免疫共沉淀-研究生實(shí)驗(yàn)課.ppt

1、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）,背 景,據(jù)估計(jì)，人體中大約總共可產(chǎn)生500,000種蛋白，而單個(gè)細(xì)胞可以產(chǎn)生 10,000 種。 在這些蛋白中，80%不是以獨(dú)立的方式存在的，而是存在于一個(gè)蛋白復(fù)合體中。 蛋白-蛋白的相互作用包含在一個(gè)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中，我們形象地稱之為通過(guò)節(jié)點(diǎn)（nodes）連接的樞紐（hubs）。,蛋白的相互作用,Standard Techniques Glutathione-S-Transferase Fusion Proteins Affinity Tags Tandem Affinity Purification (TAP) Tags Strep-T

2、ag III Quantitative Proteomics Chemical Crosslinking Two-hybrid Yeast Phage-display Universal Verification of Interaction Techniques Co-Immunoprecipitation Confocal Microscopy Biophysical Verification of Interaction Techniques Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) GFP-Protein Proximity Imagi

3、ng Microscopy (GFP-PRIM) Mass Spectroscopy (MS) Atomic Force Microscopy (AFM) Surface Plasmon Resonance (SPR),實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握免疫共沉淀的原理及操作方法，了解免疫共沉淀結(jié)果分析。 了解與免疫共沉淀相關(guān)的實(shí)驗(yàn)及進(jìn)展,免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 金標(biāo)準(zhǔn) 用途：測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。,概念及用途,當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，

4、完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì) x 的抗體免疫沉淀 x，那么與 x 在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì) y 也能沉淀下來(lái)。,實(shí)驗(yàn)原理,人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于直徑為6cm的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)大約90%以上融合后，倒掉培養(yǎng)液，PBS洗3次； 加入1ml Lysis Buffer（20mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1%TritonX-100, 1mM -Glycerolphosphate, 1mM Na3VO4, Cocktail proteinase，pH 7.5），冰上放置30min，裂解細(xì)胞；,實(shí)驗(yàn)步驟,采用溫和的裂解條件

5、，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件不一樣，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑（0.2SDS)。 為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 Na3VO4作用為保護(hù)磷酸化的蛋白不會(huì)被磷酸酶還原。因此在做磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)需添加。,將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管中，4轉(zhuǎn)鼓搖15min ，14000g 4離心15min ； 吸取上清液到新EP管中，每管加1g 對(duì)照兔IgG，同時(shí)加入Protein A agarose，4轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)30min，4 10000g 離心5min； preclear及其作用

6、 一抗和相應(yīng)來(lái)源的normal mouse, rat, rabbit or goat IgG中有相同或相似的成分(如無(wú)關(guān)IgG) , 用一抗相應(yīng)來(lái)源的IgG與蛋白裂解液和protein Aagarose可以去除一抗中無(wú)關(guān)IgG對(duì)蛋白裂解液中物質(zhì)的非特異吸附, 二是可以去除蛋白液中與protein Aagarose非特異結(jié)合的物質(zhì)。做 preclear 的IgG 是不針對(duì)特異性抗原的。 瓊脂糖珠的選擇 SEPHAROSE是注冊(cè)商品名, 本身是agarose做的凝膠。,轉(zhuǎn)移上清液至一新管中，將每管總蛋白定量至500-2000 (250-1000) g，用lysis Buffer將體積補(bǔ)齊至600-

7、800 l。加入AKT兔抗人多克隆抗體10 l，4 轉(zhuǎn)鼓過(guò)夜(10min)； 孵育液體積的控制：考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖液太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。 加入35 l Protein A agarose，4轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)2h (10min) ； 1000g 4 離心5min，PBS洗3次，加入40l 2SDS Sample Buffer（125mM TrisCl pH6.8, 4%SDS, 20%Glycerol, 100mM DTT, 0.02%溴酚藍(lán)）沸水浴中煮沸5min； Western Blot檢測(cè)樣品，剩余樣品-

