分子生物學(xué)-第三章-下轉(zhuǎn)錄后加工

1、第三章 (下) 轉(zhuǎn)錄后加工,轉(zhuǎn)錄后的加工（posttranscriptional modification） （1）減少部分片段：如切除5端前導(dǎo)序列， 3端拖尾序列和中部的內(nèi)含子； （2）增加部分片段：5加帽，3加poly(A), 歸巢和通過編輯加入一些堿基； （3）修飾：對某些堿基進(jìn)行甲基化等。,第一節(jié)tRNA和rRNA的加工,一. 原核的 tRNA和 rRNA的加工 參與蛋白質(zhì)合成的tRNA和rRNA都不是最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 (1) 它們的5端都是單磷酸，而原始的轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物5應(yīng)是三磷酸； (2) 分子比初始轉(zhuǎn)錄物小； (3) tRNA含有特殊的堿基，這些堿基只有通過一些化學(xué)修飾才可以得到。,表

2、13-1 E.coli中含有的小分子核酸酶 酶 基因 底物 功能 RNaseP rnpA tRNA 5端 內(nèi)切 RnaseO rnpB RnaseBN ? tRNA 3端 外切 RnaseD rnd tRNA 3端 外切 RnaseT ? tRNA 3CCA 外切 Rnase rnc rRNA和mRNA 內(nèi)切 RnaseR ? rRNA和mRNA 外切 RnaseE rne 5S rRNA 內(nèi)切 Rnase rna 大部分RNA 內(nèi)切 Rnase rnb RNA 外切 多核苷酸磷酸化酶 pnp RNA 外切 RnaseH rnh RNA-DNA雜合鏈 內(nèi)切 GENESIV，1990. B. L

3、ewin, Table 14.2,(一) tRNA的加工,tRNA的加工分成3個階段 (1) “斬頭”，形成5末端； (2) 去尾，形成3-OH末端。缺-CCA的 tRNA要用tRNA核酸轉(zhuǎn)移酶加-CCA。 (3)修飾：通過甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等進(jìn)行修飾，如氨基酸臂的4-硫尿苷（4tu），D臂的2甲基鳥苷（2mG），TC臂的假尿苷（）和反密碼子環(huán)上的2異戊腺苷（2ipA),Mature tRNA,真核tRNA內(nèi)含子的特點(diǎn)：,位置相同，都在反密碼子環(huán)的下游； 不同tRNA的內(nèi)含子長度和序列各異； 外顯子和內(nèi)含子交界處無保守序列； 內(nèi)含子的剪切是依靠RNase異體催化； 內(nèi)含子和反密

4、碼子配對形成莖環(huán)。,二 真核的tRNA和rRNA的加工,真核tRNA的基因和原核不同： (1)真核的前體分子tRNA是單順反子，但成 簇排列，基因間有間隔區(qū)； (2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多 得多，如酵母約有400個tRNA基因； (3) 5端單磷酸核苷酸，表明已被加工過； (4) tRNA的前體分子中含有內(nèi)含子。,真核tRNA內(nèi)含子切除的特點(diǎn)：,(1)沒有交界序列，也沒有內(nèi)部引導(dǎo)序列； (2)剪切反應(yīng)的信號是二級結(jié)構(gòu)，而不是 一 級結(jié)構(gòu)； (3)是依賴于蛋白質(zhì)性的RNase，而不是核 糖擬酶或snRNP； (4)反應(yīng)的本質(zhì)不是轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。,酵母tRNA前體內(nèi)含子3和5端的剪切

5、是由內(nèi)切酶的不同亞基催化的。亞基Sen34, Sen2剪切3端和5端.Sen54可能通過量度成熟結(jié)構(gòu)域的距離來決定5端剪切位點(diǎn)的位置。A1堿基對也是重要的。,古細(xì)菌tRNA用于剪切的核酸內(nèi)切酶在每個“突起螺旋突起”片段的突起處切割每條鏈,真核tRNA的加工和原核的區(qū)別,(1)真核tRNA前體中無二聚體和多聚體； (2)增加了剪接內(nèi)含子的過程； (3)都要加CCA。,真核細(xì)胞中rRNA的加工途徑,(1) 切除5端的前導(dǎo)序列； (2) 從41S的中間產(chǎn)物中先切下18S的片段。 Hela細(xì)胞的切點(diǎn)在18S和5.8S之間的ITS（內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列）； L細(xì)胞的切點(diǎn)在 18S序列和ITS的交界處，稱為先

