生物分離與純化技術17課件VIP

生物分離與純化技術目錄1、有機溶劑沉淀法簡介2、有機溶劑沉淀法的原理3、常用的有機溶劑4、影響因素及特點1有機溶劑沉淀法簡介1、定義：利用有機溶劑能降低蛋白質(zhì)等生物大分子在水溶液中的溶解度，而使之沉淀析出的方法。常用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖等生物物質(zhì)的純化。也用于中藥有效成分的提取。有機溶劑沉淀法簡介一2、特點：有機溶劑沉淀法簡介一缺點：①易使生物大分子變性，需低溫操作；②有機溶劑消耗大，成本較高；③有機溶劑易燃易爆，貯存麻煩。優(yōu)點：①分辨率高；②產(chǎn)品更純凈。2有機溶劑沉淀法的原理有機溶劑沉淀法的原理二1、蛋白質(zhì)穩(wěn)定的原因表面分布各種親水基團（溶解性好）蛋白質(zhì)表面帶有自由氨基和羧基

（斥力>引力）有機溶劑沉淀法的原理二1、蛋白質(zhì)穩(wěn)定的原因表面分布各種親水基團（溶解性好）蛋白質(zhì)表面帶有自由氨基和羧基

（斥力>引力）1、介電常數(shù)，溶質(zhì)之間的靜電引力增加。2、搶奪蛋白質(zhì)表面的水膜。導致脫水凝聚。2、沉淀機理二有機溶劑沉淀法的原理3常用的有機溶劑２、常用有機溶劑常用的有機溶劑三水甲醇、乙醇丙酮（介電常數(shù)）極性大極性小不溶于水正丁醇乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷苯四氯化碳石油醚甲醇、乙醇丙酮乙醇、丙酮、甲醇常用的有機溶劑三選擇有機溶劑的原則：①介電常數(shù)小，沉淀作用強②對生物大分子的變性作用小③毒性小，揮發(fā)性適中④一般需能與水無限混溶常用的有機溶劑：乙醇、丙酮、異丙酮和甲醇等乙醇——最常用常用的有機溶劑三沉淀作用強沸點適中無毒甲醇——不廣泛沉淀作用強對蛋白變性作用小口服劇毒丙酮沉淀能力更強沸點低、揮發(fā)性大對肝臟有毒著火點低4影響因素及特點（1）溫度——低溫防變性有機溶劑沉淀法的影響因素四有機溶劑需預冷(-20℃

～-10℃)注意攪拌保持散熱少量多次加入立即固液分離沉淀溶于緩沖溶液等采用方法（2）

pH值pH影響蛋白質(zhì)溶解度pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點附近（3）樣品濃度大，易共沉，分辨率低；小，效率低。一般常將蛋白質(zhì)初濃度控制在0.5～2％為宜。粘多糖則以1～2％較合。有機溶劑沉淀法的影響因素四（4）其它離子的影響例如：少量中性鹽存在可減少蛋白質(zhì)變性。鹽濃度需嚴格控制。一般在0.01～0.05mol/L為好。常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。有機溶劑沉淀法的特點四缺點：①有機溶劑沉淀法易使蛋白質(zhì)等生物大分子變性，操作需在低溫下進行；②需要耗用大量有機溶劑，成本較高；③有機溶劑一般易燃易爆，所以貯存比較困難或麻煩。優(yōu)點：①分辨能力比鹽析法高：可使目標產(chǎn)物在比較窄的有機溶劑濃度下沉淀。②產(chǎn)品更純凈：沉淀物與母液間的密度差較大，分離容易；有機溶劑沸點低，容易除去。1、有機溶劑冷卻至-20—-10℃;整個系統(tǒng)冷卻2、不斷攪拌，少量多次加入；3、低溫短時間處理后立即抽濾或離心，沉淀溶于緩沖溶液。4、有機溶劑加入量往往用原溶液體積的倍數(shù)來計量。有機溶劑沉淀法的工藝流程四有機溶劑沉淀法的工藝流程四1、概念：利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解性最低的特性，向含有目的藥物成分的混合液中加入酸或堿，調(diào)整其pH值，使蛋白質(zhì)沉淀析出的方法。只適用于水化程度不大、在等電點時溶解度很低的兩性生化物質(zhì)，如酪蛋白。子任務2：等電點沉淀法

2、蛋白質(zhì)等電點沉淀法的影響因素a.不同的蛋白質(zhì)，具有不同的等電點。大多蛋白質(zhì)的等電點都在酸性范圍內(nèi)。b.同一種蛋白質(zhì)在不同條件下，等電點不同。c.目的藥物成分對Ph值的要求。避免加入強酸強堿，容易引起目的藥物有效蛋白的變性；避免引入新的離子，酸堿應于原鹽溶液中的離子相同。子任務2：等電點沉淀法

概念：蛋白質(zhì)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則的結構，并失去原有的生理活性，這個過程稱為蛋白質(zhì)的變性。變性蛋白質(zhì)在水中溶解度變小并從溶液中析出的方法稱為變性沉淀法。原理：破壞雜質(zhì)，保存目的物。利用蛋白質(zhì)等生物大分子對某些物理或化學因素敏感性不同，而有選擇地使之變性沉淀，以達到分離純化的目的。子任務3：選擇性變性沉淀法：

最常用的方法：1、加熱法：如檸檬酸發(fā)酵液，加熱至80℃，雜蛋白會變性凝固而除去。

注意：熱處理的方法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的藥物成分。比如說對熱敏感的藥物青霉素等就不能用這種方法來處理。要嚴格控制加熱的溫度和時間。子任務3：變性沉淀法

2、加入化學試劑法：常用的加鹽、加有機酸、加酚等。如核酸抽提的過程中我們所用的除去蛋白的方法就是加入有機溶劑氯仿，蛋白質(zhì)就會成為絮狀沉淀除去。3、調(diào)pH值法：溶液的酸堿性發(fā)生劇烈變化時，會引起蛋白質(zhì)的變性而沉淀。如用2.5%的三氯乙酸處理胰蛋白酶、抑肽酶等，均可除去大量雜蛋白，而對所提取的酶活性沒有影響。子任務3：變性沉淀法

定義：在有機聚合物的作用下，蛋白質(zhì)沉淀的現(xiàn)象稱為有機聚合物沉淀法。常用的有機多聚物：不同分子量的聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮和葡聚糖等，應用較多的是相對分子質(zhì)量6000～20000的PEG。聚乙二醇的親水性強，溶于許多水和許多有機溶劑，對熱穩(wěn)定，有較廣范圍的分子量。子任務4：有機聚合物沉淀法

子任務4：有機聚合物沉淀法

優(yōu)點：缺點：所得的沉淀中含有大量的PEG。吸附法、乙醇沉淀法、鹽析法等①操作條件溫和，室溫即可；②沉淀效率高；③沉淀的顆粒往往比較大，產(chǎn)物比較容易收集。操作方法：1、兩種聚合物形成液-液兩相，蛋白質(zhì)在兩相中的分配比例不同；2、有機聚合物與無機鹽形成兩相，蛋白質(zhì)在兩相中的分配比例不同；子任務4：有