修飾標(biāo)記引物的介紹.pptx

1、推薦將改性引物介紹、保存條件、冷凍干燥引物和液體稀釋后的引物保存在-20C. HEX、TET和FAM中對(duì)光敏。 請(qǐng)保存在陰暗表兄弟處或用橘紅色的管道保存。 建議放入黑盒子中染料暴露光下半壽期(約) hex 4.5 hours tet 2.25 hours fam 1.125 hours hex和Tet標(biāo)識(shí)牌的寡聚核苷酸在PCR 30循環(huán)內(nèi)穩(wěn)定。 但是在不利的環(huán)境(高PH、高溫)下，TET比HEX穩(wěn)定。 稀釋方法對(duì)于非Cy系熒光標(biāo)識(shí)牌引物，推薦用TE稀釋，濃度高于10uM。 由Cy3和Cy5標(biāo)識(shí)牌的引物在堿條件下容易分解，在中性溶液溶解。 穩(wěn)定性、凍干的引物在-20C下可穩(wěn)定1年。 4度可以穩(wěn)定

2、幾個(gè)月。 積液在-20C時(shí)至少穩(wěn)定6個(gè)月，在4度時(shí)穩(wěn)定數(shù)周。 AP偶聯(lián)引物-放入AP儲(chǔ)藏液中運(yùn)輸，儲(chǔ)藏4度，可穩(wěn)定12個(gè)月。 HRP偶聯(lián)引物-放入HRP貯藏液中運(yùn)輸，4度貯藏，可穩(wěn)定12個(gè)月。 修飾對(duì)OD值的影響，一些熒光化學(xué)基在260 nm處也有吸收光：的修飾： FAM、Fluorescein、HEX、TAMRA、and TET。 雖然其他260 nm處可能有吸收值，但由于數(shù)據(jù)沒有公開，因此在訂正運(yùn)算時(shí)不包含在內(nèi)。 AP and HRP耦合的寡聚核苷酸：蛋白和核苷酸都有OD值，但可能不影響寡聚核苷酸的真實(shí)OD值。 合成規(guī)模和精制方式、合成規(guī)模為25nnol時(shí)，合成寡聚核苷酸不能為10bp以上

3、。 問題：這個(gè)表和網(wǎng)站上的不一致，現(xiàn)在在中國(guó)不論合成規(guī)模，能合成小于10bp的寡聚核苷酸嗎？生物，生物修飾能耐熱和pH (加熱到100度，可以暴露在pH2-10中)。 也許能夠承受其他極端的環(huán)境，但是還沒有檢測(cè)出來。 還原劑可能對(duì)生物素修飾沒有影響，但沒有精確數(shù)據(jù)。 生物素寡聚核苷酸在OD260中進(jìn)行定量(生物素在260中不吸收光)。 生物素化的DNA成功地轉(zhuǎn)化為像DH5那樣的細(xì)菌。 5-生物素比3-生物素穩(wěn)定，因?yàn)闆]有相鄰的烴化學(xué)基。 3-生物素的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以預(yù)測(cè)，3-Biotin有1個(gè)期限，2個(gè)寡聚核苷酸溶解在堿緩沖液中等，有可能暴露在堿環(huán)境中。 這是因?yàn)?-Biotin具有與RNA結(jié)構(gòu)相

4、似的鄰接烴化學(xué)基。5生物學(xué)、3生物學(xué)、穩(wěn)定性依次為3-NH23-PO43-BIO。 3生物素修飾引物的長(zhǎng)度不得超過99個(gè)核苷酸。 由于3 -生物素是以CPG修飾的形式提供的(連接至固體支持體)，因此該系統(tǒng)將3 -生物素連接至序列中最后的核苷酸。 生物素dT :生物素dT是將生物素連接至dT鹽化學(xué)基上，因此只有5鹽化學(xué)基為t時(shí)，才能使用生物素dT。 生物素，問題：生物素dT的分子式？ 5和3生物素修飾的合成過程(合成后、合成前)？ 用什么樣的連結(jié)結(jié)合來連結(jié)到寡聚核苷酸？ 與寡聚核苷酸的哪個(gè)位置(戊糖、鹽化學(xué)基)相連？ 最終與寡核酸相連的形狀是，生物素、若丹明、若丹明溶于水和TE的顏色是大頭針色，

