第二章-2 基因克隆載體-9.9.ppt

1、第二章 基因工程的基本條件,一、用于核酸操作的工具酶 二、基因克隆載體 三、目的基因的制備 四、基因工程受體菌或細(xì)胞,二、基因克隆載體,（一）載體的功能及特征 （二）質(zhì)粒 （三）噬菌體或病毒DNA （四）Cos質(zhì)粒與噬菌粒 （五）人工染色體載體,（一）載體的功能及特征,在基因工程操作中，能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子。,載體(vector)：,載體的功能：,為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。,運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；,為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；,載體應(yīng)具備的條件：,具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性(可轉(zhuǎn)移性)；,具有合適的篩選標(biāo)記。,具有較高的外源DNA載裝能力；,

2、具有多種單一的限制酶酶切位點(diǎn)；,具有與受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)；,基本概念：,2）存在于細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。,（二）質(zhì)粒(plasmid),1）是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的核酸分子。,The genomic DNA of E.coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell,plasmid DNA,Genomic DNA,4）絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈結(jié)構(gòu)(

3、covalently closed circular DNA, cccDNA)，以超螺旋形式存在。,3）絕大多數(shù)質(zhì)粒是DNA型的；,酵母的殺傷質(zhì)粒(killer plasmid)是RNA。,7）最大裝載量：15 kb（5%）。,5）分子大?。?-300 kb；,質(zhì)粒不是單純的寄生，攜帶的遺傳信息賦予細(xì)菌特定的遺傳性狀，如抗生素抗性基因Ampr。,質(zhì)粒與宿主細(xì)胞的關(guān)系：,質(zhì)粒對(duì)宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主細(xì)胞中。,質(zhì)粒離開宿主就無法生存，只有依賴宿主細(xì)胞的幫助，才能完成自身的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄。,質(zhì)粒的基本特征：,自主復(fù)制性,不相容性,可轉(zhuǎn)移性,攜帶特殊的遺傳標(biāo)記,1、自主復(fù)制性,質(zhì)

4、粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系。,質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)，進(jìn)行自主復(fù)制。,嚴(yán)緊型質(zhì)粒,根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃椋?松弛型質(zhì)粒,1-3拷貝/cell，復(fù)制受細(xì)胞核控制，伴隨染色體DNA復(fù)制而復(fù)制。,如：pSC101、p15A。,1）嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringent plasmid)：,加入氯霉素（終濃度10-170g/ml）抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，可達(dá)3000拷貝/cell 。,2）松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)：,如：pMB1、ColE1。,10-200拷貝/cell，復(fù)制不受細(xì)胞核控制，染色體DNA復(fù)制停止時(shí)，仍可進(jìn)行復(fù)制。,

5、2、不相容性(incompatibility),指任何兩種含相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中。,分子機(jī)制：,兩種含不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受各自的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，經(jīng)若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后，仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)。,兩種含相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受同一拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢。,不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群，如：,ColE1、pMB1有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容；,pSC101、F、RP4有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容；,p15A及其衍生質(zhì)粒有相似

6、復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容。,3、可轉(zhuǎn)移性,接合型質(zhì)粒(conjunctive plasmid),非接合型質(zhì)粒(nonconjunctive plasmid),除帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外，還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。,1）接合型質(zhì)粒：,能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞，如F質(zhì)粒。,符合基因工程的安全要求。,2）非接合型質(zhì)粒：,不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用，如ColE1質(zhì)粒。,雖帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。,值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（如ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由 b

7、om和mob基因決定。,4、攜帶特殊的遺傳標(biāo)記,這些標(biāo)記基因?qū)χ亟MDNA篩選有重要意義。,野生型質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，使寄主產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀。,抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物,抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿,質(zhì)粒的空間構(gòu)型：,共價(jià)、閉合、環(huán)狀DNA(cccDNA) 超螺旋(super coil DNA, scDNA),開環(huán)DNA(open circular DNA, ocDNA) 一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口,線形DNA(linear DNA, L-DNA),質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率：,質(zhì)粒的分類,1、按功能：,F質(zhì)粒(fertility factor),R質(zhì)粒(r