8、20保存。,抗體的選擇： 1. 使用明確的抗體：實(shí)驗(yàn)最需要注意的就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免疫細(xì)胞化學(xué)染色能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。仔細(xì)檢查抗體的說(shuō)明書(shū)。特別是多抗的特異性是問(wèn)題，確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生； 2.使用對(duì)照抗體： 單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗 兔多克隆抗體：正常兔IgG 3. 抗體用量的控制：1-4g（通常用2 g ） 4. 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。,優(yōu) 點(diǎn),相互作用的蛋白都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然

9、狀態(tài)； 蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響； 可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。,缺 點(diǎn),可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； 如用western blot檢驗(yàn)，必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果（但如果結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)就可以分析所有的結(jié)合蛋白的種類）。,通過(guò)質(zhì)譜確定捕獲的蛋白,結(jié)果分析,鹽離子濃度影響coIP結(jié)果很多蛋白復(fù)合體對(duì)鹽濃度敏感，但敏感性有強(qiáng)弱之別。通常來(lái)說(shuō)，真實(shí)存在著的蛋白復(fù)合體能耐受生理鹽（0.15M）或更高濃度，即在生理鹽濃

10、度下不會(huì)解體。具體如，某種CDK和Cyclin其牢固程度能耐受0.8-1.0M以上的高鹽而不解體。因此，了解一個(gè)蛋白復(fù)合體對(duì)鹽濃度的耐受，既是一個(gè)幫助判斷蛋白復(fù)合體是否真實(shí)存在的一個(gè)重要依據(jù)，更是一個(gè)非常重要的生化數(shù)據(jù)；對(duì)某些體外生化反應(yīng)的蛋白原料的純化制備也是很重要的輔助依據(jù)。在生理鹽或更低鹽濃度下進(jìn)行coIP可能增加假陽(yáng)性幾率很多蛋白間非特異性的黏粘被記錄下來(lái)。通常選擇0.15-0.3M做細(xì)胞裂解。純化蛋白通常選取0.6M以上進(jìn)行IP。,2. 過(guò)表達(dá)血清中豐富的BSA可以被任意抗體識(shí)別（其實(shí)也是一種相互作用），同理高豐度的兩種或多種蛋白人為拼湊到一起，也可以非特異性的黏粘或者發(fā)生弱的相互作

11、用。 3. 不添加NP40一類表面活性劑，削弱對(duì)非特異性結(jié)合的拮抗NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效拮抗非特異性的蛋白相互作用，提高coIP的特異性。 通常IP體系中NP40含量0.2-0.5%。 NP40在0.5-1.0%時(shí)，染色體很容易析出，造成樣品過(guò)粘而需要超聲。,4. 超聲和凍融的影響 很多市售或自制的裂解液過(guò)于溫和，需要考慮采用機(jī)械或者超聲等手段提高裂解效率（超聲要慎用，可能破壞弱的相互作用）。 但是，有些時(shí)候裂解液的凍融又可能影響某些弱的相互作用，所以不太建議凍融裂解液即最好裂解液制備好后立即進(jìn)行coIP。如果證實(shí)凍融無(wú)影響可考慮將蛋白樣品保存-80度待用。 5. Tag的影響

12、 His-tagged主要用于純化蛋白。用His-tagged蛋白進(jìn)行coIP存在潛在的隱患。因?yàn)楹芏嗟鞍讜?huì)有富含histidine的domain，遇到效價(jià)非常好的抗體會(huì)使很多內(nèi)源性的蛋白都被該抗體識(shí)別。造成coIP的假象。,TAP tag不能用于分析鈣調(diào)信號(hào)通路。TAP tag實(shí)際上從成本角度和His tag差不多，洗脫試劑價(jià)格低廉，因此可用于質(zhì)譜分析，能獲取最全面的相互作用的信息。然而由于其中包含鈣調(diào)蛋白和蛋白A的相互作用domain，天然會(huì)結(jié)合鈣信號(hào)相關(guān)蛋白，從而干擾或掩蓋靶蛋白與鈣信號(hào)蛋白之間的相互作用，有一定的應(yīng)用局限。 Myc、HA、Flag-tagged：Myc仍然會(huì)有天然的干擾