5、稍微紫色。 羅丹明修飾不限于合成規(guī)模，是合成后修飾。 需要額外的精制。 注：該數(shù)據(jù)是染料溶解在甲醇中測(cè)定的。 溶解于水和TE中，與寡聚核苷酸結(jié)合后的值發(fā)生變化。 羅丹明、問題：目前中國(guó)地轄區(qū)能夠合成的羅丹明修飾為5Rhodamine Green、5Rhodamine Red、5Rhodamine Red、3Rhodamine Red。紅色，綠色溶解在水或TE中的顏色？ 5和3修飾時(shí)的Rhodamine Green、Rhodamine Red的分子結(jié)構(gòu)式？ 5和3修飾的方法：接戊糖和鹽化學(xué)基的哪一個(gè)？用什么樣的化學(xué)鍵連接？ 都是合成后修飾嗎？ 合成后修飾：底漆從固體介質(zhì)解離后純化修飾，還是底漆合

6、成后直接修飾固體介質(zhì)？ 修飾之前需要精制嗎？ 修飾后需要精制嗎？ 最終與寡核酸相連的形式為5 HEX、TET or 6-FAM、hexis4、7、2457hexachlorofluorescein、TET is 274,7、7、7、tetrachlorofluorescein hex and Tet為合成循環(huán)這些個(gè)通過磷酸二酯類化合物鍵的共價(jià)鍵結(jié)合到5末端的最后一個(gè)糖環(huán)。 液體中的顏色： HEX為大頭針，F(xiàn)AM為黃色，TET為橘紅色，這些個(gè)修飾的寡聚核苷酸不能進(jìn)行硫磷氧化修飾。HEX、TET or 6-FAM、注：摩爾消光系數(shù)用最大nm以下的激光進(jìn)行了測(cè)定。 由于pH和成分的微小變化可能影響上

7、述數(shù)據(jù)，因此染料的顏色依賴于ABI設(shè)備上的“過濾煙嘴設(shè)備”: dyesfilterafilterbhexgreen (560 nm ) yellow (560 nm )6- fam blue ()的3HEX、TET or 6-FAM 連接牛鼻子是什么？ 3HEX、TET or 6-FAM是合成后修飾嗎？ 3HEX、TET or 6-FAM可以進(jìn)行硫磷酸化修飾嗎？ 5和3的修飾的不同，如穩(wěn)定性等？ 最終與寡核酸相連的形式是，HEX、TET or 6-FAM、磷酸化、5磷酸化作用，通過b氰乙基化學(xué)反應(yīng)被添加到引線5末端的糖環(huán)中，而不是最后的鹽化學(xué)基。 什么？ 什么？ 由于三磷酸鹽與固體支持介質(zhì)連接

8、，在合成的第一個(gè)循環(huán)中鹽化學(xué)基結(jié)合。 阻止多聚酶的伸長(zhǎng)。 穩(wěn)定性：假設(shè)DNA:3-PO4比3-BIO穩(wěn)定。 3-BIO在堿性環(huán)境下脫落，但3-PO4不脫落。 用凝膠純化磷酸化引物時(shí)，不能區(qū)分全長(zhǎng)引物和n-1引物。 磷酸化學(xué)基具有陰性電荷，因此對(duì)陽離子電泳有影響。 用HPLC純化的磷酸化寡聚核苷酸中，真空離心蒸發(fā)濃縮后有“污染”和微黃。 這可能是因?yàn)檫@種產(chǎn)物是綜合產(chǎn)物。 在進(jìn)行QC時(shí)，能夠通過乙醇沉淀而除去。 問題： 3磷酸化的結(jié)構(gòu)式？ 連接牛鼻子是什么？ 5磷酸化和3磷酸化的穩(wěn)定性有什么區(qū)別？ 5限定的連線牛鼻子？ 最終與寡聚核苷酸相連的形狀是？磷酸化、Aminolinker、5Aminoli

9、nker(C6 )在合成循環(huán)的最后一步以亞磷酸胺的形式通過b氰乙基化學(xué)反應(yīng)添加到引物5的糖環(huán)中，未添加到最后的鹽化學(xué)基中。 5氨基化學(xué)基的標(biāo)準(zhǔn)耦合效率為95%，氨基化學(xué)基為260nm，沒有吸光值的210nm處有吸光值。 在陽離子電泳中不能檢測(cè)出其存在(阿加里肌肉凝膠和亞克力酰胺)。 3Aminolinker(C7)僅與FAM、HEX、TET、Fluorescein、Biotin、Amine、and phosphate等5種修飾兼容。 其他5修飾(Alexa dyes等)需要氨基化學(xué)基才能與寡聚核苷酸結(jié)合，免不得該染料與3氨基化學(xué)基結(jié)合。 阻止連接和多聚酶伸長(zhǎng)的一般思維方法為末端雙重脫氧法，但該

