第六講-基因克隆的質(zhì)粒載體

1、第六講基因克隆的質(zhì)粒載體吳乃虎遺傳和發(fā)育生物學(xué)研究所2005年8月基因克隆的質(zhì)粒載體一.導(dǎo)言1.質(zhì)粒是一種顯著的亞細(xì)胞生物它的結(jié)構(gòu)比病毒簡(jiǎn)單。它既沒(méi)有蛋白質(zhì)外殼，也沒(méi)有細(xì)胞外生命周期。它只能在宿主細(xì)胞中增殖，并隨著宿主細(xì)胞的分裂而遺傳。2.質(zhì)粒有多種類型F-質(zhì)粒：F-因子或性別質(zhì)粒，它能把宿主染色體上的基因和F-因子一起轉(zhuǎn)移到宿主受體細(xì)胞中，而在此之前質(zhì)粒是不存在的。R質(zhì)粒：被稱為抗性因子，R因子)，它編碼一個(gè)或幾個(gè)抗生素抗性基因，并且可以將這種抗性轉(zhuǎn)移到缺少該質(zhì)粒的合適的受體細(xì)胞。Col質(zhì)粒：所謂的Col質(zhì)粒，是一種產(chǎn)生大腸桿菌素的因子，編碼一種控制大腸桿菌素合成的基因。大腸桿菌可以殺死沒(méi)有

2、Col質(zhì)粒的密切相關(guān)的細(xì)菌菌株。3.質(zhì)粒載體20世紀(jì)70年代實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的最廣泛使用的基因克隆載體之一。二、質(zhì)粒的一般特征1.質(zhì)粒脫氧核糖核酸(細(xì)菌質(zhì)粒的定義)*1 .大腸桿菌的質(zhì)粒是一種共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA (cccdna)，它獨(dú)立于宿主染色體進(jìn)行復(fù)制。除了酵母的黑仔質(zhì)粒是核糖核酸質(zhì)粒外，其他質(zhì)粒都是質(zhì)粒。然而，質(zhì)粒DNA的復(fù)制必須依賴于宿主提供的核酸酶和蛋白質(zhì)。*2 .質(zhì)粒的分子大小文獻(xiàn)中有三種說(shuō)法：小的只有103KD，只能編碼2-3個(gè)蛋白質(zhì)；大的可以達(dá)到105千道爾頓，兩者相差幾百倍。1Kb200Kb (Sambrok等人)5Kb400Kb(萊寧格爾)MD(兆道爾頓)=106D(兆道爾頓)

3、1.5Kb1MD*3 .質(zhì)粒DNA與宿主染色體DNA的關(guān)系一般來(lái)說(shuō)，質(zhì)粒DNA可以在宿主染色體外保持自由狀態(tài)，但在某些條件下，它可以可逆地整合到宿主染色體中，然后復(fù)制和細(xì)胞分裂成后代。*4 .質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型超螺旋構(gòu)型：也就是說(shuō)，由共價(jià)閉合的環(huán)狀cccDNA呈現(xiàn)的超螺旋構(gòu)型。走在凝膠前面。環(huán)狀構(gòu)型：即開(kāi)環(huán)的脫氧核糖核酸構(gòu)型，其中一條脫氧核糖核酸鏈保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而另一條鏈有一到幾個(gè)間隙。走進(jìn)凝膠的最后一格。l構(gòu)型：由雙鏈斷裂形成的線性DNA分子的構(gòu)型，稱為l型。走在凝膠中間。2.質(zhì)粒克隆載體的必要條件(三個(gè)常見(jiàn)成分)(1)具有復(fù)制區(qū)域或復(fù)制因子(復(fù)制器)復(fù)制因子：它是指一種特定的質(zhì)粒D

4、NA，它包含質(zhì)粒DNA的ori(復(fù)制起點(diǎn))，以及編碼質(zhì)粒DNA和質(zhì)粒復(fù)制所需的DNA序列結(jié)構(gòu)。*注意復(fù)制器和復(fù)制器之間的概念差異。復(fù)制子：指含有復(fù)制起始位點(diǎn)的DNA復(fù)制單位，如細(xì)菌染色體、病毒基因組、質(zhì)?；蚪M等。任何基因單位，只要它的脫氧核糖核酸能自動(dòng)復(fù)制，就叫做復(fù)制子。*一般來(lái)說(shuō)，質(zhì)粒只包含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，并構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子。然而，在少數(shù)情況下，融合產(chǎn)生的質(zhì)粒也含有兩個(gè)復(fù)制子，但只有一個(gè)是活性的。抗生素抗性基因理想的質(zhì)?？寺≥d體應(yīng)具有兩種抗生素抗性基因，以便為宿主細(xì)胞提供易于檢測(cè)的表型性狀作為選擇標(biāo)記，并且通過(guò)將外源DNA片段插入相關(guān)的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)而形成的重組質(zhì)粒應(yīng)至少保留一個(gè)強(qiáng)選擇

