第十章 核酸分子雜交技術(shù).ppt

1、第十章 核酸分子雜交技術(shù)第一節(jié) 核酸分子雜交的基本原理,具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下 按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。 雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列稱探針。 雜交有固一液相雜交和液相雜交。,一、DNA變性與復(fù)性,（一）DNA變性 1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性,2、變性的方法： （1）熱變性：溫度升高到90100時，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 （2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核 酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。 （3）化學試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。,3、變

2、性后的理化性質(zhì)變化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加,4、DNA變性曲線 AT區(qū)先解鏈 GC區(qū)后解鏈 階梯式曲線,5、GC含量與Tm值之間的關(guān)系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3,（二）復(fù)性 1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。 具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。,2、復(fù)性過程 （1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈 （2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離 （3）局部雙鏈周圍的堿基如配

3、對，則形成中心序列 （4）形成完整的雙鏈分子,3、復(fù)性的速率方程（服從二級反應(yīng)動力學）,（1）,將（1）積分,（2）,一半單鏈DNA分子復(fù)性時，（2）式中的 為,Cot1/2值越大，復(fù)性速度越慢,（3）,二、影響雜交的因素 1、核酸分子的濃度和長度： 濃度越大，復(fù)性速度越快 分子越大，復(fù)性速度越慢 單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加 雙鏈探針，濃度控制在0.10.5g,濃度過高影響雜 交效率,2、溫度： （1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低2025 （2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5,3、離子強度： （1）低鹽濃

4、度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加 （2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當進行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度,4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當待測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在3542 雜交 （2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在68雜交,5、核酸分子的復(fù)雜性： （1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度 （2）Cot與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成正比 （3）兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于DNA的相對復(fù)

5、雜性,6、非特異性雜交反應(yīng)： （1）雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異性吸附 （2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉,第二節(jié) 核酸分子雜交的方法 按待測核酸是否固定在固相支持物上分： 固-液相雜交 膜上印跡雜交 原位雜交 液相雜交 RNA酶保護分析法 核酸酶S1保護分析法,一、Southern印跡雜交 （一）待測核酸樣品的制備 1、裂解或破碎細胞 2、抽取純化基因組DNA 3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段,（二）待測DNA樣品的電泳分離 1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃

6、度膠 2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動慢,小分子DNA泳動快， 大小 相同的分子處于同一條帶 3、分子量標準：經(jīng)Hind消化的DNA，雜交 所用分子量標準可用核素標記,（三）凝膠中核酸的變性（堿變化） 凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的 單鏈 DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液,（四）Southern印跡 指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固 相支持物上的過程,1、固相支持物的選擇 （1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性 具有較強結(jié)合核酸分子的能力 不影響與探針的雜交反應(yīng) 與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 具有良好的機械性能 非特異吸附少,（2）常用的固相支持物 硝酸纖維

7、素膜：優(yōu)點是吸附能力強，雜交信號本 底低。缺點是DNA分子結(jié)合不牢固 尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸 纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高 化學活化膜：優(yōu)點：DNA與膜共價結(jié)合；對不同 大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點：結(jié)合能 力較上述兩種膜低,2、Southern印跡的常用方法 （1）毛細管虹吸印跡法,利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運動，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯

8、留在膜上,（2）電轉(zhuǎn)法,利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。,（3）真空轉(zhuǎn)移法,此法原理與毛細管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。,（五）Southern雜交 1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點 預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液 2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA雜交 雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交 3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA,（六）雜交結(jié)果檢測 1、放射自顯影：適用于放

9、射性核素標記的探針 2、比色或化學發(fā)光檢測：適于非核素標記的探針,（七）Southern雜交在醫(yī)學中的應(yīng)用 1、酶切圖譜分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突變分析 4、限制性片段長度多態(tài)性的分析,二、Northern印跡雜交 1、基本原理和基本過程與Southern blot基本相同 2、鑒別RNA 3、探針可用DNA或RNA片段 4、待測樣品為總RNA或mRNA,Northern印跡與Southern 印跡的不同點 1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保 持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳 中不變性 2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern 印跡時，DN

10、A轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理 3、靶核酸為RNA,三、斑點及狹縫印跡雜交 1、斑點印跡為圓形 2、狹縫印跡為線狀 3、鑒別DNA、RNA 4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品 5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量,四、原位雜交 1、定義：將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 雜交,保持組織細胞的形態(tài) 對核酸無抽提，修飾與降解作用 不改變核酸在組織細胞內(nèi)的定位 不阻礙核酸與探針的雜交過程 對雜交信號無遮蔽作用 理化性質(zhì)穩(wěn)定,2、雜交過程： （1）組織或