10、方法價(jià)格昂貴或無法使用。 因?yàn)楦鶕?jù)應(yīng)用程序除去3或5即可，所以只要用3或5的氨基化學(xué)基修飾就能滿足需要。 另外氨基修飾是最簡(jiǎn)單廉價(jià)的方法。 可以是任意氨基修飾。 5末端C6型效果更好。 用化學(xué)交聯(lián)劑可以連接雙鏈DNA和肽。 可以嘗試用叔胺修飾的DNA和戊二醛的交聯(lián)。問題：5amino鏈路器(c 12 )、5 amino鏈路器(c6)、3 amino鏈路器(c7)、dt c6- amino鏈路器、3Amino /Amine鏈路器(c7)和3Amino /Amine的修飾過程？ 核苷酸的哪里連接？ dt c6- amino鏈接器的修飾過程？ 這個(gè)修飾只能用5端嗎？ 對(duì)這些個(gè)的氨基修飾有什么不同？

11、Aminolinker，Alexa，它們都是通過C6連接臂與寡聚核苷酸連接的。 3端通過氨基化學(xué)基將Alexa連接到引物的3端。 Alexa fluor染料在合成后添加到寡聚核苷酸鏈中。 什么？ 什么？ 什么？ 問： 5和3 Alexa Fluor的結(jié)構(gòu)式？ 5和3 Alexa Fluor是用什么樣的結(jié)合和寡聚核苷酸連接的，是戊糖還是鹽化學(xué)基？ 5和3 Alexa Fluor的合成工藝：合成前修飾還是合成后修飾5和3 Alexa Fluor有什么區(qū)別？ Alexa Fluor、Texas Red-X、修飾化學(xué)基是如何添加到寡聚核苷酸中的？ 首先在DNA的5末端磷酸化學(xué)基中加入氨基化學(xué)基，然后在

12、氨基化學(xué)基中連接帶有羧基化學(xué)基的化學(xué)基。 5-COOH-NH2-PO3-DNA問題：5Texas Red-X、3Texas Red-X的結(jié)構(gòu)式。 合成過程？ 合成前修飾還是合成后修飾？ 5Texas Red-X和3Texas Red-X通過什么樣的耦合和寡聚核苷酸連接？ 戊糖還是鹽化學(xué)基？ 水溶液的顏色？ 5Texas Red-X、3Texas Red-X的區(qū)別是Phospothioate(S-oligos )、S-oligos是寡聚核苷酸中的一元酸間的磷酸二酯類化合物鍵之一的氧用硫代替形成的。 此修飾在連接時(shí)進(jìn)行(不是在合成后進(jìn)行)。 添加鹽化學(xué)基后，進(jìn)行連接修飾。 兩個(gè)鹽化學(xué)基之間的磷酸可

13、以取代通常的雙鍵“o”(碘元素溶液)而轉(zhuǎn)換為雙鍵“s(beaucage試劑)。 最終合成的寡聚核苷酸不是單個(gè)立體結(jié)構(gòu)，而是r和s的立體異構(gòu)體的混合物。 這種修飾也可以是與磷酸二酯類化合物結(jié)合相關(guān)的鹽化學(xué)基。 從固體支持體解離時(shí)，3末端鹽化學(xué)基變成OH，所以不能進(jìn)行硫磷氧化。 可以修飾5個(gè)S-oligo。 例如，客戶可以客制化S-oligo的螢光素標(biāo)記。 不能在“正常”保存其他鹽化學(xué)基的狀態(tài)下，對(duì)某一位置的鹽化學(xué)基進(jìn)行硫磷氧化。 這不是化學(xué)合成的問題，而是法定的原因。 S-oligo和通常的寡聚核苷酸在糨糊上的位置相同。 用HPLC純化法純化硫磷氧化修飾寡聚核苷酸時(shí)，帶狀雙峰或帶狀較寬。Phos

