乙肝丙肝核酸檢測的新平臺(tái)(臨床).ppt

1、b,1,乙肝丙肝核酸檢測的新平臺(tái) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 全自動(dòng)熒光定量分子診斷系統(tǒng),顧 劍 羅氏分子診斷,b,2,自動(dòng)化程度,1992 1996 1998 2001 2003 2006,MWP,COBAS AMPLICOR,COBAS AMPLIPREP,COBAS AMPLICOR MONITOR,羅氏分子診斷,標(biāo)準(zhǔn)化 自動(dòng)化 重復(fù)性,COBAS TAQMAN 48,COBAS TAQMAN 96,一直以來，羅氏分子診斷對(duì)臨床核酸檢測市場提供完善可靠和創(chuàng)新性的產(chǎn)品及解決方案,b,3,目前乙肝和丙肝臨床治療過程中遇到的主要問題,治療終點(diǎn)無法準(zhǔn)確判定 有些病人

2、經(jīng)一段時(shí)間治療后DNA/RNA檢測結(jié)果忽陰忽陽，但臨床癥狀依然明顯 不能及時(shí)預(yù)測耐藥（病毒學(xué)突破） 核苷（酸）類似物治療后病毒DNA/RNA快速下降至檢測限以下，不久卻發(fā)現(xiàn)病毒出現(xiàn)反跳 療效的準(zhǔn)確監(jiān)測？ 治療后12或24周病毒DNA/RNA下降幅度直接決定預(yù)后,問題的根源在哪里？,b,4,內(nèi) 容,HBV核酸檢測的現(xiàn)狀與需要 HCV核酸檢測的現(xiàn)狀與需要 羅氏的CAP/CTM能帶來什么益處 總結(jié),b,5,HBV DNA監(jiān)測在抗病毒治療中的臨床應(yīng)用,HBV DNA是監(jiān)測抗病毒治療響應(yīng)和時(shí)間的關(guān)鍵標(biāo)志物 HBV 治療的路線圖理念，為HBV DNA監(jiān)測用于臨床實(shí)踐提供了指導(dǎo) 對(duì)用藥耐藥性的監(jiān)測（拉米夫定

3、YMDD，） 肝移植HBV復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的降低（術(shù)前，術(shù)后） ,b,6,HBV DNA監(jiān)測的臨床應(yīng)用 HBV治療路線圖,Keeffe E. Clin Gastro Hepatology 2007;5:890-897. 侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治療方案優(yōu)化，中國肝臟病雜志,b,7,國產(chǎn)試劑現(xiàn)狀,目前使用的國產(chǎn)試劑能解決的問題，不能解決的問題： HBV試劑盒說明：5005107 IU/mL 較可信的測試范圍：1045107 IU/mL 對(duì)部分發(fā)生HBV病毒突變的病人無法準(zhǔn)確檢測 注：1 IU/mL= 1 copy/mL,b,8,內(nèi) 容,HBV核酸檢測的現(xiàn)狀與需要 HCV核酸檢測的現(xiàn)狀與需要 羅氏的C

4、AP/CTM能帶來什么益處 總結(jié),b,9,HCV DNA監(jiān)測在抗病毒治療中的臨床應(yīng)用,HCV病毒感染是可治愈的疾病 HCV RNA檢測可以有效指導(dǎo)臨床用藥 治療的終點(diǎn)是核酸檢測為陰性（核酸檢測可以直接指導(dǎo)停藥時(shí)機(jī)）,b,10,慢性HCV治療方案,b,11,慢性HCV治療方案,用藥,12周早期病毒學(xué)反應(yīng),HCV RNA下降2log,繼續(xù)治療至48周,繼續(xù)治療至24周,考慮停藥,b,12,國產(chǎn)試劑現(xiàn)狀,目前使用的國產(chǎn)試劑能解決的問題，不能解決的問題： HCV試劑盒說明：5005107 IU/mL 較可信的測試范圍：1045107 IU/mL 注：1 IU/mL= 1 copy/mL,b,13,內(nèi)

