《疫學(xué)應(yīng)用》課件.ppt

1、,第十五章 免疫學(xué)應(yīng)用,教學(xué)目的： 掌握：基于抗原抗體反應(yīng)的檢測方法；免疫細(xì)胞的檢測方法 ；人工（自然）主動免疫、人工（自然）被動免疫的概念。 理解：基于抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素；免疫分子的檢測原理；免疫細(xì)胞的檢測方法與原理；以抗體、細(xì)胞和細(xì)胞因子為基礎(chǔ)的免疫治療 了解：免疫分子的檢測原理；免疫學(xué)診斷的原理、常用的免疫功能檢測指標(biāo)；免疫治療制劑的類型和作用機(jī)制,教學(xué)重點(diǎn)： 基于抗原抗體反應(yīng)的檢測方法及原理；人工（自然）主動免疫、人工（自然）被動免疫的概念。 教學(xué)難點(diǎn)： 抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素。,使用教材： 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)（第二版），龔非力主編，科學(xué)出版社，2007年。 參考教材： 醫(yī)

2、學(xué)免疫學(xué)（第五版），金伯泉主編， 人民衛(wèi)生出版社，2008年；/,主要內(nèi)容,第一節(jié)基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測方法 第二節(jié)免疫細(xì)胞的檢測 第三節(jié)免疫分子的檢測 第四節(jié) 免疫學(xué)預(yù)防,第一節(jié)基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測方法,抗原-抗體反應(yīng)：指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生高度特異性結(jié)合反應(yīng)。由于實(shí)驗(yàn)所用的抗體存在于血清中，故又稱血清學(xué)反應(yīng)（serological reaction) 應(yīng)用： 用已知抗原檢測未知抗體； 用已知抗體檢測未知抗原： 定性或定量檢測體內(nèi)各種分子； 用已知抗體檢測半抗原物質(zhì)。,（一）特異性和交叉反應(yīng) 特異性：一種抗原通常僅能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合。 分子基礎(chǔ)：抗原表位與抗體分子高變

3、區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性 。,一、抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn),交叉反應(yīng)（cross reaction）性：若兩種抗原分子有一個(gè)或數(shù)個(gè)相同（或相似）的決定基，則針對一種抗原的抗血清可與另一種抗原發(fā)生反應(yīng)。,結(jié)合價(jià)： 天然抗原分子表面一般含多種抗原決定基，可與多個(gè)抗體分子結(jié)合，為多價(jià)。單體形式的抗體分子有兩個(gè)Fab段，能結(jié)合兩個(gè)相同的抗原決定基，為兩價(jià)。 前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone) Ab過剩和Ag過剩,（二）抗原-抗體結(jié)合的帶現(xiàn)象與可見性,前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone) Ab過剩和Ag過剩,比例合適： 若抗原、抗體的數(shù)量比例合適，抗體分子的兩個(gè)Fab

4、段分別與兩個(gè)抗原決定基結(jié)合，相互交叉連接成網(wǎng)格狀復(fù)合體，則反應(yīng)體系中基本不存在游離的抗原或抗體，此時(shí)形成肉眼可見的反應(yīng)物（沉淀物或凝集物）。因此，確定反應(yīng)體系中抗原、抗體的最適比例十分重要。,抗原-抗體反應(yīng)為分子表面的非共價(jià)結(jié)合，結(jié)合雖穩(wěn)定但可逆。在一定條件下（如低pH、高濃度鹽、凍融等），抗原-抗體復(fù)合物可被解離。解離后的抗原和抗體仍保持原有理化特性和生物學(xué)活性。根據(jù)此特點(diǎn)，可借助親和層析法純化抗原或抗體。,（三）可逆性,（一）電解質(zhì) 抗原和抗體有對應(yīng)的極性基團(tuán)，能相互吸附并由親水性變?yōu)槭杷?。電解質(zhì)的存在使抗原-抗體復(fù)合物失去電荷而凝聚，出現(xiàn)可見反應(yīng)，故免疫學(xué)試驗(yàn)中多用生理鹽水稀釋抗原或抗

