現(xiàn)代分子生物學技術.ppt

1、分子生物學研究方法,基因操作,核心技術,（一）三大成就 ：,1、 40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題；,一、發(fā)展歷程及基礎,2. 50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題；,Rosalind Franklin,3. 50年代末至60年代，相繼提出了中心法則和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。,Jacob and Monod,（二）兩大技術保證：,1.DNA的體外切割和連接,1962年Arber 發(fā)現(xiàn)限制性核酸內切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了 DNA

2、 連接酶,2. DNA的核苷酸序列分析技術,二、 DNA操作技術,（一） 核酸的凝膠電泳,基本原理：一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當的電極，這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數成正比,與分子的摩擦系數成反比,DNA和RNA被稱為多聚陰離子（polyanions），核酸分子放置在電場當中，會向正電極的方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構型。,大分子量的DNA 移動的慢,小分子量的DNA 移動的快,電泳緩沖液,陽極,陰極,DNA加樣孔,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范

3、圍為0.250kb之間,聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為1到1000個堿基對之間,凝膠濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強；反之濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。,在紫外線的照射下結合溴化乙錠（簡稱EtBr）的DNA分子發(fā)出熒光,每條DNA帶中僅含有0.05g的微量DNA也可以被清晰地檢測出來。,稱樣,溶解,加熱,制板,倒膠,電泳操作基本程序,取樣,點樣,電泳,檢測,結果分析,（二） 核酸的分子雜交,將帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應的同源區(qū)段就會退火形成雙鏈結構。如果退火的核酸來自不同的生物有機體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。

4、DNA/DNA 或DNA/RNA,不同溫度下DNA的構型變化,在大多數核酸雜交反應中，經過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過毛細管或電導作用被轉移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印”上去的，因此，核酸雜交也被稱為“印跡雜交”。,材料：尼龍濾膜 、硝酸纖維素濾膜 、二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）,步驟： 第一，將分離的核酸樣品轉移到固體支持物濾膜上核酸印跡轉移、電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法; 第二，是將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交,Southern Blotting的過程 （1）堿變性的瓊脂糖凝膠電

5、泳分離的DNA （2）通過電泳液的移動轉移膠中的DNA （3）固定膠中的DNA （4）預雜交和雜交（放射性和熒光檢測） （5）結果檢測,1、Southern Blotting（DNA印跡技術）,常用的熒光染料：C5、C3等,2.Northern blotting（RNA印跡技術） 是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。,3.Western blotting（蛋白質雜交技術）,將蛋白質從電泳凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標記的特定蛋白質之抗體進行反應。,主要步驟： 蛋白質樣品的制備 SDS-聚丙烯酰胺凝膠(P

6、AGE)電泳 蛋白質的電轉移：硝酸纖維素濾膜 靶蛋白的免疫學檢測,Step 1.靶蛋白于第一抗體（一抗）反應,Step 2.與標記的第二抗體（酶標二抗）反應,Step 3.顯色反應：酶促反應,4、原位雜交（in situ hybridization ）,將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交。 特點: 能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究 不需從組織或細胞中提取核酸，對含量極低的靶序列靈敏度高 能準確反映組織細胞的相互關系及功能狀態(tài),核酸原位雜交的基本步驟,細胞或組織的固定：載玻片 組織細胞雜交前的預處理: 用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質 探針的選擇和標記 雜交 雜交

7、結果檢測,檢測重組體克隆的菌落雜交技術,5、探針的標記,探針的種類:根據核酸的性質，可分為DNA和RNA探針;根據是否使用放射性標記物的與否,可分為放射性標記探針和非放射性標記探針;根據是否存在互補鏈,可分為單鏈和雙鏈探針;根據放射性標記物摻入情況,可分為均勻標記和末端標記探針。,標記物:核素標記物（同位素標記）：32P、35S、3H等 非核素標記物（非同位素標記）：生物素、地高辛、熒光素,缺口平移法,（1）雙鏈DNA探針,當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時,E.coli DNA聚合酶就可將核苷酸連接到切口的3羥基末端。 同時該酶具有從53的核酸外切酶活性,能從切口的5端除去核苷酸。 由于在