8、esistance factor),Col質(zhì)粒(coliconogenic factor),1）F質(zhì)粒：,性質(zhì)粒，決定細(xì)菌性別，能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。,R質(zhì)粒：,Col質(zhì)粒：,大腸桿菌素質(zhì)粒，帶有控制大腸桿菌素合成的基因，合成大腸桿菌素，殺死不含Col質(zhì)粒的親緣細(xì)菌。,接合型質(zhì)粒,2、按轉(zhuǎn)移方式：,非接合型質(zhì)粒,3、按復(fù)制機(jī)理：,接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型。,非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型。,4、按分子量大?。? 15kb，多為接合型質(zhì)粒；, 15kb，多為非接合型質(zhì)粒。,質(zhì)粒的構(gòu)建,分子量大；,野生型質(zhì)粒的特性提供了以其為基礎(chǔ)、人工構(gòu)建載體分子的可能。,拷

9、貝數(shù)低；,單一酶切位點(diǎn)少；,遺傳標(biāo)記不理想。,如：天然質(zhì)粒pSC101分子量9.09kb，只有1個(gè)EcoR I切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，篩選標(biāo)志只有Tetr。,可通過插入失活篩選，但免疫篩選E1的操作非常麻煩。,ColE1的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1，唯一的克隆位點(diǎn)EcoR I正好位于這個(gè)基因內(nèi)部。,大于20kb的質(zhì)粒很難導(dǎo)入受體細(xì)胞，且極不穩(wěn)定。,質(zhì)粒的改造與構(gòu)建：,盡量縮小質(zhì)粒的相對(duì)分子量，提高外源DNA的裝載量。,1）刪除不必要的DNA區(qū)域，,滅活對(duì)質(zhì)粒復(fù)制產(chǎn)生負(fù)調(diào)控效應(yīng)的基因，提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)。,2）滅活某些編碼基因,滅活促進(jìn)質(zhì)粒在細(xì)菌種間轉(zhuǎn)移的mob基因，杜絕重組質(zhì)粒擴(kuò)散污染環(huán)境，保證DNA重

10、組實(shí)驗(yàn)的安全性。,最好有兩種選擇標(biāo)記基因，并且在選擇標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)有合適的克隆位點(diǎn)。,3）加入選擇標(biāo)記基因：,當(dāng)外源DNA片段插入克隆位點(diǎn)后，標(biāo)記基因失活，成為選擇克隆子的依據(jù)。,氨芐青霉素抗性（ampicillin, Ampr） 卡那霉素抗性（kanamycin, Kanr） 四環(huán)素抗性（tetracycline, Tetr） 鏈霉素抗性（streptomycin, Strr） 氯霉素抗性（chloromycetin, Chlr）,常用的選擇標(biāo)記：,3）在選擇標(biāo)記基因內(nèi)，引入人工合成的多種限制酶連續(xù)酶切位點(diǎn)的DNA短序列，即多克隆位點(diǎn)(multiple cloning sites, MCS)，

11、也稱多酶接頭(polylinker)。,同時(shí)刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)，使其單一化。,4）根據(jù)外源基因克隆的不同要求，分別加裝特殊的基因表達(dá)調(diào)控元件。,實(shí)驗(yàn)室用質(zhì)粒多以少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建：,pSC101：8.8kb，拷貝數(shù)5，四環(huán)素抗性基因Tetr。,ColE1：6.5kb，拷貝數(shù)20-30（氯霉素誘導(dǎo)可達(dá)1000-3000），大腸桿菌素基因E1。,RSF2124：ColE1衍生質(zhì)粒，氨芐青霉素抗性基因Ampr。,1、高拷貝質(zhì)粒：,1）含有氯霉素可擴(kuò)增的松弛型復(fù)制子結(jié)構(gòu)，如ColE1、pMB1派生質(zhì)粒、pBR系列；,用于克隆和擴(kuò)增外源基因。,2）復(fù)制子經(jīng)人工誘變，解除對(duì)質(zhì)?？截悢?shù)的負(fù)控制作用

12、，使質(zhì)粒在每個(gè)細(xì)胞中達(dá)數(shù)千拷貝。,如：pBR322：,ori-ColE1 Tetr-pSC101 Ampr-pSP2124,2、低拷貝質(zhì)粒：,某些毒性基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時(shí)，會(huì)嚴(yán)重影響宿主菌的正常代謝活動(dòng)、導(dǎo)致宿主菌死亡，就需要低拷貝載體。,如pLG338/339、pHSG415等pSC101派生質(zhì)粒，拷貝數(shù)10，用于表達(dá)某些毒性基因。,3、溫敏質(zhì)粒：,即溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒，在不同溫度 下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)。,4、測序質(zhì)粒：,高拷貝復(fù)制，含有多克隆位點(diǎn)(MCS)，便于外源DNA的克隆與擴(kuò)增，在MCS兩端鄰近區(qū)域，有通用引物互補(bǔ)序列，便于測序。,如：pUC18/19、M13 mp系列