6、成熟。 (3) 部分退火，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)； (4) 最后修正。,第二節(jié) 前體mRNA的加工,mRNA前體分子的加工主要是真核mRNA，原核的mRNA一般不經(jīng)過加工。 真核mRNA的加工一般要經(jīng)過四步： (1) 5加帽； (2) 3加尾； (3) 切除內(nèi)含子； (4) 修飾：對某些堿基進(jìn)行甲基化。,原核生物mRNA的加工,原核生物的mRNA很少經(jīng)過加工，但在少數(shù)情況下多順反mRNA先被內(nèi)切核酸酶切成較小的單位再成為翻譯的模板,二 真核mRNA前體的加工,(一)核內(nèi)不均一RNA（heterogenous nuclear RNA,hnRNA）平均分子長度為8-10Kb(2Kb14Kb)左右。比mRNA

7、的平均長 度（1.8-2Kb）要大4-5倍。 hnRNA僅有總量的1/2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其余的都在核內(nèi)被降解掉。 hnRNA是mRNA的前體，證據(jù)是： (1) hnRNA和mRNA有相同的序列； (2) hnRNA在體外能作為模板翻譯蛋白； (3) 兩者5端都有帽子結(jié)構(gòu)； (4)表明二者為相同的聚合酶所合成； (5) 兩者的3端都有多聚腺苷有尾巴。,hnRNA的結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),(1)5端有帽結(jié)構(gòu)； (2) 3端有poly（A）尾巴； (3)帽結(jié)構(gòu)后有3個寡聚U區(qū)，每個長約30nt； (4)有重復(fù)序列，位于寡聚U區(qū)后面； (5)有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可能分布于編碼區(qū)（非重復(fù)序列）的兩側(cè)； (6)非重復(fù)序列中有

8、內(nèi)含子區(qū)。,hnRNA的物理結(jié)構(gòu)是核糖核蛋白顆粒（hnRNP）,顆粒中蛋白質(zhì)包圍著hnRNA。體外研究表明hnRNA的形狀是一個球體和一個與之相連的纖維狀結(jié)構(gòu)。,在細(xì)胞核中，RNA加工包括3端和5端修飾以及內(nèi)含子的去除等。剪切需要在內(nèi)含子與外顯子交界處產(chǎn)生斷裂，然后將外顯子末端連接。成熟的mRNA通過核孔被運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在那里它完成翻譯。,1加帽,(1) 剪接前加帽 如呼腸病毒， 牛豆病毒 (2) 剪切后加帽 如皰疹病毒和口炎病毒,7甲基鳥苷三磷酸,帽子 的類型,在末端鳥苷的第7位上存在單個甲基化位點(diǎn)的稱0型帽子（cap0）； 在次末端核苷酸的核糖上的2-o位點(diǎn)上還有一個甲基位點(diǎn)的稱1型帽子(

9、cap 1)； 此外，在第三個核苷酸的核糖上（2-o）有甲基化位點(diǎn)的稱2型帽子（cap2）。 這三種帽子都有特殊面對面核苷酸結(jié)構(gòu)（confrontde nucleotide structure）。,帽子結(jié)構(gòu)的功能,(1)有助于mRNA越過核膜，進(jìn)入胞質(zhì)； (2)保護(hù)5不被酶降解； (3)翻譯時供IF（起始因子）和核糖體識別。,(2) 加尾,(1) CPSF特殊組分 cleavage and polyadenylationspecificity factor剪切和多聚腺苷酸化特異因子 識別AAUAAA并指導(dǎo)其它的活性 (2) CF (剪切因子)在加尾位點(diǎn) AAUAAA下游1130nt 處剪切RN

