高效液相色譜法對(duì)丹參中丹參酮ⅡA丹參酮Ⅰ和隱丹參酮的同時(shí)測定

1、高效液相色譜法對(duì)丹參中丹參酮A，丹參酮和隱丹參酮的同時(shí)測定外標(biāo)法定量分析【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)和高效液相色譜的原理。2掌握高效液相色譜梯度洗脫的分析方法。3掌握外標(biāo)定量分析法。【實(shí)驗(yàn)原理】丹參酮A、丹參酮和隱丹參酮是從唇形科鼠尾草屬植物丹參的根部提取的脂溶性二萜類物質(zhì)。其分子結(jié)構(gòu)、分子式、分子量如下： C18H12O3 294.33 C18H12O3 276.29 C19H20O3 296.36 丹參酮A 丹參酮 隱丹參酮本實(shí)驗(yàn)將采用高效液相色譜法對(duì)丹參中的三種脂溶性提取物（丹參酮A、丹參酮、隱丹參酮）進(jìn)行同時(shí)測定。高效液相色譜分析包括兩種洗脫方式：等度洗脫和梯度洗脫。梯度

2、洗脫又稱為梯度淋洗或程序洗提，即在分離過程中使兩種或者兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變他們之間的比例，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，達(dá)到提高分離效果，縮短分離時(shí)間的目的。梯度洗脫可以使一個(gè)復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異較大的組分，都能在各自適宜的分離條件（容量因子k適宜）下實(shí)現(xiàn)分離。色譜定量分析的依據(jù)是各分析組分的質(zhì)量或者濃度與檢測器的響應(yīng)信號(hào)(色譜圖上表現(xiàn)為峰面積A或峰高h(yuǎn))成正比，即m=fA(f稱為定量校正因子)。色譜法中常用的定量分析方法有歸一化法，內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法。外標(biāo)法是應(yīng)用待測組分的純物質(zhì)來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即配置不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（濃度）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取固定量標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分

3、析，從所得的色譜圖上測出響應(yīng)信號(hào)（峰高或峰面積），然后繪制峰高或峰面積對(duì)含量(質(zhì)量或濃度)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 本實(shí)驗(yàn)采用反相化學(xué)鍵合相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合相為固定相，0.1%磷酸溶液-甲醇為流動(dòng)相分離丹參中脂溶性提取物，并通過外標(biāo)法對(duì)三種待測物質(zhì)進(jìn)行定量分析。當(dāng)組分在固定相和流動(dòng)相間進(jìn)行分配時(shí)，極性大的物質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解度較大，而極性小的物質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解度較小，組分的流出順序是極性大的化合物在前，極性小的化合物在后，最終實(shí)現(xiàn)各物質(zhì)的分離。 【實(shí)驗(yàn)用品】1儀器日本島津LC-20A高效液相色譜儀（配備SPD-20A紫外檢測器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-20AB輸液泵、CTO-10AS柱

4、溫箱、脫氣機(jī)）、色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm4.6 mm，5 m）、電子天平、超聲波清洗儀、溶劑過濾器、微孔濾膜（0.45m，無機(jī)相和有機(jī)相）、50 ml具塞三角瓶、25.00 mL移液管、定量濾紙、漏斗、漏斗架、一次性針筒過濾器（脂溶性）、微量注射器。2試劑 丹參酮A標(biāo)準(zhǔn)品，丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品，隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇（色譜純），乙醇（分析純），磷酸（分析純），超純水，丹參粉末?！緦?shí)驗(yàn)條件】1色譜柱：C18柱（150mm4.6mm，5 m）2流動(dòng)相：泵A： 0.1% 磷酸水溶液；泵B：甲醇 泵B濃度：040 min，70%75%；4045 min，75% 流速：0.8mL/min

5、3紫外檢測器：測定波長254 nm4柱溫箱：305進(jìn)樣量：10L【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】1丹參酮A，丹參酮和隱丹參酮混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制2丹參粉末中丹參酮A，丹參酮和隱丹參酮的提取 精密稱取0.2g（精確至0.1mg）干燥樣品粉末，置于具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入25.00mL 80%乙醇，稱重，超聲提取25min，補(bǔ)重，搖勻過濾，得到待測液。3流動(dòng)相的制備4實(shí)時(shí)分析（1）將流動(dòng)相至于超聲波清洗器上脫氣40min。（2）根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，將儀器調(diào)節(jié)至進(jìn)樣狀態(tài)，色譜工作站基線呈平直，即可進(jìn)樣（3）使用一次性針筒過濾器分別將對(duì)照品和待測液過濾到進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣對(duì)照品和樣品并記錄數(shù)據(jù)。（4） 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，按要求沖洗分析柱，關(guān)好儀器?！緮?shù)據(jù)記錄】tR/minA/mV含量/g丹參酮A標(biāo)準(zhǔn)品丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品樣品中丹參酮A樣品中丹參酮樣品中隱丹參酮 【數(shù)據(jù)處理】2511樣品中丹參酮A(丹參酮/隱丹參酮)的含量(g/g)=10m1000m(g)： 稱取干燥丹參粉末的質(zhì)量；1 (g)：10l進(jìn)樣量中各待測組分的含量；2計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD【思考題】1用外標(biāo)