5、體。,二、抗原-抗體反應(yīng)的影響因素,（二）酸堿度 抗原抗體反應(yīng)的最適pH是6-8。 （三）溫度 最適溫度為37。有些例外，如冷凝集素在 4左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20以上反而解離。,（四）抗原和抗體的性質(zhì) 抗體的特異性和親和力是決定抗原-抗體反應(yīng)的關(guān)鍵因素。 此外，抗原理化性質(zhì)、抗原決定基多寡和種類等均可影響抗原-抗體反應(yīng)。,抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對應(yīng)的抗原決定基之間的結(jié)合能力,親和力(affinity),一個(gè)抗體分子與整個(gè)抗原分子間的結(jié)合強(qiáng)度,親合力(avidity),根據(jù)抗原的性質(zhì)、結(jié)合反應(yīng)的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分等因素分類： （一）凝集反應(yīng) （二）沉淀反應(yīng) （三）補(bǔ)體參加的反應(yīng) （四）免

6、疫標(biāo)記技術(shù),三、Ag-Ab反應(yīng)的基本檢測方法,顆粒性抗原（細(xì)菌或細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(yīng)(agglutination) 。,（一）凝集反應(yīng)（Agglutination Tests）,1直接凝集（direct agglutination) ： 細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)，可出現(xiàn)細(xì)菌或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。 2間接凝集（indirect or passive agglutination) ：檢測針對可溶性Ag的Ab 3間接凝集抑制試驗(yàn) (direct agglutination inhibition test) 4. 協(xié)同凝集試驗(yàn)（co-aggluti

7、nation test）,1直接凝集,Applications Blood typing（血型測定） Bacterial infections（細(xì)菌性感染）,Practical considerations Easy（簡便） Semi-quantitative（半定量）,2、間接凝集,Definition - agglutination test done with a soluble antigen coated onto a particle,Applications Measurement of antibodies to soluble antigens,3、間接凝集抑制試驗(yàn),應(yīng)用：可

8、用于檢測抗原或抗體（如早孕的檢測），其 靈敏度高于一般間接凝集試驗(yàn)。,各種凝集反應(yīng)示意圖,Ag-Ab反應(yīng)的基本檢測方法 （一）凝集反應(yīng) （二）沉淀反應(yīng) （三）補(bǔ)體參加的反應(yīng) （四）免疫標(biāo)記技術(shù),Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、細(xì)菌濾液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，形成出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物的現(xiàn)象稱為沉淀反應(yīng)。 該反應(yīng)多用半固體瓊脂凝膠作為介質(zhì)進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散或免疫擴(kuò)散，即可溶性抗原與抗體在凝膠中擴(kuò)散，在比例合適處相遇即形成可見的白色沉淀。,（二）沉淀反應(yīng)（Precipitation Tests）,1單向免疫擴(kuò)散(single immunodiffusion) 2雙向免疫擴(kuò)散(

9、double immunodiffusion) 3免疫電泳(immunoelectrophoresis) 4免疫比濁(immunonephelometry),（二）沉淀反應(yīng),單向免疫擴(kuò)散(single immunodiffusion),雙向免疫擴(kuò)散(double immunodiffusion),單擴(kuò)與雙擴(kuò)原理,Ag-Ab反應(yīng)的基本檢測方法 （一）凝集反應(yīng) （二）沉淀反應(yīng) （三）補(bǔ)體參加的反應(yīng) （四）免疫標(biāo)記技術(shù),用熒光素、酶、放射性核素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)的檢測，是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)。標(biāo)記物與抗體或抗原連接后并不改變抗原抗體的免疫特性，具有靈敏度高

10、、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點(diǎn)。,（四）免疫標(biāo)記技術(shù) （Immunolabelling technique）,此法乃用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原-抗體復(fù)合物散發(fā)熒光，借此對抗原進(jìn)行定性或定位。,1免疫熒光法 (immunofluorescence,IF),（1）直接熒光法：熒光素直接標(biāo)記抗體，對標(biāo)本進(jìn)行檢測。該法優(yōu)點(diǎn)是特異性高，缺點(diǎn)是檢查任一抗原均須制備相應(yīng)熒光抗體。 （2）間接熒光法：用一抗與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測。該法優(yōu)點(diǎn)是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗即可用于多種抗原的檢測,但非特異性反應(yīng)亦增強(qiáng)。,免疫

11、熒光法分類,免疫熒光法圖示,Mouse kidney section,Laminin - green-fluorescent Qdot 565 IgG CD31- red-fluorescent Qdot 655 IgG Nuclei - blue-fluorescent Hoechst 33342,Control,TSLP,TSLP - AlexaFluor 488 Nuclei - propidium iodide,HASMC,此法將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。應(yīng)用酶標(biāo)測定儀測定光密度（OD）值可反映抗原含量，靈敏度達(dá)ng/ml甚至