5、標(biāo)記。具有幾個(gè)限制性酶的單一識(shí)別位點(diǎn)這種分子結(jié)構(gòu)特征可以滿足基因克隆的需要，插入適當(dāng)大小的外源基因片段后，質(zhì)粒的復(fù)制功能不會(huì)受到影響。分子量較小，拷貝數(shù)較高這種質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)是：A.低分子量質(zhì)粒易于操作，在克隆外源基因片段(一般不超過(guò)15Kb)后仍能有效地轉(zhuǎn)化為受體細(xì)胞；B.較高的拷貝數(shù)有利于質(zhì)粒DNA的制備，增加克隆DNA片段(基因)的產(chǎn)量；C.低分子量質(zhì)粒分子中特定限制性酶的多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的概率將相應(yīng)降低；3.質(zhì)粒編碼的表型質(zhì)粒的分子量小，僅占細(xì)胞染色體的一小部分，一般約為3%。盡管質(zhì)粒的分子量很小，但它編碼重要的遺傳性狀：A.抗性特征：抗生素抗性、重金屬抗性、毒性陰離子抗性和其他抗性。B.代謝

6、特征：抗生素和細(xì)菌素的合成；簡(jiǎn)單碳水化合物(如乳糖和蔗糖)的代謝；復(fù)合碳水化合物(甲苯、苯胺)和鹵代化合物的代謝；蛋白質(zhì)代謝；固體氮作用；H2S合成；檸檬酸的利用；歐文氏菌色素形成：產(chǎn)堿桿菌的反硝化活性。產(chǎn)堿桿菌合成硫胺素。和歐文氏菌。C.改變宿主生活方式的因素：大腸桿菌腸毒素的合成：金黃色葡萄球菌剝脫毒素的合成：炭疽桿菌外毒素的合成：蘇云金桿菌l-內(nèi)毒素的合成：破傷風(fēng)桿菌神經(jīng)毒素的合成：大腸桿菌定殖抗原的合成：大腸桿菌和鏈球菌溶血素的合成；腸道細(xì)菌的血清耐藥性；耶爾森氏菌的毒性：炭疽桿菌莢膜的合成：鐵在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)運(yùn)。D.其他特征：芽孢桿菌細(xì)胞中氣泡的形成；鏈霉菌的布萊恩形成(致死結(jié))；肺

7、炎克雷伯菌Kik IncN質(zhì)粒的致死效應(yīng)；土壤桿菌對(duì)細(xì)菌素的敏感性；麻風(fēng)桿菌半透明/不透明菌落的變異：Nod Flx豌豆根瘤菌的根際蛋白質(zhì)合成；盲腸acter包涵體的生成；葡萄球菌的內(nèi)肽酶活性。4.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移(1)接合質(zhì)粒和非接合質(zhì)粒*接合質(zhì)粒：也稱為自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，帶有自我復(fù)制基因。控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因；*非接合質(zhì)粒：也稱為不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，它有一個(gè)自我復(fù)制的基因，但失去了控制細(xì)胞配對(duì)和接合轉(zhuǎn)移的基因，因此它不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。大腸桿菌素基因大腸桿菌Col質(zhì)粒非共軛質(zhì)粒具有抗生素抗性基因的大腸桿菌r質(zhì)粒也稱為r因子。帶有宿主染色體DNAF因子結(jié)合質(zhì)粒(因子)加大腸桿菌

8、素基因大腸桿菌素Col質(zhì)粒添加抗生素抗性基因大腸桿菌重組質(zhì)粒和重組因子結(jié)合質(zhì)粒因子是最具代表性的結(jié)合質(zhì)粒：f因子在宿主菌中的三種存在方式：A.染色體外雙鏈環(huán)狀DNA，f細(xì)胞B.染色體外雙鏈環(huán)狀脫氧核糖核酸細(xì)胞宿主染色體片段C.以線性DNA的形式整合到Hfr細(xì)胞中在宿主染色體上。接合質(zhì)粒f因子的接合轉(zhuǎn)移；F細(xì)胞和F細(xì)胞，以及有性須的毛狀結(jié)構(gòu)F細(xì)胞和F細(xì)胞共培養(yǎng)，這些細(xì)胞由性須配對(duì)。這個(gè)過(guò)程叫做細(xì)菌結(jié)合在細(xì)胞配對(duì)過(guò)程中，F(xiàn)細(xì)胞中的F因子遵循滾環(huán)復(fù)制模式，通過(guò)性須通道進(jìn)入F細(xì)胞(單鏈)細(xì)胞變成細(xì)胞質(zhì)粒的接合和轉(zhuǎn)移以及基因工程的安全載體；從基因工程的安全性角度來(lái)看，我們主要對(duì)非共軛質(zhì)粒感興趣：原因如下