8、切去核苷酸的同時又在切口的3端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。 最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。,隨機引物法,隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探針。產物平均長度為400-600個核苷酸。,（2）單鏈DNA,從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針 從RNA合成單鏈cDNA探針,（3）寡核苷酸探針 （4）末端標記DNA探針 （5）RNA探針,從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針,從RNA合成單鏈cDNA探針,所謂細菌轉化，是指一種細菌菌株由于捕

9、獲了來自另一種細菌菌株的DNA而導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。 提供轉化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉化DNA的細菌菌株則被稱為受體菌株。 處于能夠接受外源DNA狀態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞。,（三） 細菌轉化,步驟：,1.將快速生長中的大腸桿菌置于經低溫（0）預處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹（形成原生質球）。,2.與轉化混合物中的外源DNA形成粘附在細胞表面的復合物。 3.立即將該體系轉移到42下做短暫的熱刺激，復合物便會被細胞所吸收。 4.在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉化基因實現(xiàn)表達、細胞活性恢復 5. 涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉化子。,（四）基因擴增,聚合酶鏈式反應，即PCR

10、技術，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。,1、 基本原理 ：PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成。,模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93左右,一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；,模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；,引物的延伸：DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA互補的鏈。,第一

11、次PCR 循環(huán)的結果是產生兩個靶序列的復制。,2、PCR反應五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+,（1）PCR引物設計,一對引物，與3端互補 長度：1530個核苷酸 堿基分布隨機 引物內、引物間不應有互補序列 引物與非特異擴增區(qū)無同源性 3端必須互補 5端可游離 引物濃度一般為0.1 0.5mol/L,（2）DNA 聚合酶,在核苷酸底物的存在下，以一條DNA鏈為模板催化新鏈的合成 需要具有 3 -OH 的引物 具有 5 到3 方向聚合的能力 通常具有 3到 5 外切酶活性 Taq DNA聚合酶在7080具有最高聚合活性,(3)鎂離子濃度: Taq酶活性需要Mg2+ ，Mg2+濃度過高導

12、致非特異擴增，一般常用1.5mmol/L,(4)底物濃度:dNTP濃度在20200 mol/L，四種dNTP必須濃度相等,(5)PCR反應的緩沖溶液 : 提供合適的酸堿度和某些離子：1050mmol/L Tris-HCl緩沖液、50mmol/L KCl、明膠,PCR儀,（五） 核苷酸序列分析,1. Sanger雙脫氧鏈終止法(dideoxy-termination sequencing) 原理：雙脫氧（2，3）-核苷酸可以象2-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3 端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，故可根據不同長度的DNA片段測定

13、出核苷酸序列。,不能和下一個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接起來,添加 DNA polymerase 所有4 dNTPs 其中一種標記的ddNTP,在四個不同的反應管中各只包含一種ddNTP.,每一管中的復制的序列都停留在ddNTPs 處,5,反應終止后，四個反應管中的反應混合液分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離. 這四個反應管中延伸的寡核苷酸僅相差一個堿基. 電泳結構通過顯色指示.,3 C C T T T A G C T 5,過程：制備ss-DNA與引物退火分為4個反應系統(tǒng)每個系統(tǒng)中加入dNTP（其中dATP常帶同位素標記）和一種雙脫氧核苷酸DNA聚合酶定序反應反應產物變性后電泳凝膠干燥放射自顯影（該法

14、亦適合mRNA的序列分析） 。 GC富集區(qū)常出現(xiàn)“隱影”或“停止”現(xiàn)象，如在反應中加入dITP（脫氧三磷酸次黃嘌呤）或脫氧三磷酸-7-脫氧鳥苷可解決GC富集區(qū)的測序。,1）模板制備:可自動化 2）定序反應:可自動化 3）凝膠電泳:自動化有一定困難 4）核苷酸序列閱讀與計算機輸入:可自動化,2. DNA序列測定的自動化,1. 凝膠阻滯試驗:凝膠阻滯試驗（gel retardation assay），又叫作DNA遷移率變動試驗（DNA mobility shift assay），是用于體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。,（六）DNA與蛋白質相互作用研究,在凝膠電泳中，由于電場

15、的作用，裸露的DNA朝正電極移動的距離與其分子量的對數成反比。如果此時DNA分子與某種蛋白質相結合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內朝正電極移動的距離也就相應縮短了。,凝膠阻滯實驗的基本原理圖,放射自顯影,*,*,*,*,凝膠電泳,放射性標記的DNA,細胞蛋白質提取物,蛋白質與DNA結合,*,*,*,*,*,*,B,DNA-蛋白質結合物電泳遷移緩慢,滯后帶表明DNA與蛋白質結合,在DNaseI足跡試驗（DNA foot-printing assay）過程中，首先將待檢測的雙鏈DNA分子用32P作末端標記，并用限制性內切酶去掉其中的一個末端，得到只有一條

