DB34-T2071-2014-雜交玉米及親本真實性鑒定DNA分析方法-安徽省VIP

ICS67.060B22DB34安徽省地方標準DB34/T2071—2014雜交玉米及親本真實性鑒定DNA分析方法IdentificationofgenuinenessofhybridcornanditsparentsusingDNAanalysismethod安徽省質量技術監(jiān)督局發(fā)布DB34/T2071—2014前言本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由安徽省質量技術監(jiān)督局提出，安徽省農(nóng)業(yè)標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所。本標準主要起草人：陸徐忠、楊劍波、倪金龍、劉勛輝、李莉、汪秀峰、馬卉、張小娟。IDB34/T2071—2014雜交玉米及親本真實性鑒定DNA分析方法1范圍本標準規(guī)定了雜交玉米及親本品種真實性鑒定SSR分子標記法的術語和定義、原理、試劑與溶液、主要儀器、操作步驟和結果判定。本標準適用于玉米單交種和自交系的品種真實性鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程發(fā)芽試驗GB4404.1糧食作物種子第1部分:禾谷類GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。品種真實性varietalgenuineness供檢品種與文件記錄(如標簽等)是否相符。本標準中指品種間在DNA分子標記帶型上的一致性。4原理根據(jù)SSR序列兩端保守的單拷貝序列設計特異引物，利用PCR技術擴增每個位點的重復次數(shù)，通過電泳分析其長度多態(tài)性，進行雜交玉米及親本的真實性鑒定。5試劑與溶液1DB34/T2071—20145.3異丙醇5.4剝離硅烷5.5四甲基乙二胺（TEMED）5.6TaqDNA聚合酶5.7PCR反應緩沖液（10×Buffer）5.825mmol/L氯化鎂溶液（MgCl2）5.9DNA分析儀專用丙烯酰胺膠液5.10DNA分析儀專用分子量內標5.11DNA分析儀專用電泳緩沖液5.121mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（Tris-Hcl）：稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用鹽酸（HCl）調pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min，4℃儲存。5.1310mol/L氫氧化鈉溶液（NaOH）：在160mL水中加入80.0g氫氧化鈉（NaOH），溶解后，冷卻至室溫，再加水定容到200mL。5.140.1mol/L氫氧化鈉溶液：2g固體氫氧化鈉溶于450mL水中，加水定容至500mL。5.150.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（EDTA-Na2）（pH8.0）：稱取187.6g乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2）加入800mL水中，再加入適量氫氧化鈉溶液，加熱至完全溶解后，冷卻至室溫，用氫氧化鈉溶液調pH值至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min，4℃儲存。5.16十六烷基三甲基溴化銨提取液（CTAB）：81.7g氯化鈉和20g十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）溶于800mL水中，然后加入1mol/LTris-HCl100mL，0.5mol/LEDTA-Na240mL，定容至1000mL，4℃貯存。5.17TE緩沖液1：1mol/l三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液5mL，0.5mol/lEDTA-Na21mL，加HCl調pH至2.0，加水定容至500mL。5.18TE緩沖液2：1mol/l三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液5mL，0.5mol/lEDTA-Na21mL，加HCl調pH至8.0，加水定容至500mL。5.19氯仿+異戊醇混合液：體積比為24+1。5.2070％乙醇：量取70mL無水乙醇，加水定容至100mL。5.21SSR引物工作液：SSR標記序列信息參見附錄A。