12、pg/ml水平。 常見的標(biāo)記物為：辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）,酶免疫測定 (enzyme immunoassay, EIA),常用的方法如下： （1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) （2）免疫細(xì)胞或組織化學(xué)（immunocytochemistry or immunohistochemistry,ICC or IHC),1） ELISA 是酶免疫測定中應(yīng)用最廣的技術(shù)，用于測定可溶性抗原或抗體。 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、操作簡便、穩(wěn)定性強(qiáng)，可自動化檢測，從而被廣泛用于檢測多種病原體抗原或抗體、血液及其他體液中微量蛋白成

13、分、細(xì)胞因子等。,雙抗體夾心法： 用于檢測特異性抗原。該試驗(yàn)所用的包被抗體與酶標(biāo)抗體應(yīng)分別針對不同抗原決定基，或其中之一用多克隆抗體，且相互間應(yīng)無交叉反應(yīng)。 間接法： 用于檢測特異性抗體。用已知抗原包被固相，加入待檢血清標(biāo)本，再加酶標(biāo)記的二抗，加底物觀察顯色反應(yīng)。,ELISA分類,間接法圖示,ELISA反應(yīng)過程,動畫演示,2)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT),生物素（biotin）是廣泛分布于動、植物體內(nèi)的一種生長因子，又稱輔酶R或維生素H。 親和素(avidin)是卵白及某些微生物中的一種蛋白質(zhì)，由4個(gè)亞單位組成。 生物素與親和素間具有高度親和力，且均能偶聯(lián)抗體、抗原和辣根過氧化物酶而不影

14、響其生物學(xué)活性。,3）BAS（biotin avidin system)-ELISA：,BAS-ELISA,應(yīng)用酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對組織或細(xì)胞表面抗原進(jìn)行定性、定量、定位。,4）免疫細(xì)胞或免疫組化技術(shù),ICC,IHC,乃用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性，檢測靈敏度達(dá)pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素為125I和131I，分為液相和固相兩種方法。 該法常用于測定微量物質(zhì)，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素，嗎啡、地高辛、IgE等。,3放射免疫測定法 (radioimmunoassay, RIA)

15、,化學(xué)發(fā)光免疫分析,將發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯、魯米諾等）標(biāo)記抗原或抗體，發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑（如過氧化陰離子）激發(fā)下發(fā)射光子，通過自動發(fā)光分析儀測定光子產(chǎn)量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。 該法靈敏度高，常用于檢測血清超微量活性物質(zhì)（甲狀腺素等激素）。,該法又稱Western印跡法，其結(jié)合凝膠電泳與固相免疫技術(shù)，將借助電泳所區(qū)分的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相載體，再應(yīng)用酶免疫、放射免疫等技術(shù)進(jìn)行檢測。 該法能對分子大小不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離并確定其分子量，常用于檢測多種病毒抗體或抗原。,免疫印跡法(immunoblotting),免疫印跡法,第一節(jié)基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測方法 第二節(jié)免疫細(xì)胞的檢測 第三節(jié)免疫分子

16、的檢測 第四節(jié) 免疫學(xué)預(yù)防,一、 淋巴細(xì)胞及亞群的分離,外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離：葡聚糖泛影葡胺（即淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心法,淋巴細(xì)胞亞群的分離 淋巴細(xì)胞為不均一的群體，可借助其表面標(biāo)志及 功能差異而分為不同的群和亞群。 1尼龍棉分離法 2E花環(huán)分離法 3洗淘法 4流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM) 5磁珠分離技術(shù),E花環(huán)實(shí)驗(yàn),磁珠分選,Removal of T cells from marrow graft,二、免疫細(xì)胞功能的測定 1. T細(xì)胞功能測定： (1) 細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn)： 可分為非特異性絲裂原和特異性抗原兩類。 * 絲裂原主要有PHA、Con A

17、和PWM； * 抗原刺激物有破傷風(fēng)類毒素、PPD和白色念珠菌等；,淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),(2) T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)：CTL,(1) B細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn) (2) 溶血空斑形成試驗(yàn) (3) 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT):,2. B細(xì)胞功能判定,溶血空斑實(shí)驗(yàn),第一節(jié)基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測方法 第二節(jié)免疫細(xì)胞的檢測 第三節(jié)免疫分子的檢測 第四節(jié) 免疫學(xué)預(yù)防, 在體外用已知抗原檢測相應(yīng)抗體：見前述 用已知抗體對各類免疫球蛋白作定性、定量測定： 檢測血清含量高的IgG、IgA和IgM時(shí)，可用免疫比濁法； 檢測IgD和IgE選用ELISA、RIA等靈敏度高的方法。 診斷免疫球蛋白異常性疾?。ㄈ绻撬?/p>

