少量蛋白未能完全釋放，建議在純化不同蛋白時應(yīng)另換 HisBind 樹脂。,樹脂的再生,當(dāng)柱流速明顯下降，或樹脂在使用離子化緩沖液處理之后沒能顯示深藍(lán)綠色，則樹脂需要更徹底的清洗處理。,直鏈淀粉柱的再生,生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期六）,一、裂解細(xì)胞,將冷凍保存的細(xì)胞團(tuán)在室溫下解凍，冰上破碎至菌液成澄清（ 200-300w超聲610s-10s，約20 min）,天平嚴(yán)格配平后10000*g， 4，離心20 min。上清取1 ml于1.5 ml離心管中，作標(biāo)記為“上清”，沉淀用1 ml對應(yīng)的buffer（his-tag為binding buffer，pMAL為column buffer）重懸后，保存在1.5 ml的離心管中，標(biāo)記為“沉淀”，做好組號和菌株標(biāo)記后，放于第八組臺面。,二，蛋白純化,注：收集到的蛋白做好標(biāo)記后須在冰上保存，避免其失活,pMAL系統(tǒng)MBP標(biāo)簽的切除 從A595最大的幾管(一般是第一、二管)取100 l用于蛋白酶FactorXa的酶解，在100 l洗脫液中取15 ul保存在pcr管中，作為酶切對照，剩下的加入2 ul的FactorXa后置于搖床上震蕩反應(yīng)，室溫下反應(yīng)18 h，分別于第1h、3 h、6 h、17 h取樣15 l。,三，SDSPAGE樣品的制備,將收集到的14管目的蛋白和之前保存的 “上清”“沉淀”“穿透”（共6管）蛋白各取出20 ul于對應(yīng)的已經(jīng)標(biāo)記的1.5 ml離心管中，加入20 ul SDS-PAGE loading buffer ，將先前保存的“誘導(dǎo)前”“誘導(dǎo)后”（共4管）于10000rpm/min離心1min，棄上清，沉淀用15ul對應(yīng)的buffer重懸，再加入15ul SDS-PAGE loading buffer，沸水浴15 min后，放于第八組臺面。,無細(xì)胞體系,生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期六）,四，Bradford protein assay,1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作,（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。,（2）考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50 ml 95%的乙醇后，再加入120 ml 85%的磷酸，用蒸餾水稀釋至1 L。,每加完一管立即在漩渦振蕩器上混合，25 min后以1號為對照調(diào)零測A595以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（ug）為橫坐標(biāo)，用吸光度A595為縱坐標(biāo)作標(biāo)曲,注;震蕩過程中不要太劇烈，以免產(chǎn)生較多氣泡而無法消除,五，未知蛋白濃度的測定,將保存的純化的蛋白各取50 ul，加50 ul蒸餾水后再加入5 ml考馬斯亮藍(lán)G-250染液試劑，漩渦震蕩后靜止25 min，以0.1 ml水加 5.0 ml的G-250試劑調(diào)零，測其在595nm處的吸光度。,生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期六）,六， 配制SDS-PAGE,每組配兩塊，均采用15孔梳子,注：在配膠前注意梳子厚度（1.0mm和1.5mm）與膠板厚度的一致性,生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期天）,跑SDS-PAGE 點(diǎn)樣：所有的樣品和蛋白Marker點(diǎn)樣前都要沸水浴5分鐘使蛋白質(zhì)完全變性。一般的點(diǎn)樣量為10-20 ul。(記錄點(diǎn)樣順序) 點(diǎn)樣完畢后即可開始電泳，先以80伏電壓跑15-20分鐘，蛋白質(zhì)通過積層膠后，更換到120伏，待溴酚藍(lán)接近分離膠底部后停止電泳，取下膠板，小心撬開膠板割取分離膠，放入染色皿中，加入一定染色液（沒過膠面即可）。置于搖床上染色3小時左右。 染色完畢后，回收染色液，加入脫色液，搖床脫色數(shù)次，最后一次可以過夜脫色。,SDS-PAGE的原理,聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺 (Acr) 和交聯(lián)劑N，N亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。,聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE),陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉SDS,打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，包裹蛋白,根據(jù)蛋白所帶電荷差異和分子大小不同來分離,掩蓋電荷差異和形狀區(qū)別，而只與分子量有關(guān),SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,是以聚丙烯胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳,引發(fā)劑是過硫酸銨(AP)，催化劑N、N、N、N四甲基乙二胺（TEMED），它的堿基催化A