5、容,HBV核酸檢測的現(xiàn)狀與需要 HCV核酸檢測的現(xiàn)狀與需要 羅氏的CAP/CTM能帶來什么益處 總結(jié),b,14,全世界第一臺(tái)用于體外診斷的全自動(dòng)熒光定量分子診斷系統(tǒng) 真正實(shí)現(xiàn) “樣品進(jìn)，結(jié)果出” 全球安裝超過 2,000臺(tái)，國內(nèi)安裝超過 40臺(tái),COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 系統(tǒng),COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan48系統(tǒng),COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96系統(tǒng)（帶連接系統(tǒng)）,COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96系統(tǒng) （無連接系統(tǒng)）,b,15,COBAS AmpliPrep儀器簡

6、介,全自動(dòng)系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)行核酸提取純化和PCR反應(yīng)體系配制 基于MGP磁珠分離技術(shù)，確保高質(zhì)量的核酸提取純化 最多72個(gè)樣品可以同時(shí)上機(jī)，運(yùn)行中可連續(xù)裝載上架，提高工作效率 包括耗材、樣品、試劑均可以連續(xù)上樣,b,16,DNA 或者 RNA,1.裂解、穩(wěn)定和去蛋白,2.核酸捕獲,病毒或細(xì)胞,3.沖洗,4.洗脫,37C孵育,COBAS AmpliPrep儀器 MGP 磁珠分離技術(shù),室溫,80C孵育,b,17,取SPU槍頭 樣本管/反應(yīng)管管蓋抓手 樣本初始體積感應(yīng)器 取試劑鋼針,CAP機(jī)械臂介紹,樣本管/反應(yīng)管結(jié)構(gòu),b,18,COBAS TaqMan/COBAS TaqMan 48分析儀簡介,檢測通

7、量可達(dá)4*24測試 獨(dú)立的24孔熱循環(huán)儀 TaqMan 48有2個(gè)模塊，TaqMan 96有4個(gè)模塊 最多可同時(shí)進(jìn)行4個(gè)不同的分析檢測 操作簡單，核酸擴(kuò)增和檢測全部自動(dòng)完成 實(shí)時(shí)定量PCR檢測技術(shù)，卓越的檢測性能，靈敏度高和特異性好，動(dòng)態(tài)范圍寬,b,19,HBV-DNA定量測試用于藥品FDA注冊試驗(yàn),INTRON A (Interferon alfa-2b) package insert. Schering-Plough Corp. Kenilworth, NJ 2. EPIVIR-HBV (Lamivudine) package insert GlaxoSmithKline, Researc

8、h Triangle park, NC 3. HEPSERA (Adefovir dipivoxil) package insert Gilead Sciences. Foster City, CA 4. Pegasys (Peginterferon alfa-2a) package insert. Hoffmann-La Roche Inc. Nutley, NJ 5. TYZEKA (Telbivudine) Package Insert. Novartis Pharmaceuticals Corp. E Hanover, NJ 6. Marcellin P et al. Hep DART

9、 2007 Meeting Abstract 63, Dec 9-13 2007, Lahaina, HI,b,20,國外發(fā)表的文獻(xiàn),Evaluation of initial virological response to adefovir and development of adefovir-resistant mutations in patients with chronic hepatitis B. Gallego et al., Journal of Viral Hepatitis, 2008, 15, 392398 Evaluation of an automated, hig

10、hly sensitive, real-time PCR-based assay (COBAS AmpliprepTM/COBAS TaqManTM) for quantification of HCV RNA. Christoph Sarrazina et al., Journal of Clinical Virology ,2008, 43, 162168 COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B Virus(HBV) Test: a Novel Automated Real-Time PCR Assay for Quantification of

11、HBV DNA in Plasma. Tiziano Allice et al., Journal of Clinical Microbiology, Mar. 2007, p. 828834 Evaluation of the COBAS AmpliPrep-total nucleic acid solation-COBAS TaqMan hepatitis B virus (HBV) quantitative test and comparison to the VERSANT HBV DNA 3.0 assay. Ronsin C et al., Journal of Clinical