10、A； (3)PAP 末端腺苷轉(zhuǎn)移酶poly(A)聚合酶合成 poly(A)尾巴； (4)PBP（poly(A)結(jié)合蛋白 與poly(A)結(jié)合，反應(yīng)停止。,加Poly(A)的反應(yīng),第一步加一個短的寡聚A序列（10nt），此反應(yīng)依賴于AAUAAA序列； 反應(yīng)由poly（A）聚合酶在特殊因子指導(dǎo)下完成的。 第二步是寡聚A尾巴延伸到240nt的長度。 此反應(yīng)并不需要AAUAAA序列，但需要一個識別寡聚A并指導(dǎo)poly（A）聚合酶延伸的刺激因子。,加工的要素是：(1)熱敏因子，功能不祥；(2)剪切位點(diǎn)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（和序列無關(guān)，與二級結(jié)構(gòu)有關(guān)）；(3)U7snRNA,長56nt,其5端有一保守序列和H3mR

11、NA剪切點(diǎn)下游的GAAAGA互補(bǔ)。,有些mRNA的3端無poly(A)尾，如在爪蟾卵母細(xì)胞中組蛋白H3的mRNA.成熟時要切除一段3端序列。,第三 節(jié) 內(nèi)含子的剪接,一. 核酶(Ribozyme) 1981年T.Cech和S.Atman等在研究四膜蟲rRNA時發(fā)現(xiàn)的； T.Cech由核糖核酸（ribonucleic acid）和酶（enzyme）這兩個詞“重組”成一個新的詞： “ Ribozyme”； 是指本質(zhì)為RNA或以RNA為主含有蛋白質(zhì)輔基的一類具有催化功能的物質(zhì)。,核酶和傳統(tǒng)酶的區(qū)別：,(1)一般的酶是純的蛋白質(zhì)，而核酶是RNA或帶有蛋白的RNA； (2)核酶既是催化劑又是底物。而酶僅

12、催化反應(yīng)。,核酶發(fā)現(xiàn)的意義,（1）突破了酶的概念. 是一種自體催化； （2）揭示了內(nèi)含子自我剪接的奧秘；促進(jìn)了RNA的研究。 （3）為生命的起源和分子進(jìn)化提供了新的依據(jù)。,遺傳信息的進(jìn)化路線可能是：,RNA （DNA 表達(dá)） (DNA DNA) (DNA表達(dá)) RNA RNA 表達(dá) | | RNA病毒 反轉(zhuǎn)錄病毒 EB, HBV DNA病毒,酶組成的進(jìn)化路線可能是：,純RNA RNA為主 RNA和 蛋白為主 純蛋白 蛋白為輔 蛋白并重 RNA為輔 核酶 RNAaseP ？ 端粒酶 一般酶類,生物體組成的進(jìn)化：,蛋白（朊病毒） RNA RNA+蛋白 RNADNA+蛋白 DNA+蛋白 類病毒 RN

13、A病毒 巨細(xì)胞病毒(HCMV) DNA病毒,內(nèi)含子剪切相關(guān)的酶,內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn),1977 美Sharp & Roberts 同時發(fā)現(xiàn)了斷裂基因(split gene) 法 Chambon 失機(jī) 雞的輸卵管分泌卵清蛋白、卵粘蛋白和 伴清蛋白，而其紅細(xì)胞（鳥類的紅細(xì)胞 上有核的）只合成血紅蛋白，那么兩種 組織之間DNA有什么不同呢？ southern雜交 Berget，Sharp小組和Roberts小組用R環(huán)法,DNA和mRNA之間形成特殊的RNA-DNA異源雙鏈分子結(jié)構(gòu),斷裂基因 Split Genes,二. 內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),(一) 內(nèi)含子和外顯子的分布 (二) 內(nèi)含子的相對性,經(jīng)過刪除和連接，

14、除去無關(guān)的DNA間序（即內(nèi)含子），便形成了成熟的mRNA分子,斷裂基因 Split Genes,有的內(nèi)含子可編碼內(nèi)切酶。,三. 內(nèi)含子的生物學(xué)意義,有的內(nèi)含子可編碼內(nèi)切酶。 成熟酶 (maturase) 歸巢 (Homing) 調(diào)控 提高進(jìn)化速率,Homing 歸巢,在某些內(nèi)含子中含有開放續(xù)框，可產(chǎn)生具有三種功能的蛋白。這些蛋白可使內(nèi)含子（或以其原來的DNA形式，或作為RNA的DNA拷貝）移動，使內(nèi)含子可插到一個新的靶位點(diǎn)，這個現(xiàn)象叫做歸巢。,Crick（1978年）提出了一系列問題,（1）剪切若是通過酶，那么這種酶是怎 樣識 別RNA上特定的位點(diǎn)？ （2）剪切酶有沒有特異性？ （3）切除的R

