常用的單克隆抗體檢測(cè)方法

1、常用得單克隆抗體檢測(cè)方法通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，在雜交瘤制備完成后，需要對(duì)抗體進(jìn)行一個(gè)檢測(cè),本文介紹了幾種常用得抗體檢測(cè)得方法（ 1)免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)就是將抗原抗體反應(yīng)得特異性與酶對(duì)底物顯色反應(yīng)得高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成得免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性強(qiáng) ,靈敏度高 ,現(xiàn)已廣泛用于篩選與鑒定單抗。器材與試劑 a、包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液：取0、2mol/LN 2CO3 8m ，0、2mol/ NaHCO3 17ml混合 ,再加75ml蒸餾水,調(diào) H至9、6。TrH l緩沖液(、0，0、02mo/L):取0、 mol/Li1 0ml,0 、1 ol/ H l 5 、4ml混合 ,加蒸餾水至1

2、 00ml 。、洗滌緩沖液(PH7 、 2得B): H2 O0、 2g， KCl 0 、， Na2H O4 2H2O 、 g,N C8、 g, ween20 0、 5 l，加蒸餾水至 100ml 。 c、稀釋液與封閉液：牛血清白蛋白 (BSA)0 、 ,加洗滌液至 100ml ；或用洗滌液將小牛血清配成 5 10%使用。 d、酶反應(yīng)終止液 (2mol/ H2SO):取蒸餾水1 8、3ml ，滴加濃硫酸 （ 98%）21、7ml 。e、底物緩沖液（ PH5、 0，磷酸鹽檸檬酸緩沖液） ：取 0、 2mol/L Na HPO 25、7ml,0 、1ml/L 檸檬酸 4、3m，再加 50ml 蒸餾水

3、檸檬酸溶液及配成得底物緩沖液不穩(wěn)定 , 易形成沉淀 ,因此一次不宜配制過(guò)多。 f 、底物使用液： OPD 底物使用液 ( 測(cè) 49nm 得 OD 值）: PD g,底物緩沖液10m ,3 2O2 0、1 ml 。 MBS 或 TMB 底物使用液 ( 測(cè)450nm 得 O值 )： TMBS 或 T (1mg l） 1、 0ml, 底物緩沖液 0 l,1%H2 2 25 l。 T底物使用液 （測(cè)1 nm 得 O值） : BT 0、5mg,底物緩沖液 ml ，3% H2 2 2ul。 g、抗體對(duì)照 :以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照,以免疫鼠血清作為陽(yáng)性血清 .h、抗原 : 可溶性抗原 :盡量純化,

4、以獲得高特異性。 病毒感染得傳代細(xì)胞或全菌抗原。 淋巴細(xì)胞等懸液。 、酶標(biāo)抗鼠抗體或酶標(biāo) SPA 或其她類似試劑。j、 細(xì)胞固定液 :-2丙酮 ;或丙酮甲醛固定液： N PO4 10mg,KH2P 4 500mg,蒸餾水 15 m，丙酮 225l ，甲醛 125ml ；或丙酮甲醛溶液 (1；1)；或 -20甲醇。 k、聚苯乙烯微孔板： 0 孔、 96 孔、或條孔；硬板或軟板均可使用、酶聯(lián)免疫閱讀儀 ;或光鏡 .m、吸管、加樣器及水浴箱、離心機(jī)等。 可溶性抗原得酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELI ）、純化抗原用包被液稀釋至1- 0ug/ml 。、以 50-100ul/ 孔量加入酶標(biāo)板孔中，置過(guò)夜或3吸附2

5、 小時(shí)。 c、棄去孔內(nèi)得液體，同時(shí)用洗滌液洗3 次,每次 -分鐘 ,拍干。 d、每孔加 200ul 封閉液 4過(guò)夜或 37封閉小時(shí)；該步驟對(duì)于一些抗原 ,可省略。 e、洗滌液洗 3次;此時(shí)包被板可 -2或 4保存?zhèn)溆谩?f 、每孔加 0-100ul 待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清,同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照與空白對(duì)照;3孵育 1 2 小時(shí);洗滌，拍干。 g、加酶標(biāo)第二抗體,每孔 50-1 0ul,3孵育 2 小時(shí)，洗滌 ,拍干。 h、加底物液，每孔加新鮮配制得底物使用液50 10 u， 37 10- 0 分鐘。、以2ol/L 2SO4 終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取O值 .、結(jié)果判定 :以 P/N2 、

