蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu).ppt

1、第四章 蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu),第一節(jié) 肽和肽鍵的結(jié)構(gòu) 第二節(jié) 肽的物理和化學(xué)性質(zhì) 第三節(jié) 天然存在的活性肽 第四節(jié) 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能 第六節(jié) 肽與蛋白質(zhì)的人工合成,Amino acids are connected head to tail,第一節(jié) 肽和肽鍵的結(jié)構(gòu),Dehydration -H2O,Carbodiimide,?,肽鍵與肽鏈,寡肽(oligo peptide) 多肽(poly peptide) 氨基酸殘基(residue):主鏈、側(cè)鏈 氨基末端(amino terminal)或N末端 羧基末端（carboxyl terminal）或C末端,肽

2、單位,酰胺平面 由肽鍵周圍的6個(gè)原子組成的剛性平面,部分雙鍵,雖是單鍵卻有雙鍵性質(zhì) 周邊六個(gè)原子在同一平面上 前后兩個(gè)a-carbon在對(duì)角(trans),C-N 0.145 nm (正常),C=N 0.133 nm,C=N 0.125 nm (正常),肽平面（酰胺平面）,Ca-C 和Ca-N 之間是s 鍵，可以自由旋轉(zhuǎn)：,兩個(gè)相鄰酰胺平面繞Ca的旋轉(zhuǎn),四肽的結(jié)構(gòu),肽鍵的構(gòu)型,穩(wěn)定 不穩(wěn)定,第二節(jié) 肽的物理和化學(xué)性質(zhì),1.每種肽也有其晶體，晶體的熔點(diǎn)都很高。 2.在pH0-14范圍內(nèi)，肽的酸堿性質(zhì)主要來(lái)自游離末端-NH 2和游離末端-COOH以及側(cè)鏈上可解離的基團(tuán)。 3.每一種肽都有其相應(yīng)的等

3、電點(diǎn)，計(jì)算方法與AA一致且復(fù)雜。 B2+,B+,B,B-,B2-,K1,K2,K3,K4,pI=pK2+ pK3/2,4. 原則：當(dāng)溶液pH大于解離側(cè)鏈的值，占優(yōu) 勢(shì)的離子形式是該側(cè)鏈的共軛堿，當(dāng)溶液pH小于解離側(cè)鏈的值，占優(yōu)勢(shì)的離子形式是該側(cè)鏈的共軛酸。 5.肽的化學(xué)反應(yīng)：也能發(fā)生茚三酮反應(yīng)、Sanger反應(yīng)、DNS反應(yīng)和Edman反應(yīng)；還可發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。,肽的顏色反應(yīng),多肽可與多種化合物作用，產(chǎn)生不同的顏色反應(yīng)。這些顯色反應(yīng)，可用于多肽的定性或定量鑒定。 如:黃色反應(yīng). 多肽的雙縮脲反應(yīng)是多肽特有的顏色反應(yīng);雙縮脲是兩分子的尿素經(jīng)加熱失去一分子NH3而得到的產(chǎn)物。 雙縮脲能夠與堿性硫酸銅

4、作用，產(chǎn)生蘭色的銅-雙縮脲絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。含有兩個(gè)以上肽鍵的多肽，具有與雙縮脲相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，也能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色或藍(lán)紫色絡(luò)合物。這是多肽定量測(cè)定的重要反應(yīng)。,第三節(jié) 天然存在的重要多肽,在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。 但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽（active peptide）。 如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,肽的來(lái)源： 蛋白質(zhì)水解 激素：insulin, 胰高血糖素，催產(chǎn) 素，加壓素，舒緩激肽 活性肽 抗生素：短桿菌肽S，多粘菌素E， 放線菌素D，抗菌

5、肽 其 它：腦啡肽，鵝膏蕈堿， GSH 活性肽中存在肽鍵，AA和DAA，以防止蛋白酶的水解。,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短桿菌肽S(環(huán)十肽) 由細(xì)菌分泌的多肽，有時(shí)也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鳥氨酸（Ornithine, 縮寫為 Orn）。,谷胱甘肽存在于動(dòng)、植物及微生物中： 1.參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng) 2.作為輔酶參與氧化還原反應(yīng) 保護(hù)巰基酶或含Cys的蛋白質(zhì)中 -SH的還原性 3.防止氧化物積累,與真核生物的RNA聚合酶和牢固結(jié)合,Section 4 Assay of protein p

6、rimary structure,Proteins can be sequenced in two ways: 1. Real amino acid sequencing 2. Sequencing the corresponding DNA in the gene,Protein Sequencing Procedure in real amino acid sequencing,1. Determination of polypeptide chain number. 2. If more than one polypeptide chain, separate them. 3. Clea

7、ve (reduce) disulfide bridges 4. Determine amino acid composition of each chain; 5. Determine N- and C-terminal residues by Edman degradation and C-terminal proteases 6. Cleave each chain into smaller fragments by site-specific proteases and determine the sequence of each chain by the above methods