11、細胞的固定 理想固定液應(yīng)具備：,（2）組織細胞雜交前的預(yù)處理,去垢劑（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白質(zhì) 組織細胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體 控制消化時間，避免細胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻 片上脫落,（3）探針的選擇與標記,以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針 探針的長度一般為50300bp ,有時達1.5kb 放射性核素標記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定 檢測結(jié)果分辨率高，但信號檢測時間長 非核素標記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易 于觀察,（4）雜交,雜交液體積?。?020l cDNA和RNA探針雜交溫度約為50 雜交時間:DNA探針雜交為24h.RNA探針雜

12、交過夜 雜交前一般將組織切片置95 515分鐘使DNA變性 沖洗溫度一般 不超過50 ,（5）雜交結(jié)果檢測,所用探針為核素標記,放射自顯影檢測 所用探針為非核素標記,比色或化學發(fā)光檢測,五、液相雜交 指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子的過程。,（一）RNA酶保護分析法,1、RNA酶保護分析法原理 RNaseA和RNaseT1專一水解雜交體系中的單鏈RNA，不水解探針RNA與待測RNA互補形成的雙鏈RNA，使雜交分子得到保護，稱RNA酶保護分析法。,2、雜交過程,制備待測RNA RNA探針的制備與標記：體外轉(zhuǎn)錄法制備和標 記RNA探針 雜交：待測RN

13、A與RNA探針在液相中雜交 RNaseA和RNaseTI除去單鏈RNA 電泳分離RNA 放射自顯性檢測雜交結(jié)果,（二）核酸酶S1保護分析法 1、原理 核酸酶S1在一定條件下專一水解雜交體系中的單鏈DNA和單鏈RNA，不水解DNA探針與待測RNA雜交形成的雜交體，使雜交分子得到保護，稱核酸酶S1保護分析法,2、雜交過程,制備待測RNA：總RNA或mRNA均可 單鏈DNA探針的制備與標記 雜交：單鏈DNA探針與待測RNA在液相中雜交 核酸酶S1除去單鏈DNA和單鏈RNA 電泳分離DNA/RNA雜交體分子 放射自顯影檢測雜交結(jié)果,第三節(jié) 探針的標記,一、探針的種類,基因組DNA探針 cDNA探針 R

14、NA探針 寡核苷酸探針,二、標記物 （一）理想標記物應(yīng)具備的特性：,高度靈敏性 不影響堿基配對的特異性 不影響探針分子的主要理化性質(zhì) 對酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大 檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性,(二) 標記物種類,核素標記物：32p、35s、3H 非核素標記物 半抗原：生物素、地高率 配體：生物素是親和素的配體 熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等 化學發(fā)光探針：標記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光， 如生物素?；膲A性磷酸酶 可使發(fā)光底物發(fā)光,三、標記方法 體內(nèi)標記法：將核素標記的化合物作為合成代謝的底物，在細胞合成代謝時使 核素摻入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可摻入到DNA中， 3H-尿苷可

15、摻入到RNA中,體外標記法： 化學標記法：標記物分子上的活性基因與 探針分子上的某些基因反應(yīng)， 標記物直接結(jié)合到探針分子上 酶促標記法：標記物預(yù)先標記核苷酸，然 后利用酶促法將標記的核苷酸 摻入到探針上,酶促標記法 （一）切口平移法（nick translation),1、利用DNase I在DNA雙鏈上造成單鏈切口 2、利用大腸桿菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除 3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互補的DNA單鏈為模板依次將dNTP連接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA鏈，同時將標記的核苷酸摻入到新的DNA鏈中,（二）隨機引物法,其原理是隨機引物能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA鏈，其核苷酸序列與模板DNA完全互補。另一單鏈DNA模板同樣合成一條新的完全互補的DNA鏈。合成時，帶放射性核素標記的核苷酸摻入到新合成的DNA分子中,隨機引物法所具有的優(yōu)點： 1、能進行雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA探針的標記 2、操作簡單方便，避免因DNaseI處理濃度掌握不當所帶來的一系列問題 3、標記活性高，標記活性可達108cpm/gDNA以上 4、可直接在低熔點瓊脂糖溶液中進行標記,（三