18、瘤、性聯(lián)無丙種球蛋白血癥等），可用免疫電泳等方法。,一、免疫球蛋白的測定,了解體內(nèi)補(bǔ)體激活狀況，輔助有關(guān)疾病的診斷。對血清含量高的C3、C4、B因子等，可用免疫比濁法，其他含量低的成分則借助ELISA、RIA等方法。血清總補(bǔ)體活性測定常采用50%補(bǔ)體溶血法（CH50），其原理是：用SRBC和兔抗SRBC作為抗原抗體復(fù)合物，通過經(jīng)典途徑激活待檢血清中的補(bǔ)體，導(dǎo)致SRBC溶解。若待檢血清補(bǔ)體含量減少或成分缺失，則影響溶血結(jié)果。,二、補(bǔ)體測定,（一）免疫學(xué)測定法 以細(xì)胞因子作為抗原，用相應(yīng)抗體進(jìn)行定量或半定量檢測。對于分泌性細(xì)胞因子，常用方法為雙抗體夾心法ELISA、RIA、ELISPOT、免疫印跡

19、法等方法檢測。對于胞內(nèi)細(xì)胞因子，采用FCM免疫熒光技術(shù)檢測,三、細(xì)胞因子（CKs）檢測,（二）生物活性測定法 根據(jù)細(xì)胞因子特定的生物學(xué)活性，借助相應(yīng)指示系統(tǒng)，如選用各種依賴性細(xì)胞株或靶細(xì)胞，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品對照測定，從而得知樣品中細(xì)胞因子活性水平，一般以活性單位（U/ml）表示。 （三）分子生物學(xué)測定法 具體方法為聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)定量PCR等。,第一節(jié)基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測方法 第二節(jié)免疫細(xì)胞的檢測 第三節(jié)免疫分子的檢測 第四節(jié) 免疫學(xué)預(yù)防,一、免疫學(xué)預(yù)防,免疫學(xué)預(yù)防（immunoprophylaxis）是指通過人工刺激機(jī)體產(chǎn)生或直接輸入免疫活性物質(zhì)，從而特異性清除致病因子，達(dá)到預(yù)防

20、疾病的目的。,免疫包括： 先天免疫：生物體在長期種系發(fā)育和進(jìn)化中逐漸形成的一系列防衛(wèi)機(jī)制。 特異性免疫：個(gè)體在生命過程中接受抗原刺激后主動產(chǎn)生或被動獲得的。,特異性免疫獲得方式有兩種： 1、自然免疫（natural immunization),自然主動免疫：指機(jī)體受到各種病原體隱性或顯性感染后主動產(chǎn)生的特異性免疫。 自然被動免疫：指機(jī)體經(jīng)胎盤或初乳被動獲得的特異性免疫。,2、人工免疫（artificial immunization） 即免疫學(xué)預(yù)防，指采用人工方法，將疫苗、類毒素或含特異性抗體和細(xì)胞的免疫制劑接種于人體，以增強(qiáng)宿主的抗病能力。 人工主動免疫 人工被動免疫,人工主動免疫(artif

21、icial active immunization)： 指給機(jī)體接種抗原性物質(zhì)如疫苗、類毒素等，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫力的方法。 人工被動免疫(artificial passive immunization)： 指給人體注射含特異性抗體的免疫血清或細(xì)胞 因子等制劑,使受者迅速獲得特異性免疫力的方法。,人工自動免疫與人工被動免疫的比較,人工主動免疫的接種物,疫苗（Vaccine）：細(xì)菌，病毒，螺旋體，立克次體和類毒素等抗原性生物制品統(tǒng)稱為疫苗。 理想疫苗的標(biāo)準(zhǔn)：安全；有效；實(shí)用,分類： 1、死疫苗（death vaccine）:選用免疫原性強(qiáng)的微生物標(biāo)準(zhǔn)株經(jīng)大量培養(yǎng)后，用物理或化學(xué)方法將其殺死或滅活而制成的預(yù)防制劑。如霍亂、百日咳、傷寒、鉤端螺旋體疫苗。 優(yōu)點(diǎn)：主要誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生，安全 缺點(diǎn)：不能繁殖，需多次刺激，注射局部和全身反應(yīng)嚴(yán)重,2、減毒活疫苗（live-attenuated Vaccine