DB62T 4094-2020 草品種真實性檢驗規(guī)程 SSR 標(biāo)記法

2020-04-01實施2020-04-01實施甘肅省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14原理 15試驗樣品 26儀器設(shè)備及試劑 27溶液配制 28引物信息 29操作程序 210數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計 411結(jié)果判定方法 4附錄A(規(guī)范性附錄)主要儀器設(shè)備及試劑 5附錄B(規(guī)范性附錄)溶液配制 7附錄C(規(guī)范性附錄)引物信息 9附錄D(資料性附錄)參照品種信息 附錄E(規(guī)范性附錄)凝膠配制 附錄F(資料性附錄)SSR標(biāo)記電泳圖譜 附錄G(規(guī)范性附錄)數(shù)據(jù)統(tǒng)計記錄表 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由甘肅省林業(yè)和草原局提出并負(fù)責(zé)監(jiān)督實施。本標(biāo)準(zhǔn)由甘肅省草業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部牧草與草坪草種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(蘭州),全國畜牧總站，甘肅省草原技術(shù)推廣總站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉文獻(xiàn)，謝文剛，閔學(xué)陽，齊曉，邵麟惠，陳志宏，向金城。及結(jié)果判定方法。及結(jié)果判定方法。2規(guī)范性引用文件3術(shù)語和定義參照品種ranevariety基因組中由1～6個核苷酸為基本單位組成的多次簡單串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記。SSR廣泛分布于植物基因組的不同位置，且因不同品種間單個SSR位點重復(fù)單位數(shù)量的不同而存在多態(tài)性，是一種應(yīng)用廣泛的DNA分子標(biāo)記。這種多態(tài)性序列兩側(cè)的序列高度保守且為單拷貝，可根據(jù)其序列設(shè)計一對特異引物，通過PCR擴(kuò)增檢測不同樣品DNA間的特異片段。因此，根據(jù)比較送檢樣品與比對樣品的特異片段可對紫花苜蓿、雜花苜蓿及箭苦豌豆品種進(jìn)行鑒定。工25試驗樣品送檢樣品種子數(shù)至少2000粒且發(fā)芽率不低于80%。隨機選取200粒～300粒送檢樣品種子，按照GB/T2930.4規(guī)定的紙上發(fā)芽床方法進(jìn)行萌發(fā)。種子萌發(fā)10天后，等量采取40個苜蓿單株或10個箭笞豌豆單株葉組織進(jìn)行混合(1.0g～2.0g)。當(dāng)送檢樣品為生長在大田的葉片組織時，可由捍樣員到田間取樣。取樣的地塊由委托檢驗的單位、組織或個人指定，采用棋盤式取樣法，等量采10個箭笞豌豆單株葉組織進(jìn)行混合(1.0g～2.0g),保存于硅膠干燥器或液氮中。每個品種采取2份混7溶液配制9操作程序9.1DNA提取勻，65℃水浴10min,期間顛倒混勻2～3次；冷卻至室溫，加1風(fēng)櫥內(nèi)加入600μL24:1氯仿-異戊醇(V:V),顛倒混勻，12000r/min,室溫離心10m離心10min,棄上清液；加入500μL75%乙醇，將沉淀彈起，離心2min,倒出乙醇；接著12000r/min溶解混勻。用Nanodrop分光光度計測定DNA濃度和質(zhì)量(OD260/OD280≈1.8),吸取部分原液稀釋成50ng/μL的工作液，4℃保存。參照品種(附錄D)的取樣與DNA提取與送檢樣品同樣方法處理。3PCR反應(yīng)體系為10μL,在PTC-200熱循環(huán)儀上進(jìn)行：模板DNA1μL(50ng/μL),PCRMix5μL,Tap酶0.1μL,正反向引物各1μL(10μmol/L),其余用ddH?O補足至終體積。