用一級水分別配制終濃度均為20μmol/L的上、下游引物工作液。5.22dNTPs混合溶液：濃度為2.5mmol/L的dNTPs混合溶液。5.235×Tris/硼酸電泳緩沖液（5×TBE）：分別稱取50g三羥甲基氨基甲烷、27.5g硼酸溶于500mL水中，加入10mL0.5mol/LEDTA-Na2溶液，定容至1000mL,4℃儲存。5.24加樣緩沖液：在98mL去離子甲酰胺中加入250mg溴酚藍（BromophenolBlue）、250mg二甲苯氰（XyleneCyanoleFF）、2mL0.5mol/LEDTA-Na2，溶解混勻，常溫保存。5.25親和硅烷工作液：在1mL無水乙醇中加入5μl親和硅烷原液，混勻。5.266％變性聚丙烯酰胺溶液：稱取57g丙烯酰胺、3g甲叉雙丙烯酰胺、420g尿素溶于200mL水中，加入200mL/L5×TBE，室溫充分溶解后，定容至1000mL，4℃儲存。丙烯酰胺具神經(jīng)毒性，配制時應注意防護。5.2710％過硫酸銨溶液：稱取10g過硫酸銨溶于100mL水中，4℃儲存。5.281％硫代硫酸鈉：稱取1g硫代硫酸鈉，溶于100mL水中，室溫儲存。5.29固定液：在89.5mL水中加入10mL水無水乙醇，0.5mL冰醋酸，根據(jù)膠板數(shù)量調整固定液的量，現(xiàn)用現(xiàn)配。5.30染色液：在100mL水中加入0.2g硝酸銀（AgNO3），根據(jù)膠板數(shù)量調整染色液的量，現(xiàn)用現(xiàn)配。2DB34/T2071—20145.31顯影液：在100mL水中加入1.5gNaOH和0.4mL甲醛(37％)，現(xiàn)用現(xiàn)配。6主要儀器6.1PCR擴增儀。6.2臺式高速冷凍離心機：最大離心力≥10,000g，溫控范圍最-10℃～40℃。6.3電泳檢測系統(tǒng)：垂直電泳系統(tǒng)、毛細管電泳系統(tǒng)。6.4單道微量移液器：2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。6.5多道微量移液器：8道或12道，10μL、100μL、300μL。6.6酸度計：精度±0.01pH。6.7電子天平：可讀性為百分之一、萬分之一。6.8膠片觀察燈。6.9脫色搖床。7操作步驟7.1試樣制備以受檢樣品所標注品種的標準樣品作為對照，同時檢測受檢樣品和標準樣品。受檢樣品和標準樣品可為棉花的種子、幼嫩葉片等。樣品純度應符合GB4404.1的規(guī)定，種子扦樣按GB/T3543.2規(guī)定執(zhí)行，種子發(fā)芽按GB/T3543.4規(guī)定執(zhí)行（幼苗長度達3cm左右用于制備PCR模板）。分別從受檢樣品和標準樣品中隨機抽取5粒種子或單株，根據(jù)實際情況從以下兩種方法中選擇任一方法制備模板DNA。幼苗或幼嫩葉片，每株取1.5cm長，剪碎；干種子直接剝取胚。將樣品按單株分別放入96孔板中，每孔加入100μL氫氧化鈉提取液及1μLβ-巰基乙醇，沸水加熱5min，然后每孔再分別加入100μLTE緩沖液1，直接取2μL作為模板進行PCR擴增。取幼苗或幼嫩葉片約200～300mg，置于2.0mL離心管，加液氮充分研磨，或取種子充分磨碎，移入2.0mL離心管；每管加入700μL65℃預熱的CTAB提取液后，充分混合，65℃保溫60min，期間多次顛倒混勻；每管加入等體積的三氯甲烷+異戊醇混合液，充分混合后，靜置10min；12,000rpm離心15min后，吸取上清液至一新離心管，再加入等體積預冷的異丙醇，顛倒離心管數(shù)次，在-20℃放置30min；4℃，12,000rpm離心10min，棄上清；加入70％乙醇，旋轉離心管數(shù)次，棄去乙醇；將離心管倒立于墊有濾紙的試驗臺上，室溫干燥沉淀6h以上；加入100μL超純水或TE緩沖液2，充分溶解后備用。3DB34/T2071—20147.3.1PCR擴增反應體系在PCR反應管中按表1依次加入反應試劑，混勻。表1PCR擴增反應體系反應組分10×緩沖液MgCl2原濃度終濃度1×推薦反應體積（20L）10×25mmol/L2.5mmol/L每種5.0U/L20mol/L每種－*2.02.02.5mmol/L0.15mmol/L每種1.0UdNTPs1.2Tag酶0.2引物0.25mol/L每種－*0.252.0PCR模板一級水－*－*12.35注：“*”表示體積不確定。如果PCR緩沖液中含有氯化鎂，則不加氯化鎂溶液；根據(jù)Taq酶的濃度確定其體積，并相應調整水的體積，使反應體系總體積達到20.0μL。