6、1,或 PN+ D 為陽(yáng)性。 若陰性對(duì)照孔無(wú)色或接近無(wú)色 ,陽(yáng)性對(duì)照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結(jié)果。全菌抗原得 EL S a、新鮮培養(yǎng)得細(xì)菌用蒸餾水或 PB懸浮 ,并調(diào)整細(xì)菌濃度至 1 08 個(gè) /m。必須指出，對(duì)于人畜共患病病原體需注意安全操作,最好就是滅活處理。b、每孔中加 00 l %戊二醛溶液 (、 1mol/L NaHCO 5m 25戊二醛溶液 5m ), 7作用 2 小時(shí)，蒸餾水洗滌 3 次 ;加上述細(xì)菌懸液 0ul 孔；37-5烘干； 每孔加 2 0ul 封閉液 4過(guò)夜或 3 小時(shí)封閉 .c、步驟 b 也可采用先每孔加 5 u細(xì)菌懸液， 37 6烘干，然后用 2預(yù)冷得無(wú)水甲醇

7、室溫作用15 分鐘 ,蒸餾水洗滌次 ;每孔加 20 u封閉液 4過(guò)夜或 3 小時(shí)封閉。、洗滌液洗次 ;此時(shí)包被板可在 0或 4保存?zhèn)溆?.e、以下步驟同上法。用全細(xì)胞抗原得ELIS a、按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞 ,接種病毒，收獲感染細(xì)胞與未感染細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用 P S 制成適當(dāng)濃度懸液。、淋巴細(xì)胞懸液得制備采用新鮮外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴細(xì)胞分離液之上，1 00rpm 離心 3分鐘 ,吸取界面細(xì)胞洗滌二次， 即為新鮮淋巴細(xì)胞懸液 .該細(xì)胞懸液中若仍混有紅細(xì)胞， 離心后加 0、 3%得氯化銨溶液， 室溫 1分鐘 ,洗滌一次即可。 將該細(xì)胞懸液稀釋至適當(dāng)濃度。 c、每孔加 00ul 上述或

8、b 得細(xì)胞懸液，使每孔含細(xì)胞 5 104 個(gè) ;1500r/min 15 分鐘，甩去上清；室溫干燥或吹干后用丙酮甲醇（：1)固定 1分鐘 ;可或 2保存?zhèn)溆?。d、以下步驟同上法?？贵w捕捉 EL SA 試驗(yàn)本法用抗 ALB c 小鼠 Ig 得多克隆抗體捕捉待檢樣品中得 cAb ，再依次加抗原、酶標(biāo)多克隆抗體及底物顯色。該法就是常用得 ELI A 中較理想得一種；其操作步驟如下： a、以適當(dāng)濃度得純化抗鼠 Ig 抗體包被酶標(biāo)板 ,每孔加 100u， 3 2 小時(shí)或 4過(guò)夜。 b、洗滌、拍干后加待測(cè)得 cAb 樣品 , 7 1 2 小時(shí)。 c、洗滌后加適量得抗原 ,37 小時(shí)。 d、洗滌后加入酶標(biāo)多

9、克隆抗體 ,371-2 小時(shí)。洗滌后加底物顯色，判定結(jié)果。ABC-E I 試驗(yàn) A ELI A 就是在常規(guī)ELIS 原理得基礎(chǔ)上,增加了生物素 (Biotin) 與親與素（ Avdin) 間得放大作用。親與素有個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素有高度得親合力。生物素很易與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。因此，結(jié)合了酶得親與素與結(jié)合有抗體得生物素發(fā)生反應(yīng)即起到了多極放大作用。其操作步驟如下:a、已知抗原得包被及加待檢Mc b樣品,同間接ELISA試驗(yàn)。b、加生物素化抗鼠抗體,每孔100ul ，371 小時(shí)；洗滌。c、加酶標(biāo)親與素，每孔10 l,3 30 分鐘洗滌 ;加底物顯色 ,判定結(jié)果。 Dot-EL A 試驗(yàn)免疫斑點(diǎn)試

10、驗(yàn)（ ot-ELISA) 就是以硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜為固相載體 ,進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)得免疫檢測(cè)手段。 該法采用不溶性底物 (如 AB, 或 4氯萘酚或 Ag 3 等）,其與相應(yīng)標(biāo)記物（ HRP、 AP、膠體金）作用形成不溶性產(chǎn)物 ,呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀著色,從而易于判定結(jié)果。 根據(jù)所用得標(biāo)記物不同， 可分為 HRP免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)、免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)與免疫金銀斑點(diǎn)法等。其操作步驟大致如下 :a、將抗原液 2-5u 點(diǎn)加于纖維素膜上 ,室溫 7干燥 .b、將纖維膜浸入封閉液中， 37 3分鐘。 c、用洗滌液洗 2 次 ,吸干后加待檢 McAb 樣品 ,7 1 小時(shí) ;用洗滌液振蕩洗滌三次 ,每次 5 分鐘，加