13、，應(yīng)用略有局限；相較后兩者是人工合成專門(mén)用于tagged蛋白（有相應(yīng)的專利，因此目前無(wú)論抗體或交聯(lián)好的beads價(jià)格都非常昂貴），因此干擾最小、最常用。如需進(jìn)一步細(xì)致區(qū)分，a-Flag效價(jià)比a-HA略高，因此更適合IP。,tag的位置。將tag構(gòu)建到蛋白的N端還是C端，也是一個(gè)潛在的能夠影響coIP結(jié)果的因素。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信號(hào)肽，如果將tag構(gòu)建到N端，則外分泌時(shí)會(huì)被信號(hào)肽酶連同信號(hào)肽一起切除；所以這時(shí)必須構(gòu)建在C端。再如，多數(shù)蛋白的C端是疏水區(qū)，有的時(shí)候?qū)ag構(gòu)建在C端會(huì)影響蛋白原來(lái)的空間結(jié)構(gòu)，如恰好C端同時(shí)是相互作用的結(jié)構(gòu)域，某些時(shí)候還可能被遮蔽，從而干擾相互作用。因此

14、，通常構(gòu)建質(zhì)粒的時(shí)候是N端、C端tagged同時(shí)分別構(gòu)建，以備萬(wàn)一。,更高效的方法,使用Dynabeads蛋白A或G進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng) Dynabeads 磁珠 vs 瓊脂糖珠分離純化蛋白質(zhì),注重品質(zhì)和特異性，而非數(shù)量。 此時(shí)，磁珠是最佳的選擇。,常見(jiàn)問(wèn)題及解決策略,目的蛋白分子量比預(yù)期大？ 至少兩種可能性是存在的一個(gè)是在所謂“搖”的過(guò)程中，目的蛋白被修飾。正常的細(xì)胞中有很多departments，每個(gè)department都有特定蛋白的存在，比如線粒體蛋白、溶酶體蛋白、葉綠體蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合蛋白、核蛋白；一旦細(xì)胞被勻漿化，各個(gè)departments就不存在了，每個(gè)蛋白都會(huì)與其他所有蛋白有接觸的機(jī)

15、會(huì)，所以，發(fā)生一些unexpected修飾（或切割）是正常現(xiàn)象。再有一種可能是B蛋白只能結(jié)合被修飾的A蛋白，從而在免疫沉淀的過(guò)程中富集了這種被修飾的A蛋白。,2. 背景深條帶多，特異性差。 最簡(jiǎn)單的改進(jìn)方法：換特異性高的抗體，最好用單抗。如果不換抗體，還可以改進(jìn)共沉淀的條件，例如孵育的溫度，孵育的時(shí)間，抗體的濃度等等。另外，曝光的時(shí)候，時(shí)間不要太長(zhǎng)，可以降低背景。也可能是抗體濃度過(guò)高，可以降低抗體作用濃度。 3. 沒(méi)有檢測(cè)到與目的蛋白相互作用的蛋白或者檢測(cè)得到的信號(hào)太弱 裂解液中的去垢劑濃度過(guò)高或者配方過(guò)于劇烈：降低去垢劑濃度或者更換去垢劑種類（按作用劇烈程度來(lái)區(qū)分: SDS Trition

16、NP40 Digitonin CHAPS） 受蛋白的亞細(xì)胞定位影響：重新選擇裂解液配方以釋放目的蛋白 蛋白之間的相互作用太弱或者不太穩(wěn)定：選擇親和力更高的抗體以捕獲更多的目的蛋白從而捕獲更多的相互作用蛋白;過(guò)表達(dá)提高目的蛋白的含量；選擇目的蛋白或者相互作用蛋白含量高的樣品進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),相關(guān)技術(shù),體外免疫共沉淀（TnT試劑盒，promega） 免疫沉淀（immunoprecipitation） 利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來(lái)。,Pull down 利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將誘餌蛋白與標(biāo)簽結(jié)合，再固化在吸附介質(zhì)上，之后將抗原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來(lái)的方法。 除了常用的GST-pull down，還有生物素標(biāo)記蛋白-pull down，His-pull down等。,Glutathione-S-Transferase Fu