9、：(1)聯(lián)合型不僅轉(zhuǎn)移自身；也可引起宿主染色體片段的轉(zhuǎn)移；如果F因子整合到宿主染色體中，會(huì)影響染色體的高頻轉(zhuǎn)移。(4)引起其他非共軛質(zhì)粒的遷移。5.質(zhì)粒DNA的動(dòng)員(1)質(zhì)粒DNA遷移的概念由共存的接合質(zhì)粒引發(fā)的非接合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過(guò)程稱為質(zhì)粒DNA的遷移。非接合質(zhì)粒不能自我轉(zhuǎn)移，因?yàn)樗姆肿恿啃〉阶阋跃幋a轉(zhuǎn)移過(guò)程中所需的所有基因。然而，如果在宿主細(xì)胞中存在共存的接合質(zhì)粒，它們通?？梢员晦D(zhuǎn)移。質(zhì)粒DNA遷移的原理ColE1質(zhì)粒是一種遷移性非接合質(zhì)粒ColE1質(zhì)粒遷移的生化過(guò)程：遷移條件Bom位點(diǎn)，(位于ColE1質(zhì)粒分子上)由mob基因編碼的核酸酶也被稱為遷移蛋白*1.bom位點(diǎn)也稱為nic位點(diǎn)，

10、遷移蛋白作用于nic位點(diǎn)，從而誘導(dǎo)非連接質(zhì)粒遷移。Mob基因=聯(lián)合動(dòng)員基因。Nic位點(diǎn)=當(dāng)啟動(dòng)接合DNA轉(zhuǎn)移時(shí)，自轉(zhuǎn)移接合質(zhì)粒在轉(zhuǎn)移起點(diǎn)oriT受到鏈特異性和位點(diǎn)特異性單鏈切割的DNA位點(diǎn)。*2 .許多質(zhì)粒載體在構(gòu)建過(guò)程中丟失了nic位點(diǎn)，因此無(wú)法遷移。nic-質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移途徑是形成融合質(zhì)粒，使它們成為形式上的接合質(zhì)粒的一部分。*3 .重組缺陷宿主菌株的應(yīng)用在有重組缺陷的宿主菌株中，nic質(zhì)粒不會(huì)與接合質(zhì)粒重組，因此nic質(zhì)粒在recA宿主中比nic質(zhì)粒更穩(wěn)定。*4 .圖4-5說(shuō)明6.質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型低拷貝數(shù)質(zhì)粒受“嚴(yán)格質(zhì)?！笨刂聘呖截悢?shù)質(zhì)粒的“松弛質(zhì)?！辟|(zhì)?？截悢?shù)的定義：文獻(xiàn)中常用兩種定義

11、A.通用定義：當(dāng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中包含的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)量。B.特殊校準(zhǔn)：在富培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)的細(xì)菌細(xì)胞可以有3-4個(gè)染色體，而在碳供應(yīng)不足的培養(yǎng)基中緩慢生長(zhǎng)的細(xì)菌細(xì)胞平均只有1.1個(gè)染色體。因此，在一些文獻(xiàn)中質(zhì)粒拷貝數(shù)的定義是每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中每條染色體上質(zhì)粒DNA分子的平均數(shù)。C.這本書定義了在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的每個(gè)細(xì)胞含有20個(gè)以上的質(zhì)粒，這被稱為高拷貝數(shù)質(zhì)粒；當(dāng)拷貝數(shù)小于20時(shí)，稱為低拷貝數(shù)質(zhì)粒。7.質(zhì)粒的不相容性不相容，即不相容定義：指在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩個(gè)密切相關(guān)的質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。注意：只有當(dāng)有明確的證據(jù)表明第二個(gè)B已經(jīng)進(jìn)入含有質(zhì)粒

12、A的宿主細(xì)胞，并且其DNA沒(méi)有被宿主細(xì)胞限制系統(tǒng)降解，但這兩個(gè)細(xì)胞不能長(zhǎng)時(shí)間共存時(shí)，只有在這種情況下我們才能說(shuō)A和B是不相容的質(zhì)粒。不相容組的概念：彼此不相容的質(zhì)粒屬于同一不相容組?？梢韵嗷ス泊娴馁|(zhì)粒屬于不同的不相容組。同一個(gè)不相容群體的南方粒在遺傳關(guān)系上是密切的。質(zhì)粒不相容的分子基礎(chǔ)質(zhì)粒不相容的分子基礎(chǔ)主要是由它們的復(fù)制功能之間的相互干擾引起的：*1負(fù)反饋環(huán)大多數(shù)質(zhì)粒產(chǎn)生阻遏蛋白，阻遏蛋白可以控制質(zhì)粒的復(fù)制，阻遏蛋白的數(shù)量與細(xì)胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比。當(dāng)質(zhì)粒的拷貝數(shù)較少時(shí)，細(xì)胞中的阻遏蛋白相對(duì)減少，因此阻遏蛋白與質(zhì)粒DNA中的靶序列相互作用使其復(fù)制。隨著質(zhì)粒DNA的復(fù)制，質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加，因此