16、鏈的單個末端標記的雙鏈DNA分子，與細胞蛋白質提取物混合。 待二者結合之后，再加入少量的DNaseI（它可沿著靶DNA作隨機單鏈切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之達到平均每條DNA鏈只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂。,2. DNaseI足跡試驗,如果蛋白質提取物中不存在與DNA結合的特異蛋白質，經DNaseI消化之后便會產生出距放射性標記末端1個、2個、3個核苷酸等等一系列前后長度均僅相差一個核苷酸的連續(xù)的DNA片段梯度群體。 如果有一種蛋白質已經結合到DNA分子的某一特定區(qū)段上，那么，它就將保護這一區(qū)段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不可能產生出相應長度的切割條帶。在電泳凝膠的放射

17、自顯影圖片上，相應于蛋白質結合的部位是沒有放射標記條帶的，出現(xiàn)了一個空白的區(qū)域，人們形象地稱之為“足跡”。,32p,1 5 10,*,1 4 8 10,*,加入蛋白質X,加入DNaseI凝膠電泳放射自顯影,1,5,10,A B,足跡,(a),(c),(b),DNaseI 足跡實驗,作業(yè)：,1、凝膠電泳的原理是什么？有哪兩種，分辨范圍各是多少？凝膠的濃度和分辨率的關系是什么？ 2、什么是核酸分子雜交？幾種雜交方法的過程各是什么？ 3、探針的類型有哪些？敘述一種探針的制作過程。 4、什么是細菌轉化？其步驟如何？ 5、什么是基因體外擴增？步驟如何？ 6、Sanger雙脫氧鏈終止法的原理和過程各是什么

18、？,（七）實時熒光定量PCR,定義：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法 。,實時熒光定量PCR的幾種方法介紹：,1、SYBR Green I法：SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈的小溝部位結合的熒光染料。,基本過程是： 開始反應，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時發(fā)出熒光。 DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。 在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產物。 聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產物結合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。 因此，在一個體系內，

19、其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。,2、TaqMan探針技術,TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術，其核心是利用Taq酶的5 3外切核酸酶活性，切斷探針，產生熒光信號。由于探針與模板是特異性結合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數量。,在TaqMan探針法的定量PCR反應體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。 探針的5端標記有報告基團(Reporter, R) ，3端標記有熒光淬滅基團(Quencher, Q) 。 當探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中

20、遇到與模板結合的探針，其5 3外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號。 每經過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數。,通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析：,CT值定義為在基線上方產生可檢測到的統(tǒng)計學上顯著的熒光發(fā)射時所對應的PCR循環(huán)次數,確定未知樣品的 C(t)值后通過標準曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量,通過一系列酶作用，使總mRNA轉變成雙鏈cDNA并插入到適當的載體分子上，轉化大腸桿菌寄主菌株細胞，構成包含所有基因編碼序列的cDNA基因文庫。,（八） RNA

21、基本操作技術,1、總RNA的提取,Trizol試劑(苯酚-異硫氰酸胍）提取法： 液氮研磨材料，勻漿，加入Trizol試劑進一步破碎細胞并溶解細胞成分； 加入氯仿抽提、離心，分離水相和有機相，收集含有RNA的水相，通過異丙醇沉淀，獲得比較純的mRNA； 通過OD260和OD280測定RNA的純度和濃度，并用含有甲醛的凝膠電泳檢測RNA.,2、mRNA的純化,寡聚-纖維素柱色譜法； Promega公司的PolyAT Ttract mRNA 分離系統(tǒng),將用生物素標記的寡聚(dT)引物與細胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的m

22、RNA。,3、cDNA的合成,第一鏈的合成：以mRNA為模板，反轉錄成cDNA，由反轉錄酶催化，并由oligodT作引物。 OligodT引物由1220個dT構成，后面加上一個具有Xho等酶切位點的連接引物。,在cDNA 合成過程中，應選用活性較高的反轉錄酶及甲基化dCTP，保證新合成的cDNA鏈被甲基化修飾，以防止構建克隆時被限制性內切酶切割； cDNA兩端應加上不同內切酶所識別的接頭序列，保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。,第二鏈的合成：以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化，以RNaseH切割雜合鏈中的mRNA序列產生的小片斷為引物，由DNA連接酶連接成完整的DNA鏈。 同時加入另一個酶切位點