8、7. Repeat the above step, using a different cleavage procedure to generate a different set of fragments. 8. Reconstruct the sequence of the protein from the sequences of overlapping fragments Determination of disulfide bridges position.,1. Determine N- terminal residues 1. FDNB：,DNP,DNP,2. DNS：,3. P

9、ITC (Edman reagent):,4. Amino peptidase：,2. Determine N- terminal residues 1.Carboxypeptidase： (1)Carboxypeptidase A cleaves all except for P, R, K; (2)Carboxypeptidase B cleaves only R and K; (3)Carboxypeptidase Y cleaves all; (4)Carboxypeptidase C cleaves all;,2. Hydrazinolysis： 3. Reduction： Pept

10、ide-COOH + sodium borohydride Peptide-CH2OH Hydrolysis AAs + AA-CH2OH,3. Cleave of disulfide bond,Oxidation of a disulfide bond by performic acid:,2. Reduction of S-S bridges by sulfhydryl compound:,4. Analysis composition of amino acids of each chain 1. 6N HCl 110 for 24, 48, 72 hours in sealed gla

11、sse vials (Trp is destroyed, must be analyzed by other means). 2. Each reaction mixture is loaded on an ion-exchange column where each amino acid can be eluted according to their charge. 3. Eluted amino acids are quantified by reacting to ninhydrin (postcolumn derivatization).,This method has been a

12、utamated (amino acid analyzer) and allows analysis of only the amount of each type of amino acids, but gives no information on the order of amino acids nor the absolute amount of each amino acid.,5. Cleave each chain into smaller fragments by site-specific proteases or chemicals Requirement：1. Less

13、cleave sites; 2. High specificity； 3. More production.,（1）Proteases cleavage： 1Trypsin：c-terminal of Arg, Lys. High specificity,2Chymotrypsin： c-terminal of Phe, Trp, Tyr.,3Thermolysin：some hydrophobic amino acids, Low specificity 4Pepsin：some hydrophobic amino acids, pH2, Low specificity 5Papain： c

14、-terminal of Arg, Lys。 Low specificity,6Staphylococcal protease（Glu protease）： phosphate Buffer(pH7.8)： c-terminal of Glu,Asp NH4HCO3 Buffer(pH7.8)： c-terminal of Glu NH4Ac Buffer(pH4.0)： c-terminal of Glu 7. Clostripain（Arg protease ）： c-terminal of Arg。,（2）Chemical cleavage： 1CNBr： c-terminal of M

15、et。 CNBr is useful because proteins usually have only few Met residues.,2NH2OH：AsnGly，Asn Lue；AsnAla。,6. Determine the sequence of each chain 1. Edman degradation：,Edman degradation uses Edman reagent to determine the order of amino acids from the N-terminal end of a protein.,2. 改進(jìn)的方法： （1）DNSEdman;

16、（2）熒光標(biāo)記或有色基團(tuán)標(biāo)記的PITC； （3）固相測(cè)序法。,7. Reconstruct the sequence of the protein from the sequences of overlapping fragments,8. Determination of sites of disulfide bonds,1. 對(duì)角線電泳法：,2. 部分還原法：,MS,An example:,Trypsin cleavage: A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K Chymotrypsin Cleavage: L-V-G-K-A-E-F S-G-I-T-P-K Edman de

17、gradation: L Correct sequence: L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K,酶解法：氨肽酶或羧肽酶。只能測(cè)末 端附近少數(shù)AA順序。 質(zhì)譜法：（next page) 間接法：測(cè)定相應(yīng)蛋白質(zhì)的DNA序列。,Mass Spectrometer,Schematic drawing of a mass spectrometer. (1) Highly charged protein droplets are formed by electrostatic dispersion of a protein solution through a glass capilla

18、ry subjected to a high electric field (electrospray); This step can also be replaced by matrix-assisted desporption ionization (MALDI) (2) Protein droplets are accelerated by electrostatic forces in vacuum; (3) the time it takes for a protein to arrive at the mass spectrometer depends on its m/z. Th

19、us an unknown protein mass can be obtained by comparing its m/z with that of a standard protein.,Mass analyzer,+,+,+,+,(1),(2),(3),High voltage,Vacuum,第五節(jié) 蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能,進(jìn)化樹,血液凝固與AA序列的局部斷裂 (1)血液凝固中的級(jí)聯(lián)過(guò)程： 凝血系統(tǒng)：12種凝血因子 凝血酶 血纖蛋白,一級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)前體的激活,凝血過(guò)程,外在途徑：組織因子（因子） 激活因子,內(nèi)在途徑：因子；,因子,(2)凝血酶和血纖蛋白原在血凝中的作用：,凝血酶原 因子 凝血酶（A鏈和B鏈）,血纖蛋白