11、HRP 或 AP 或膠體金標(biāo)記得抗鼠抗體 , 7作用分鐘。 d、同法洗滌，吸干，用新配得相應(yīng)底物溶液顯色 ,然后水洗終止反應(yīng) ,觀察結(jié)果免疫組化染色法該法主要用于檢測(cè)針對(duì)細(xì)胞抗原成分得 Ab, 常用得方法就是間接免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)(IIP,indir c mmunoper xidase)及 APAAP 技術(shù)。其結(jié)果用光鏡或倒置顯微鏡檢查.(）免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)可用于多種抗原得雜交瘤抗體檢測(cè),如細(xì)胞性抗原 (包括細(xì)菌與動(dòng)物細(xì)胞）、感染細(xì)胞中得病毒抗原與膜抗原等。其操作簡(jiǎn)單、敏感性高 ,可直接觀察抗原定位等優(yōu)點(diǎn),在 cAb 得篩選與鑒定上具有重要得應(yīng)用價(jià)值。器材與試劑a、供檢測(cè)抗體用得抗原制

12、備固定細(xì)胞片或板，活細(xì)胞懸液。、PBS(、， 0、 m l/L)c 、待檢得 McAb 樣品。 d、冷丙酮 e、FITC( 異硫氰酸熒光素 )或 TRITC( 四甲基異硫氰酸羅丹明熒光素）標(biāo)記得抗鼠 g 抗體等 f 、熒光顯微鏡 ,磁力攪拌器，離心機(jī)，水浴箱等。間接免疫熒光法 a、固定細(xì)胞片得制備 :生長(zhǎng)在蓋片上得細(xì)胞 (接種或未接種病毒） ,可直接收獲蓋片 ,在中洗滌， 用丙酮固定 0 分鐘 ,空氣干燥 ,置密封容器于 -20保存?zhèn)溆?;單細(xì)胞懸液可在蓋片上制成涂片,固定方法同上。 細(xì)胞涂片得制備:將 10ul 細(xì)菌懸液 （ 1 8 個(gè) ml) 涂抹 7 1m蓋片上，自然干燥后， 用 0 丙

13、酮固定 0 15 分鐘 ,于- 0保存?zhèn)溆?。、蓋片在去離子水中濕潤(rùn)后置架上滴加 1 20ul 雜交瘤上清或其她待檢樣品 ;設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照 ;置 3水浴孵育、 5-小時(shí)。c、取出蓋片置P S 中用磁力攪拌器洗滌15 分鐘。 d、蓋片置架上，滴加工作濃度得抗鼠Ig 得熒光抗體10 20ul,37 孵育 0、 1 小時(shí)。 e、同法洗滌 15 分鐘 ;取出蓋片 ,用延緩熒光碎滅得封載劑 (如緩沖甘油， 9 份甘油加 1 份 PBS)封于干凈載玻片上。 f、光顯微鏡上觀察， 陽(yáng)性結(jié)果可見(jiàn)特異性熒光 (FI C 為黃綠色熒光， ITC 為桔紅色熒光 ) 。 g、細(xì)胞固定片得制備 ,也可改在培養(yǎng)板孔中進(jìn)

14、行，其余步驟同上 ,在觀察結(jié)果時(shí) ,將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)置于熒光顯微鏡下 ,判斷標(biāo)準(zhǔn)不變。細(xì)胞得膜熒光染色完整得活細(xì)胞得細(xì)胞膜 ,抗體不能透過(guò)。如果細(xì)胞在 4操作，則熒光染色僅限于細(xì)胞膜。必須注意死細(xì)胞常以非特異性方式吸附大量熒光抗體，因此試驗(yàn)過(guò)程中要保證細(xì)胞得高活力?；罴?xì)胞得膜熒光染色大致步驟如下:a、制備活性較好得細(xì)胞懸液,調(diào)節(jié)濃度至1 7個(gè) /ml. 、在小試管（5 50m)中加入10ul細(xì)胞懸液,再加入100ul待檢 M Ab 得樣品 ,混勻 ,4作用 30 9分鐘。 c、用洗滌液 (P 900ml ，小牛血清 0 l， 4%NaN3 0m )洗二次,每次加洗滌液 1-5m , 000/離心分