23、的黏性接頭（EcoR)，與cDNA連接后用Xho酶切。,4、cDNA文庫的構建：基因重組,5、基因文庫的篩選： 核酸雜交法 PCR篩選法 免疫篩選法,（九）SNP的理論與應用,單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。,通常所說的SNP都是二等位多態(tài)性的，這種變異可能是轉換（C T，在其互補鏈上則為G A），也可能是顛換（C A，G T，C G，A T），具有轉換型變異的SNP約占2/3； 轉換的幾率之所以高，可能是因為CpG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發(fā)生突變的位點，其

24、中大多數是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。,1、根據SNP在基因組中的分布位置可分為：,基因調控區(qū)SNP(pSNP)； 基因間隨機非編碼區(qū)SNP(rSNP)； 基因編碼區(qū)SNP(cSNP)。,基因編碼區(qū)SNP(cSNP)分為兩種：,一種是同義cSNP（synonymous cSNP），即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同； 另一種是非同義cSNP（non-synonymous cSNP），指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質的功能 。,2、SNP的特點:,密度高：SNP在人類基因組的平均密

25、度估計為3001000 bp,在整個基因組的分布達3 106 個, 遺傳距離為2-3cm,密度比微衛(wèi)星標記更高,可以在任何一個待研究基因的內部或附近提供一系列標記。 富有代表性：某些位于基因內部的SNP 有可能直接影響蛋白質結構或表達水平,因此它們可能代表疾病遺傳機理中的某些作用因素。,遺傳穩(wěn)定性：與微衛(wèi)星等重復序列多態(tài)性標記相比, SNP具有更高的遺傳穩(wěn)定性。 易實現(xiàn)分析的自動化：SNP 標記在人群中只有兩種等位型(allele), 故也稱為雙等位標記(biallelic marker)。這樣在檢測時只需一個 +/- 或 全/無 的方式, 而無須象檢測限制性片段長度多態(tài)性, 微衛(wèi)星那樣對片段

26、的長度作出測量, 這使得基于SNP 的檢測分析方法易實現(xiàn)自動化。,3、SNP的檢測分析技術,（1）基因芯片技術(gene chips) 基因芯片又稱DNA芯片(DNAchips )或生物芯片(biological chips)，是用標記的探針與特定的DNA 樣品雜交,然后通過檢測雜交信號的強弱判斷樣品中靶分子的數量。,基因芯片檢測技術的主要過程:,首先, 用生物素標記擴增后的靶序列或樣品, 然后再與芯片上大量的探針進行雜交; 其次, 用含鏈霉素的熒光素作為顯色物質, 圖像的分析則用激光共聚焦顯微鏡或其他熒光顯微鏡對片基掃描, 由計算機搜集熒光信號, 并對每個點的熒光強度數字化后進行分析。,（2

27、）Taqman技術,利用Taq酶的5 核酸外切酶活性, 切割與PCR 擴增產物結合的DNA 探針,此探針帶有一個供體-受體熒光染料對,兩者能發(fā)生熒光共振能量轉移(FRET )。Taq 酶切割使供體染料與淬滅的受體染料分離,結果使供體染料的熒光極大增強。,（3）分子信標技術,供體和受體熒光染料分別位于有互補序列的探針兩側,當未與靶序列雜交時, 探針形成一個發(fā)夾環(huán)結構,使供體- 受體染料對相互靠近而產生淬滅。反之,探針與正確的靶序列雜交時, 染料對分離,熒光信號可增強至900 倍。,（4）焦磷酸測序法,是一項全新的DNA測序技術，可以快速、準確地測定一段較短的目標片段。其基本原理如下： 第1步：一

28、個特異性的測序引物和單鏈DNA模板結合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)。,第2步：向反應體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA 聚合酶的作用下，添加到測序引物的3末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)。,第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結合形成ATP；在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產生可見光。通過CCD光學系統(tǒng)即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和