13、、pGEM-T。,如：pUC18/19：,r,BamH I,pUC18,2,686 bp,Amp,lacZ,ori,GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT,EcoR I,Sst I,Kpn I,Sma I,Xba I,Sal I,Pst I,Sph I,Hind III,ori-PBR322、Ampr-PBR322,pUC18/19正選擇標(biāo)記lacZ的顯色原理:,底物：5-溴-4-氯-3-吲哚基-D-半乳糖苷 （X-gal）,（-互補(bǔ)）,5、整合質(zhì)粒：,含整合酶編碼基因和整合特異性位點(diǎn)序列，克隆在這種質(zhì)粒上的外源基因進(jìn)

14、入受體細(xì)胞后，能準(zhǔn)確整合在受體細(xì)胞染色體DNA的特定位點(diǎn)。,便于外源基因的整合。,6、穿梭質(zhì)粒(shuttle plasmid)：,如：E.coli-酵母菌、E.coli-哺乳動(dòng)物細(xì)胞穿梭質(zhì)粒。,克隆的外源基因可不用更換載體、直接從一種受體菌轉(zhuǎn)入另一種受體菌中復(fù)制并遺傳。,含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)、相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因，能在兩種不同種屬的受體細(xì)胞中復(fù)制并被檢測。,E.coli-Pichia.pastoris穿梭質(zhì)粒,E.coli-HEK293穿梭質(zhì)粒,7、表達(dá)質(zhì)粒：,在多克隆位點(diǎn)的上、下游，分別裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化元件，使外源基因能在受體細(xì)胞中高效表達(dá)、便于下游純化。,

15、pGEM-3Z：,注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體RNA聚合酶識(shí)別，相應(yīng)的受體菌需表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如BL21(表達(dá)T7 RNA聚合酶)。,MCS,lacZ,PT7,ori,Ampr,PSP6,pET-3a：,pET-28a：,只有含啟動(dòng)子或終止子的外源DNA插入載體的合適位點(diǎn)，報(bào)告基因才能表達(dá)，表達(dá)量的高低直接反映表達(dá)調(diào)控元件的強(qiáng)弱。,8、探針質(zhì)粒：,用于篩選表達(dá)調(diào)控元件，如啟動(dòng)子、終止子。,通常裝有一個(gè)可定量檢測表達(dá)程度的報(bào)告基因（如抗生素抗性基因），但缺少相應(yīng)的啟動(dòng)子或終止子，因此本身不能表達(dá)報(bào)告基因。,質(zhì)粒DNA的分離純化,氯化銫密度梯度離心法,堿裂解法,沸水浴法,氯化銫

16、密度梯度離心法,沸水浴法,堿裂解法,氯化銫密度梯度離心法,質(zhì)粒純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染；,堿裂解法,質(zhì)粒純度低、快速、操作簡便；,沸水浴法,質(zhì)粒純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間。,（三）噬菌體或病毒DNA,噬菌體(bacteriophage)或病毒(virus)是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定條件下這兩種狀態(tài)會(huì)相互轉(zhuǎn)化。,噬菌體吸附在E.coli上,噬菌體釋放、菌體裂解,T4噬菌體,The DNA is about 3,500 times longer than the viral parti

17、cle.,The electron micrograph of the single linear DNA molecule of bacteriophage T2(about 182,000 bp);,可使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。,可使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增。,噬菌體或病毒DNA能被開發(fā)為基因工程載體的原因：,E.coli的噬菌體DNA,cos位點(diǎn)對(duì)包裝至關(guān)重要。,-DNA兩端各有12個(gè)核苷酸組成的5突出粘性末端(cohensive-end)，,二者的核苷酸序列互補(bǔ)，進(jìn)入宿主細(xì)胞后，粘性末端連接成環(huán)狀DNA分子，此末端稱為cos位點(diǎn)(cohensive-end site)。,5 TC