13、編碼產(chǎn)生的阻遏蛋白數(shù)量增加。由于細(xì)胞中阻遏蛋白的濃度增加，將形成二聚體，從而失去與質(zhì)粒結(jié)合并促進(jìn)其復(fù)制的能力。結(jié)果質(zhì)粒復(fù)制停止，即質(zhì)粒拷貝數(shù)受被抑制蛋白的負(fù)反饋調(diào)節(jié)：負(fù)反饋控制回路(負(fù)反饋回路)當(dāng)質(zhì)粒面對(duì)高拷貝數(shù)和高濃度的阻遏蛋白時(shí)，其復(fù)制活性被抑制。當(dāng)質(zhì)粒的拷貝數(shù)低，阻遏蛋白濃度低時(shí)，其復(fù)制活性將繼續(xù)。*2 .同一細(xì)胞含有兩個(gè)相容的質(zhì)粒因?yàn)檫@兩個(gè)相容的質(zhì)粒是遠(yuǎn)相關(guān)的，它們產(chǎn)生的阻遏蛋白不會(huì)影響另一個(gè)質(zhì)粒的復(fù)制。因此，這兩種相容的質(zhì)粒在同一細(xì)胞中保持正常的拷貝數(shù)。*3 .同一細(xì)胞含有兩個(gè)不相容的質(zhì)粒鑒于這些不相容質(zhì)粒之間的密切遺傳關(guān)系，由它們產(chǎn)生的阻遏蛋白不僅影響它們自身質(zhì)粒DNA的復(fù)制，還影

14、響彼此質(zhì)粒DNA的復(fù)制。因此，兩種阻遏蛋白共同調(diào)節(jié)質(zhì)粒的復(fù)制速率。質(zhì)粒拷貝數(shù)控制系統(tǒng)不能區(qū)分這兩種不相容的質(zhì)粒，只能隨機(jī)選擇其中一種進(jìn)行復(fù)制。因此，會(huì)出現(xiàn)拷貝數(shù)偏差。兩個(gè)不相容的質(zhì)粒通常有不同的拷貝數(shù)，高拷貝數(shù)對(duì)復(fù)制抑制劑的敏感性低于低拷貝數(shù)。因此，當(dāng)復(fù)制抑制劑(阻遏蛋白)的濃度較低時(shí)，高拷貝質(zhì)粒仍然可以復(fù)制，從而可以消除(稀釋)低拷貝質(zhì)粒。3.質(zhì)粒的分離和純化1.氯化銫-EtBr密度梯度離心原理(1)宿主染色體DNA和質(zhì)粒DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)差異*質(zhì)粒DNA分離純化的分子本質(zhì)是如何區(qū)分細(xì)胞破裂后釋放的染色體DNA和質(zhì)粒DNA混合物中的質(zhì)粒DNA和染色體DNA，從而只獲得質(zhì)粒DNA。*然而，質(zhì)粒D

15、NA和染色體DNA在化學(xué)結(jié)構(gòu)上沒(méi)有區(qū)別。因此，為了將質(zhì)粒DNA與其宿主染色體DNA區(qū)分開(kāi)來(lái)，達(dá)到分離純化的目的，必須從其DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)中尋找突破口。實(shí)驗(yàn)表明，在細(xì)胞裂解和DNA分離過(guò)程中，高分子量的細(xì)胞染色體DNA容易斷裂成相應(yīng)的線性片段，而質(zhì)粒DNA由于其分子量小、結(jié)構(gòu)緊湊而保持完整。氯化銫-EtBr密度梯度離心是一種經(jīng)典的分離和純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)，它是基于宿主染色體DNA和質(zhì)粒DNA在高級(jí)結(jié)構(gòu)上的差異(或異質(zhì)性)。(2)CsCl的作用在氯化銫密度梯度離心中，氯化銫用作介質(zhì)，其密度為1.7g/cm3。超速離心平衡一段時(shí)間后，形成1-1.9052克/立方厘米的連續(xù)浮力密度梯度。眾所周知，大腸桿菌宿主染色體DNA、質(zhì)粒DNA、大腸桿菌宿主染色體DNA和核糖核酸四種大分子物質(zhì)具有不同的浮力密度，因此它們?cè)诔匐x心平衡后會(huì)以等密度位置分布在CsCl連續(xù)密度梯度介質(zhì)中，從而達(dá)到相互分離的目的：A.浮力密度=2.0g/cm3的核糖核酸大分子沉入離心管