15、NA是以線狀還是環(huán)狀存在 的？切下的RNA的命運(yùn)將如何？ （4）內(nèi)含子有無調(diào)控作用？,（二）邊界序列,Chambon等發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子切割位點(diǎn)有2個特點(diǎn),（1）內(nèi)含子的兩個末端并不存在同源或互補(bǔ)。 這就排除了存在二級結(jié)構(gòu)的可能。 （2）連接點(diǎn)具有很短的保守序列，稱為邊界 順序。其規(guī)律稱為GT-AG法則（GT-AG rule) 或Chambon法則。 左邊的剪接位點(diǎn)稱供體（donor）位點(diǎn)， 右邊的剪接位點(diǎn)稱受體（acceptor）位點(diǎn)。,交界順序,三 I類內(nèi)含子的剪接,Cech等1981年用四膜蟲分離得到了35S的前體rRNA，它含有一個長413bp的內(nèi)含子。 此35S rRNA要加入一價或二價陽離

16、子及GTP就可以在體外釋放出413b的線性的內(nèi)含子， 若繼續(xù)保溫，那么線形內(nèi)含子又可形成環(huán)狀的RNA。這就意味著35S RNA在GTP的作用下可以自我剪接。,In 1983,Cech& Altman, established the existence of catalytic RNAs,Thomas R. CechUniversity of Colorado USA,1947 -,Sidney AltmanYale University,USA 1939 -,The Nobel Prize in Chemistry 1989 for their discovery of catalytic

17、properties of RNA,重組DNA轉(zhuǎn)化E. coli,(一)I類內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是,1. 其邊界序列為5U-G 3； 2. 具有中部核心結(jié)構(gòu)（Central core strucature） 3.內(nèi)部引導(dǎo)順序（internal guide seguence IGS）,(二) I類內(nèi)含子的剪切機(jī)制,轉(zhuǎn)酯反應(yīng)(transesterification) 酯鍵從一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置。,四. 類內(nèi)含子的剪接,(一)結(jié)構(gòu)特點(diǎn) (1) 邊界序列為5GUGCGYnAG； (2) 有6個莖環(huán)結(jié)構(gòu)； 有分支點(diǎn)順序（branch-point seguence）,(二)剪接機(jī)制,無需鳥苷的輔助，但需鎂

18、離子的存在。 分枝點(diǎn)A的2-OH對5端交界處的磷酸二酯鍵發(fā)動親核進(jìn)攻，產(chǎn)生了套索（lariat）結(jié)構(gòu)（圖13-31）； 切下的外顯子1其3-OH繼續(xù)對內(nèi)含子3端的交界序列進(jìn)行親核進(jìn)攻，同時釋放出套索狀的內(nèi)含子。,五. 核mRNA的剪接,(一) 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 1. 邊界順序:符合GU-AG法則。 2. 分枝點(diǎn)順序：為Py80NPy87Pu75APy95其中A為百分之百的保守，且具有2-OH。 3.內(nèi)含子5端有一保守序列可以和U1 snRNA的5端的保守順序互補(bǔ),(二)剪接機(jī)制,剪接因子 snRNPs U1,U2,U5和 U4/U6。,剪接與mRNA出核相關(guān)聯(lián) 在完成合成和加工后，mRNA以核蛋白復(fù)合體的形式從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。問題是這些蛋白如何識別mRNA?如何確保僅加過工的mRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)？部分答案是：剪接體可能形成于轉(zhuǎn)錄完成之前以去除內(nèi)含子，但剪接和出核前應(yīng)具有直接連系。 一個9個蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體通過剪接體同RNA結(jié)合，稱為外顯子連接復(fù)合體（exonjunction complex, EJC）,EJC包含一組稱為REF家族的蛋白質(zhì)（了解得最清楚的成員是Aly）。REF蛋白依次和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（稱為TAP