18、CAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,溶菌周期,噬菌體的生活周期,溶源周期,烈性噬菌體(virulent phage)只有溶菌周期。,溫和噬菌體(temperate phage)既有溶源周期，又有溶菌周期。,1、溶菌周期：,2、溶源周期：,經(jīng)過若干世代后，才從細(xì)菌染色體上脫離下來，復(fù)制、合成噬菌體蛋白，組裝成新的噬菌體，導(dǎo)致菌體細(xì)胞裂解。,噬菌體感染E.coli后，除能裂解細(xì)胞（溶菌狀態(tài)）外，還能將其DNA整合到宿主細(xì)胞染色體DNA上，而不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，即溶源狀態(tài)。,整合由-DNA上cI和int基因的產(chǎn)物激活，這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。,在

19、宿主生理狀態(tài)好，即營養(yǎng)條件適合、菌體代謝旺盛的情況下，cI基因關(guān)閉，進(jìn)入溶菌狀態(tài)；在宿主生理狀態(tài)差的情況下，cI基因開放，進(jìn)入溶源狀態(tài)。,DNA重組技術(shù)需噬菌體進(jìn)入 狀態(tài)。,可根據(jù)需要，改變-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶源狀態(tài)。,溶菌,感染早期：雙鏈進(jìn)行型復(fù)制。,-DNA的復(fù)制：,-DNA載體的構(gòu)建,野生型噬菌體能包裝原-DNA長度的75-105%（37-51kb），本身長度為48.5kb， 只有當(dāng)插入的外源DNA片段2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。,縮短野生型-DNA長度，可提高裝載量。,1、縮短長度：,插入型載體 取代型載體,野生型-DNA上約4

20、0-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。,插入型載體(insertion vectors)：,取代型載體(substitution vectors)：,取代型載體的2個(gè)MCS區(qū)以反向重復(fù)形式位于-DNA非必需區(qū)的兩端，通過酶切，可將中間的非必需區(qū)切下來，與用相同酶酶切的外源DNA置換。,2、刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn),同時(shí)，為便于外源DNA的克隆，還需增加一些單一酶切位點(diǎn)。,野生型-DNA上有5個(gè)EcoR I、7個(gè)Hind III位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)。,甲基化酶處理、定點(diǎn)突變。,限制酶酶切；,3、加裝選擇標(biāo)記,野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記。,免疫功能類標(biāo)記,顏色反應(yīng)類標(biāo)記,

21、免疫功能類標(biāo)記：imm434,imm434編碼阻止-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。,噬菌體感染細(xì)菌形成的噬菌斑,顏色反應(yīng)類標(biāo)記：lacZ,lacZ基因編碼-半乳糖苷酶，在IPTG誘導(dǎo)下，能催化無色底物X-gal生成藍(lán)色化合物。,4、構(gòu)建琥珀型突變體,是指CAG(Gln)向UAG(stop)的突變。,琥珀型突變(sup)：,E.coli的某些菌株含特異性校正基因，其編碼產(chǎn)物-校正tRNA能專一性糾正這一突變。,基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。,將野生型-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。,當(dāng)這種-DNA進(jìn)入一般E.coli后，不能合成有活性

22、的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，從而阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散。,重組-DNA需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。,重組-DNA的體外包裝,用于體外包裝的蛋白可直接從感染噬菌體的E.coli中提取，已商品化，通常為互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分缺少D組份。,-這是基于安全性而設(shè)計(jì)的。,任何一種蛋白包裝液被重組-DNA污染，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。,包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行。,-DNA的分離純化,將E.coli在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期 加入-噬菌體懸浮液，37培養(yǎng)1hr

23、用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12hr,（噬菌體顆粒密度達(dá)1013-1014/L，E.coli完全裂解） 超速離心，沉淀噬菌體 酚抽提，釋放-DNA 乙醇或異丙醇沉淀-DNA,-DNA作為載體的特點(diǎn)：,可在體外包裝成噬菌體顆粒，高效感染E.coli；,裝載容量大，最大25 kb；,篩選方便；,提取比質(zhì)粒簡便；,適合外源基因的克隆和擴(kuò)增，但不適合其表達(dá)。,E.coli的M13單鏈?zhǔn)删wDNA,生物結(jié)構(gòu)：,外型呈絲狀；,由外殼包裝蛋白和單股正鏈DNA組成；,基因組為單鏈線性DNA，長6.4 kb；,DNA上至少有10個(gè)基因，均為增殖所必需。,2,700個(gè)外殼蛋白,不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長；,M

