MTT原理、步驟、結果分析方法及注意事項

1、MTT原理、步驟、結果分析方法及注意事項一、MTT原理MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-2)-3,5-diphenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定

2、細胞數(shù)范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，須被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。二、MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT濃度為5 mg/mL。因此，可以稱取MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22 m濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。

3、實驗的時候我一般關閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞絕對數(shù)。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT吸光度最好在0-0.7范圍內。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4C避光保存兩周內有效，或配制成5 mg/mL保存在-20C長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往細胞培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配置那么多液體，尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好使用透明的一次性乳膠手套

4、.配成的MTT需要無菌環(huán)境，MTT對微生物很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.配制MTT時用PBS（pH=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8 g Kcl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.24 g調pH為7.4,定容1.0 L。三、普通MTT法實驗步驟：1：接種細胞。用含10胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 uL。2：培養(yǎng)細胞。同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗目的和要求決定培養(yǎng)時間）。3：呈色。培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（

5、5 mg/mL用PBS配制，pH=7.4) 20 uL.繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心移除孔內培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加150 uL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解。4：比色。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。四、藥物MTT法實驗步驟：A：貼壁細胞：1：收集對數(shù)期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100 uL,鋪板使待測細胞調密度 1000-10000孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。2：5% CO2，37孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物，原

6、則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度,每孔100 uL,設3-5個復孔。建議設5個，否則難以反應真實情況。3：5% CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4：每孔加入20 uL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5：終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液。6：每孔加入150 uL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD=490 nm處測量各孔的吸光值。7：同時

7、設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。B：懸浮細胞：1：收集對數(shù)期細胞，調節(jié)細胞懸液濃度1106/ml，按次序將補足的1640（無血清）培養(yǎng)基40 uL；加Actinomycin D（有毒性）10 uL用培養(yǎng)液稀釋(儲存液100 mg/mL，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；需檢測物10uL；細胞懸液50uL（即5104cell/孔），共100 uL加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100 mL 1640培養(yǎng)基）。2：置37，5% CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3：每孔加入10 u

8、L MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD=570 nm（630 nm校準）測量各孔的吸光值）。4：離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 uL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD=570 nm（630 nm校準）測量各孔的吸光值。5：同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。五、注意事項：(1) 選擇適當?shù)眉毎臃N濃度。(2) 避免血清干擾。一般選小于10的胎牛血清的培養(yǎng)液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養(yǎng)液。(3) 設空白對照。與試驗平行不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。(4) MTT實驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系。(5) 用96孔板培養(yǎng)細胞做MTT測細胞活力,應該加多少1640培養(yǎng)基,多少MTT和DMSO合適根據(jù)書上說的加200 uL 1640培養(yǎng)基，20 uL MTT，150 uL DMSO加