12、Microbiology 2006 vol.44(no.4) Comparison of the COBAS TaqManTM HBV Test With the COBAS Amplicor MonitorTM Test for Measurement of Hepatitis B Virus DNA in Serum. Simon Siu-Man Sum et al., Journal of Medical Virology 2005, 77:486490 Hepatitis B virus (HBV) genotype determination by the COBAS AmpliPr

13、ep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 in serum and plasma matrices. Goedel S et al., Journal of Clinical Virology 2009 Jul;45(3):232-6 Comparison of Versant HBV DNA 3.0 and COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan assays for hepatitis B DNA quantitation : Possible clinical implications. GARBUGLIA A. R. et al., Journal

14、 of virological methods 2007, vol. 146, no1-2, pp. 274-280 Performance of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan Real-Time PCR Assay for Hepatitis B Virus DNA Quantification. Stephane Chevaliez et al., Journal of Clinical, May 2008, p. 17161723 ,b,21,HBV的定量檢測性能指標(biāo),注：國產(chǎn)試劑1 IU/mL= 1 copy/mL,b,22,HCV的定量檢測性能指標(biāo)

15、,b,23,定量原理 外標(biāo)法定量（國產(chǎn)試劑）,使用一組（4管）外部標(biāo)準(zhǔn)品定量，分別為5104到5107 IU/mL 未考慮各患者血液成分間的差異性對(duì)結(jié)果的影響,b,24,定量原理 內(nèi)標(biāo)定量Internal Quantitation Standard(CAP/CTM),內(nèi)標(biāo)是已知拷貝數(shù)的人工構(gòu)建核酸，加入每一反應(yīng)管，與靶核酸競爭擴(kuò)增，管內(nèi)定量 可提示反應(yīng)是否存在反應(yīng)抑制，避免假陰性結(jié)果 充分考慮管間反應(yīng)效率的差異，得到可靠精確的結(jié)果,b,25,COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系統(tǒng) 封閉樣品管輸入，封閉PCR管輸出 標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性,純化好 的核酸,主反應(yīng)液,PCR反應(yīng)體系的

16、配制,試劑、樣品和耗材的裝載上機(jī),樣品處理單元,K-槍頭,K-管,樣品,試劑,b,26,Branchburg生產(chǎn)廠房 羅氏投資超過1.5億美金，建成全球最大分子診斷試劑生產(chǎn)基地 目前每月生產(chǎn)14萬套試劑,b,27,羅氏分子診斷嚴(yán)格的生產(chǎn)和質(zhì)控體系 為整個(gè)行業(yè)設(shè)定了高標(biāo)準(zhǔn),1. 原料嚴(yán)格把關(guān),3. GMP生產(chǎn),2. 原料質(zhì)檢,4. GMP生產(chǎn),6. 成品質(zhì)檢,5. 試劑盒成品,7. 資料入檔,b,28,COBAS AmpliPrep /COBAS TaqMan 全自動(dòng)熒光定量分子診斷系統(tǒng)的應(yīng)用,抗病毒治療評(píng)估和監(jiān)測（HBV/HCV），為臨床醫(yī)生和病人提高更準(zhǔn)確的結(jié)果，指導(dǎo)用藥。可針對(duì)疑難病例、低病毒載量、長期用藥或高端病人 肝移植的術(shù)前術(shù)后監(jiān)控 全國藥物、診斷試劑臨床評(píng)估實(shí)驗(yàn)基地 CAP室間質(zhì)評(píng)時(shí)有與國際接軌的平臺(tái)，評(píng)價(jià)更科學(xué) 基礎(chǔ)研究的工具，文章可信度大大增加,b,29,國內(nèi)部分用戶,國內(nèi)用戶現(xiàn)已超過40家,b,30,國內(nèi)HBV核酸檢測實(shí)例,共檢測21份國產(chǎn)試劑HBV均為陰性的標(biāo)本 其中CAP/CTM HBV仍為陰性者共9份，