14、pothioate(S-oligos )、Phospothioate的特性：化學(xué)穩(wěn)定，在水溶液中穩(wěn)定，能抵抗核酸酶的應(yīng)用：磷酸硫的反義引物在體內(nèi)受到了許多不同的反應(yīng)歷程的作用。 在RNA水平可以抑制逆轉(zhuǎn)錄活性(抑制核糖核酸病毒復(fù)制)。 作為激活RNase H活性的基質(zhì)的S-ODNs和RNA形成雙鏈，RNase H容易切斷RNA。 反義寡聚核苷酸也可以直接干擾轉(zhuǎn)錄，抑制翻譯。 存在于細(xì)胞球內(nèi)和血液/培養(yǎng)基中的node酶對(duì)S-Oligos基本沒有影響。 由于S-ODNs保持著寡聚核苷酸的帶電狀態(tài)，可以通過與陽離子脂質(zhì)形成復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞球。 存在這些個(gè)的轉(zhuǎn)染率也低的問題。 反義引物在mRNA中的作用

15、部位不同時(shí)，反義引物的作用也不同(例如，寡聚核苷酸和mRNA上的轉(zhuǎn)錄起始密碼子互補(bǔ)，淘汰制效果好)。Phospothioate(S-oligos )、反義S-ODNS的概要/設(shè)定修正提案：典型的尺寸范圍： 14-30 mers.(很多文獻(xiàn)使用20 mers的S-ODNS。 質(zhì)量范圍是5000-11000。 濃度范圍(培養(yǎng)基中) : 15-25 uM (濃度大于該范圍時(shí)，會(huì)引起S-ODNS的非特異性毒性)。 脂質(zhì)中介變量感受態(tài)時(shí)的濃度范圍： 0.1-5 uM。 (寡聚核苷酸的最佳濃度應(yīng)該根據(jù)每個(gè)細(xì)胞系和目標(biāo)分子來決定)注射微量時(shí)的S-ODN的量： 0.03-1 ug/ul體內(nèi)注射時(shí)的S-ODN的

16、量： 0.05-1 mg S-ODN/Kg體重。 磷酸硫鍵的數(shù)目：通常，很多文獻(xiàn)都是在每個(gè)鹽化學(xué)基上形成磷酸硫鍵。 推薦純化方式為：脫鹽或HPLC或多重HPLC (反相和陰絡(luò)離子交換HPLC )。 大多數(shù)參考資料采用HPLC純化引物用于反義引物的研究。有的參考文獻(xiàn)比較了HPLC和脫鹽精制的寡聚核苷酸，但沒有差異。 問題： Phosphorthioate (A/C/G/T )、Phospothioate(S-oligos )、5 -甲醛、5 -醛修飾用化學(xué)制劑屬于芳香族。 含有苯環(huán)；分子量為245。 問題：合成過程？ 合成前修飾還是合成后修飾？ 和寡聚核苷酸的什么樣的化學(xué)基有聯(lián)系？ 連線牛鼻子是

17、什么？ 5Acrydite，5-Acryl修飾寡聚核苷酸可以使寡聚核苷酸與多甲基乙烯凝膠發(fā)生共聚反應(yīng)。 與奇異陣列互補(bǔ)的寡聚核苷酸包括在凝膠中的一個(gè)或更多個(gè)區(qū)域。 包含互補(bǔ)序列的片斷通過這些個(gè)區(qū)域時(shí)被捕獲。 該修飾的寡聚核苷酸用于突然變異檢測(cè)、愛沙尼亞克朗篩選、樣品制備和濃縮及診斷。 問題：5Acrydite分子結(jié)構(gòu)？ 5Acrydite合成工藝？ 和寡聚核苷酸的什么樣的化學(xué)基有聯(lián)系？ 連接牛鼻子是什么？ 5-Thio-MODifier C6 S-S、巰基化學(xué)基修飾的結(jié)構(gòu)是， HO-C6-S-S-C6-PO3-oligo在使用前用DTT切斷巰基化學(xué)基，然后脫鹽后，將連接的寡聚核苷酸溶解在100nM pH7.5體積900 ul的磷酸緩沖液中加入100ulDTT，室溫下孵育1h。 用脫鹽的方法除去DTT和從寡聚核苷酸脫離的保護(hù)化學(xué)基。 用緩沖液預(yù)先平衡NAP-10柱中加入1 mL的樣品，用客戶希望的緩沖液1.5 mL溶出。 馬上用于連接。 問題： 5標(biāo)題修改器c 6、3標(biāo)題c 3和3標(biāo)題c3s-s的結(jié)構(gòu)式。 5熱修改器c6s-s、5熱修改器c 6、3熱c 3和3熱c3s-s的合成過程。 與寡