24、13噬菌體,M13的生活周期,注意：雖不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長變慢，為正常的1/2-3/4）。,M13通過雄性細(xì)菌的F性須注入其+DNA,+DNA,+DNA,注入E.coli,M13基因組中只有基因II和IV之間存在一段507bp的基因間隔區(qū)(intergenic region, IG區(qū))。,該區(qū)存在M13的ori，插入外源DNA而不影響M13噬菌體的活力，可作為克隆區(qū)。,M13 DNA載體的構(gòu)建：,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型M13 RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13 mp系列載體,lacZ,p

25、olylinker,IG,IG區(qū)內(nèi)只有1個(gè)Bsu I 切點(diǎn),M13mp18的多克隆位點(diǎn)與pUC18相同,M13 DNA載體的特點(diǎn)：,克隆的DNA以單鏈形式輸出E.coli，便于測序；,M13重組子篩選簡便；,最大缺陷是裝載量小，僅1.5 kb。,被M13感染的受體菌生長緩慢，形成混濁斑；重組DNA越大，混濁斑的混濁度越大。,動(dòng)植物病毒DNA,單鏈DNA病毒 雙鏈DNA病毒 單鏈RNA病毒 雙鏈RNA病毒,按基因組結(jié)構(gòu)，將動(dòng)植物病毒分成四類：,動(dòng)植物病毒克隆載體,雙鏈DNA病毒：如花椰菜花葉病毒(CaMV) 單鏈DNA病毒：如番茄金黃花葉病毒(TGMV) RNA病毒：如雀麥草花葉病毒(TMV),

26、RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間體，可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組。,常用的動(dòng)物病毒載體,應(yīng)用動(dòng)物病毒弱毒或無毒株:,（四）考斯質(zhì)粒與噬菌粒,-DNA和M13-DNA載體的最大裝載量分別為25kb和1.5kb，但很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段。,考斯質(zhì)粒和噬菌粒的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。,-構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。,在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。,將噬菌體DNA包裝有關(guān)序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能縮短載體長度、提高裝載量，又能保證重組DNA在體外仍被包裝成有感染性的顆粒。,由于考斯質(zhì)粒和噬

27、菌粒不攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。,考斯質(zhì)粒（Cosmid）,cos,pHC79,6.4 kb,Tetr,包裝相關(guān)序列,ori,Ampr,Pst I,BamH I,Sal I,1978年， B.Hohn J.Collins 發(fā)明構(gòu)建,考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：,能像-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染E.coli；,裝載量大（45 kb）；,能像質(zhì)粒那樣在E.coli中自主復(fù)制；,制備與質(zhì)粒相同，重組操作簡便，篩選容易；,與-DNA不同：不能體內(nèi)包裝，不裂解E.coli。,Cosmid克隆的過程,用CIP去除線性載體的5-P，可防止載體自連。,?,噬菌粒（phag

28、emid）,是一類人工構(gòu)建的含單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子和質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型載體。,噬菌粒的特點(diǎn)：,能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染E.coli；,裝載量比M13mp系列大得多（10 kb）；,能像質(zhì)粒那樣在E.coli中自主復(fù)制；,重組操作簡便，篩選容易。,通過克隆雙鏈DNA，能獲得同等長度的單一單鏈DNA；,重要的噬菌粒載體,pUC118/119 = pUC18/19的ori、Ampr、lacZ、MCS + M13-IG、ori,pUC118/119：,1）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式,2）單鏈?zhǔn)删w滾環(huán)復(fù)制模式,輔助噬菌體：,3）噬菌粒載體的包裝,高效復(fù)制的噬菌粒單鏈

29、DNA被包裝成噬菌體顆粒，被擠出宿主細(xì)胞外。,表示M13輔助噬菌體DNA,人工染色體載體,人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析需克隆數(shù)百甚至上千kb DNA片段，此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量遠(yuǎn)不能滿足需要。,細(xì)菌人工染色體 酵母人工染色體,將細(xì)菌接合因子或酵母染色體的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即構(gòu)成人工染色體載體(artificial chromosome)。,當(dāng)大片段外源DNA克隆在人工染色體載體上，便形成重組人工染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制并遺傳。,細(xì)菌人工染色體 （bacterial artificial chromosome, BAC）,1992年，H.Shizuya等在E.coli性因子