29、相匹配的堿基數成正比。,第4步：反應體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。,第5步：加入另一種dNTP，使第24步反應重復進行，根據獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。,（十）基因克隆技術,1、RACE技術：在已知cDNA序列的基礎上克隆5端或3端缺失序列的技術。 （1）獲得高質量總RNA； （2）去磷酸化作用； （3）去掉mRNA的5帽子結構，并以RNA連接酶連接上特異RNA寡聚接頭；,（4）以特異性寡聚dT為引物，在反轉錄酶的作用下合成第一條cDNA鏈； （5）分別以第一條cDNA鏈為模板進行RACE反應； （6）將純化后的PCR產物克隆到載體DNA

30、中，進行序列分析。,2、 克隆基因的分離,（1）應用核酸探針分離克隆目的基因 把基因文庫轉移到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，就可以與特異性的核酸探針進行菌落或噬菌斑雜交，以便篩選出具有目的基因的陽性克隆，這個過程叫作克隆基因的分離或篩選。 應用核酸探針分離目的基因的方法叫作核酸雜交篩選法。,（2） 應用cDNA差示分析法克隆基因,RDA法充分發(fā)揮了PCR以指數形式擴增雙鏈DNA模板的特性，通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴增了目的基因片段。因為試驗對象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差示分析前均經一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群（re

31、presentation），保證絕大部分遺傳信息能被擴增。,（3） 基因的圖位克隆法,首先，將目的基因定位到某個染色體的特定位點，并在其兩側確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標記。 其次，通過對許多不同的生態(tài)型及大量限制性內切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標記，通過染色體步移技術將位于這兩個標記之間的基因片段克隆并分離出來。 然后，根據基因功能互作原理鑒定目的基因。在RFLP作圖中，連鎖距離是根據重組率來計算的，1cm（厘摩）相當于1%的重組率。,（十一）基因敲除技術,基因敲除是自80年代末以來發(fā)展起來的一種新型分子生物學技術，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失

32、的技術。 通常意義上的基因敲除主要是應用DNA同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。,1、完全基因敲除,指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因的活性的基因敲除。 實驗室采用取代型或插入型載體在ES細胞中根據正負雙向選擇原理進行實驗：,正向選擇基因neo通常被插入到載體靶DNA功能最關鍵的外顯子中或通過同源重組法置換靶基因的功能區(qū)，其功能是： 形成靶位點的插入突變； 作為正向篩選標記。 負向選擇基因HSV-tk置于目的基因外側，含有該基因的重組細胞不能在選擇培養(yǎng)基上生長。,完全基因敲除動物模型的基本步驟：,基因載體的構建：把目的基因和與細胞內靶基因特異

33、片段同源的DNA 分子都重組到帶有標記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組載體。 ES細胞的獲得：現(xiàn)在基因敲除一般采用是鼠胚胎干細胞。常用的鼠的種系是1及其雜合體，因為這類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。,同源重組：將重組載體通過一定的方式(電穿孔法或顯微注射)導入同源的胚胎干細胞(ES cell)中，使外源DNA 與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA 序列整合到內源基因組中，從而得以表達。 選擇篩選已擊中的細胞：正負篩選法（PNS法），,表型研究：通過觀察嵌和體小鼠的生物學形狀的變化進而了解目的基因變化前后對小

34、鼠的生物學形狀的改變，達到研究目的基因的目的。 得到純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中，所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進行至少兩代遺傳。,2、條件性基因敲除法,將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。 是在常規(guī)的基因敲除的基礎上，利用重組酶Cre介導的位點特異性重組技術，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設置一個可調控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)。,利用Cre/LoxP 和來自酵母的FLPfrt 系統(tǒng)可以研究特定組織器官或特定細胞中靶基因滅活所導致的表型; 通過常規(guī)基因打靶在基因組的靶位點上裝上兩個同向排列的1oxP，并以此兩側裝接上loxP 的(“l(fā)oxP floxed”)ES 細胞產生“l(fā)oxP floxed”小鼠; 然后，通過將“l(fā)oxP floxed”小鼠與Cre轉基因鼠雜交產生靶基因發(fā)生特定方式(如特定的組織特異性)修飾的條件性突變小鼠;,在“l(fā)oxP floxed”小鼠，雖然靶基因的兩側已各裝上了一個loxP，但靶基因并沒有發(fā)生其他的變化，故“1oxP floxed”小鼠表型仍同野生型的一樣; 但當它與Cre 轉基因小鼠雜交時，產生的子代中將同