7.3.2PCR擴增反應程序94℃預變性5min；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，循環(huán)35次后；72℃延伸10min，4℃保存。7.4PCR產(chǎn)物的電泳檢測PCR產(chǎn)物采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（見附錄B）或毛細管電泳結合熒光（見附錄C)檢測。7.5.1將受檢樣品的DNA電泳譜帶與標準對照的DNA電泳譜帶比較，根據(jù)各單株譜帶的一致性，鑒定受檢樣品與標簽名稱是否相符。7.5.2先利用20對基本核心引物對受檢樣品和標準對照進行SSR位點分析，比較兩者的相同位點和差異位點。7.5.3受檢樣品或標準樣品在不同單株間的個別標記位點上存在不一致時，重新提取至少20個單株的DNA，并用該引物重新擴增。統(tǒng)計各單株的譜帶類型及各類型所占比例，然后計算受檢樣品和標準樣品中具相同帶型的個體所占比例，若在該位點具有相同帶型的個體比例達到20％以上，則記為疑似相同位點；反之，則記為疑似差異位點(見附錄D)。8結果判定按7.5的方法分別統(tǒng)計受檢樣品和標準樣品在20對核心標記上表現(xiàn)出的相同位點數(shù)、疑似相同位點數(shù)、疑似差異位點數(shù)和差異位點數(shù)，若20個SSR位點中：——疑似差異位點數(shù)與差異位點數(shù)之和≥2，判定為不同品種?！伤撇町愇稽c數(shù)與差異位點數(shù)之和≤1，繼續(xù)用20對擴展核心引物進行檢測。若累計40個SSR位點中：——疑似差異位點數(shù)與差異位點數(shù)之和≥2，判定為不同品種?！伤撇町愇稽c數(shù)與差異位點數(shù)之和≤1，判定為近似或極近似品種。4DB34/T2071—2014AA附錄A（規(guī)范性附錄）SSR核心引物表A.1核心引物正向引物序列（5’—3’）編號P01引物名稱phi056染色體位置(Bin)反向引物序列（5’—3’）ACTTGCTTGCCTGCCGTTAC短臂(1.01)長臂(1.09)CGCACACCACTTCCCAGAATGTTGCTCGGTCACCATACCP02phi011GCACACACACAGGACGACAGTGGGACAAAAGAAGAAGCAGAGP03P04P05bnlg125umc1551umc2105短臂(2.02)長臂(2.09)短臂(3.00)GAAATGGGACAGAGACAGACAATCACCGGAACACCTTCTTACAGTTTCGAAACCTTCTCGTGATGAGCACATACATAGGCTCCCTTTTTCCGTCCCGTGACACTCTCTTTCTCTCTCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGACAACCCAACGTACTCCGGCAGP06P07phi053phi072長臂(3.05)短臂(4.01)ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTTGACAGCGCGCAAATGGATTGAACTGTCTGCTGCTAGTGGTGGTGATCTCACGTACGGTAATGCAGACACATGACCTGATAAACCCTCCTCTCAGCAGAACGGCAAGGGCTACTGCAACTAGAAGTAGATGGCTTGTTATGGCAACAACAAGTGGCTGGCTAGGGTGAATATATCCGTGCATTTACGTTTCACCCGATGCAACTTGCGTAGATCGTCACGTTCCACGACATCACATCGCGACGAGTTAATTCAAACATTACGATGTCTTCAGTGTGACACCA5DB34/T2071—2014表A.1（續(xù)）正向引物序列（5’—3’）反向引物序列（5’—3’）AGGGACAAATACGTGGAGACACAGCGATCTGCACAAAGTGGAGTAGTCCTGCTGATGTCTGGAAGAACCCTAGCATCATGCCAGCAGGTTTTCGTGCTACTACTGCTACAAAGCGAGTCGTTCGTGTCTTCCGAAACTGATGCAATAAAGGTTGCCGT編號引物名稱染色體位置(Bin)P18P19phi065長臂(9.03)umc1380短臂(10.00)P20P21P22P23P24P25P26P27P28P29P20P31P32P33P34P35P36umc1196bnlg1007phi308707phi96100bnlg1520umc2101bnlg197phi074長臂(10.07)短臂(1.02)長臂(1.10)短臂(2.00)長臂(2.09)短臂(3.00)長臂(3.06