15、鐘 ,棄上清。加入 10 l 熒光抗體 ,4作用 0分鐘 .d、同法洗滌，將細(xì)胞重新懸于 2 3 ul 含 0%甘油與 1 -0ug 苯二胺 /ml 得溶液中；滴加于載玻片上,加蓋片封載。、立即在熒光顯微鏡上檢查。f 、細(xì)胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理鹽水固定,立即檢查 ,或至少在4可保存一周。(3）間接血凝試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn)又稱被動(dòng)血凝試驗(yàn)(PH ),就是目前應(yīng)用較廣得檢測(cè)方法之一.本試驗(yàn)就是以包被可溶性抗原得紅細(xì)胞作為指示系統(tǒng)，當(dāng)被檢抗體與包被在紅細(xì)胞上得抗原產(chǎn)生特異性反應(yīng)時(shí)，導(dǎo)致紅細(xì)胞呈凝集現(xiàn)象.可見(jiàn) ,該法具有靈敏、快速、容易操作與無(wú)需昂貴儀器等優(yōu)點(diǎn)，而且經(jīng)改用醛化紅細(xì)胞以后，克服原來(lái)

16、重復(fù)性差得缺點(diǎn)。器材與試劑、綿羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。 b、緩沖液 :PBS（ H7 、 2);醋酸緩沖液。 c、甲醛 ,丙酮醛 ,NaN ,抗凝劑等。d、血凝板 ,振蕩器等。 多糖抗原得間接血凝試驗(yàn) a、甲醛化綿羊紅細(xì)胞得制備 :無(wú)菌采集綿羊頸靜脈血 0ml ，用枸櫞酸鈉作抗凝劑 ;用倍于紅細(xì)胞壓積得 P 7、 PBS( a2O4 H O 3、 8g,KH2P 4 0、4 g，N Cl8、01g,蒸餾水 000ml ）充分洗滌 5 次 ,每次 50rmin 1分鐘 ,直至上清測(cè)定無(wú)蛋白質(zhì)（用飽與硫酸銨滴定上清，觀察有無(wú)白色沉淀 ),再以相同緩沖液配成 5%紅細(xì)胞懸液 ;將25%紅細(xì)胞懸

17、液與 0甲醛以、： 1 得比例混勻 , 7水浴作用 2 小時(shí)，每 15 分鐘振蕩一次，紅細(xì)胞顏色逐漸由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣?以 P 7、2 PBS 洗滌 4 次 ,每次 000mn 10 分鐘 ,再以同樣得P制成 2%紅細(xì)胞懸液；其后 ,重復(fù)醛化一次 ,方法同前 ;最后配成 20%醛化綿羊紅細(xì)胞懸液，加甲醛至0、 %防腐，保存?zhèn)溆?。b、脂多糖抗原致敏甲醛化綿羊紅細(xì)胞得制備 :取脂多糖 (L S),以、 2m/ PH8、 0 B 液，調(diào)整多糖濃度至 0 g/ l,然后100水浴處理 1 小時(shí) ;將冷卻至 7得熱處理 P與 6%醛化紅細(xì)胞等量混合,37攪拌作用45 分鐘；取出離心 000r m 1分鐘

18、 ,以 0、01 o PH7、2 PBS 洗滌次；配制成 4%致敏血球 ,分裝 ,保存于 4備用 ,或凍干保存。 c、cA 得篩選 :取待測(cè) cAb 樣品 25 l, 加入型微量血凝板孔中 ,同時(shí)設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照 ;再加入 0、 5-%致敏紅血球懸液 2 ul, 在振蕩器上混勻 3秒；置室溫或 37 0-60 分鐘觀察結(jié)果。 陰性對(duì)照孔應(yīng)呈緊縮得圓點(diǎn) .可溶性蛋白抗原得間接血凝試驗(yàn) a、紅細(xì)胞醛化 :采用雙醛法。采綿羊或人“O”型抗凝血，每次加 10 倍于紅細(xì)胞壓積得 BS 洗滌 4次 ,然后配成 8%紅細(xì)胞懸液；向此 8紅細(xì)胞懸液緩慢加入等量含有 3% 丙酮醛與 3%甲醛得 PBS，于室溫緩慢攪拌小時(shí)；其后洗滌 3 次 ,配成 20%雙醛化紅細(xì)胞懸液， 加、 NaN3 防腐， 4保存?zhèn)溆谩?、致敏紅細(xì)胞：取 20% 雙醛化紅細(xì)胞 0、1ml ，1 0r min 1 分鐘 ,棄上