)短臂(4.04)長臂(4.06)短臂(5.03)長臂(5.09)短臂(6.00)長臂(6.04)短臂(7.01)長臂(7.04)短臂(8.00)長臂(8.05)ATGTGCTGTGCCTGCCTCGCAACAAGATCCAGCCGATGTCGCCCTCATATGACCTTCAGGAGGACCCCAACTCCTGTTGCACGAGCCATCGTATTCCTCTTGCTCTCCATGTCCACAGCTGCGTAGCTTCTTCCCCCGGCTAGAGCTATAAAGCAAGTCTAGCTAGTTTGGTGCGTGGTGATGCGAGAAGAAAGCGAGCAGACGCCAAGAAGAAACACATCACACCCAATTGCAACAACAATCCTTGGCAGTGGCTCAGTGATGGCAGAAACTCCTCTCGATGTTCTGAAGCCCACAACACATCCAGTGACCAGAGTCAGCATCTATAGCTTGCTTGCATTTGGGTTTTGTTTGTTTGTTTGTTGTCCTGCTTATTGCTTTCGTCATGAGCTTGCATATTTCTTGTGGACAGCAACAGGTTACATGAGCTGACGACCAGCGTGCTGTTCCAGTAGTTTGCCCTGCAGGTTCACATTGAGTAGGAGTACGCTTGGATGCTCTTCCGTCCGACATCTTGCTTTTCTATCTTTTACTTCTCAGCGGTAGATCGGCCAATTCACCAATCATGCAA6DB34/T2071—2014表A.1（續(xù)）正向引物序列（5’—3’）編號P37P38P39P40引物名稱bnlg244umc1277phi062染色體位置(Bin)反向引物序列（5’—3’）GATGCTACTACTGGTCTAGTCCAGACTCCTCCACTCATCAGCCTTGATTTGAGAACGGAAGCAAGTACTCCACCAACCAACCACTCCCTTTTTAGCCAACCCGCTAGGCTACTTCAAATGCCATGCGTTCGCTCTGTATCAGCAGGAGTACCCATGAAAGTCCTATCACAGCACGAAGCGATAGATG短臂(9.02)長臂(9.08)著絲點(10.04)長臂(10.06)umc1061注1：P01-P20為基本核心引物；注2：P21-P40為擴展核心引物。7DB34/T2071—2014BB附錄B（規(guī)范性附錄）6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳B.1電泳樣品準備在PCR產(chǎn)物中加入等體積加樣緩沖液，充分混勻后在95℃變性5min，4℃冷卻10min以上。B.2凝膠制備玻璃板處理：取清洗干凈的長短玻璃板，用去離子水沖洗干凈后晾干，用無水乙醇分別擦洗兩遍，晾干；在長板涂0.5mL親和硅烷工作液，短板（帶凹槽）涂0.5mL剝離硅烷工作液。操作過程中防止兩塊玻璃板互相污染。玻璃板組裝：待玻璃板徹底干燥后使用0.4mm均厚的墊片組裝凝膠膠膜夾層，注意墊片與玻璃板的邊、底壓緊對齊。灌膠：在60mL6％PAGE膠中加入40μLTEMED和400μL10％的過硫酸銨溶液，混勻后立即灌膠。待膠充滿整個凝膠夾層，輕輕的插入梳子，梳齒朝外，使其聚合至少1h以上。灌膠過程中防止出現(xiàn)氣泡。B.3預電泳待膠凝固后，將玻璃板安裝到電泳槽上，在正極槽和負極槽中分別加入1×TBE緩沖液，使凝膠夾用移液器吹吸加樣槽，清除氣泡和雜質，將梳齒朝內插入梳子形成加樣孔。每孔加樣5μL，80WB.6銀染準備四個染色盤，分別加入適量的固定液、染色液、ddH2O和顯影液，溶液的量可根據(jù)膠板數(shù)量和8DB34/T2071—2014B.6.2染色將膠板移入染色液，搖動染色5min。B.6.3漂洗將膠板移入ddH2O中搖動45s，棄去ddH2O；再加入含0.02％體積1％硫代硫酸鈉的ddH2O搖動1min。B.6.4顯影將膠板移入顯影液搖動至顯出清晰的條帶。B.6.5定影將膠板移入固定液定影5min。B.6.6記錄用數(shù)碼相機照相或在膠片觀察燈上直接記錄結果。9DB34/T2071—2014CC附錄C（資料性附錄）毛細管電泳熒光檢測C.1樣品制備等體積混合不同熒光標記擴增產(chǎn)物，混勻后從混合液中吸取1L加入到DNA分析儀專用96孔板孔中。板中各孔分別加入0.1L分子量內標和8.9L去離子甲酰胺。將樣品在PCR儀上95℃變性5min，取出，立即置于碎冰上，冷卻10min以上。瞬時離心10s后按儀器操作說明置放到DNA分析儀上。C.2開機準備打開DNA分析儀，檢查儀器工作狀態(tài)。更換緩沖液，灌膠。將裝有樣品的微孔板置放于