如果PCR過程中不采用熱蓋9.2.2反應(yīng)程序94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,56℃或57℃退火30s,72℃延伸45s,30～35個循環(huán)數(shù)；72℃延伸7min;4℃保存。每對引物重復(fù)2次PCR反應(yīng)。9.3.1清洗玻璃板兩塊玻璃板互相污染。上部輕輕插入梳子，室溫聚合1h以上。膠聚合后，清理膠板表面溢出的膠液，輕輕拔出梳子，用水清洗干凈備用。入2μL～4μL樣品。除待樣品外，同時加人參照品種擴(kuò)增產(chǎn)物。在200x恒壓下電泳，電泳1.5h~2.5h(電泳時間取決于擴(kuò)增片段的大小范圍)。電泳結(jié)束后，小必分開兩塊玻璃板，從玻璃板上取下凝膠準(zhǔn)備銀染。9.3.6銀染銀染的操作過程具體如下：a)固定：將凝膠置于固定液中，附著凝膠面朝上，使固定液沒過凝膠，在搖床上輕輕晃動20min~b)漂洗：取出凝膠，在蒸餾水中漂洗1次～2次；c)染色：將凝膠置于染色液中，使染色液沒過凝膠，在搖床上輕輕晃動10min～15min;d)漂洗：取出凝膠，在蒸餾水中漂洗1次，不超過10s;e)顯影：將凝膠置于顯影液中，使顯影液沒過凝膠，輕輕晃動至出現(xiàn)清晰帶紋；f)定影：將凝膠置于固定液中，使固定液沒過凝膠，定影5min;g)漂洗：取出凝膠，在去離子水中漂洗1min。4以1,0形式代表同一分子量大小條帶的有無，記錄送檢樣品和比對樣品在所有位點的DNA電泳譜11結(jié)果判定方法首先根據(jù)附錄C中前半數(shù)引物的擴(kuò)增結(jié)果，品種相似度S按照(1)進(jìn)行計算。S相似度，%;N?——品種中出現(xiàn)的電泳條帶數(shù)目；N;——品種中出現(xiàn)的電泳條帶數(shù)目；5(規(guī)范性附錄)主要儀器設(shè)備及試劑A.1.2PCR擴(kuò)增儀(96孔)。A.1.4垂直電泳槽及西配牧配件。A.1.8膠片觀察竹。A.1.15照相機A.2.2三羧甲基氨暴甲蛛(Tris)。A.2.14N’-N’甲叉雙丙烯酰胺(Bis)。A.2.15丙烯酰胺(Acr)。6A.2.18親和硅烷。A.2.19剝離硅烷。A.2.20無水乙醇。A.2.21四甲基乙二胺(TEMED)。A.2.22過硫酸銨((NH?)?S?O?)。A.2.23冰醋酸。A.2.24硝酸銀。A.2.27PCR-Mix(天庚)。A.2.30去離子水。A.2.31聚丙烯酰胺膠液。A.2.32DNA分析用分子量標(biāo)記。7溶液配制B.1.9氯仿-異戊醇(24:1)氯仿(CHCl?)和異戊醇(C?H??O)按24:1的比例(體積比)配制混合液。8B.2PCR擴(kuò)增引物的配制B.3變性聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制用蒸餾水定容至1000mL,高壓滅菌。量取500mL10×TBE緩沖液，用去離子水定容至5000mL。稱取190.00g丙烯酰胺(C?H?NO)和10.00g甲叉雙丙烯酰胺((H?C=CHCONH)?CH?),溶于400mL稱取420.00g尿素(CO(NH?)2)溶于水中，加入100mL10×TBE緩沖液和150mL40%丙烯酰胺溶液，過濾后加水定容至1000mL(黑暗，低溫，玻璃瓶保存)。稱取10.00g過硫酸銨((NH?)?S?O?取98mL去離子甲酰胺(CH?NO),加入2mL0.5mol/L的EDTA溶液、0.25g溴酚蘭(C?3H??Br?O?S)和0.25g二甲苯青(C??H27N?O?S?Na),B.4銀染溶液的配制B.4.1固定液量取100mL冰醋酸(C?H?O?),加入1000mL去離子水。B.4.2染色液稱取2.00g硝酸銀(AgNO?),溶于1000mL去離子水中。稱取15.00g氫氧化鈉(NaOH),溶于1000mL的蒸餾水中。使用之前加入4mL的甲醛(CH?O)。9(規(guī)范性附錄)引物信息苜蓿和箭笞豌豆引物相關(guān)信息分別見表C.1和C.2。表c1苜蓿引物信息表引物正向引物序列(5'-3')反向引物序列(5'-3')度/℃12345678ATTTGGTACCCATCACACC9ACGGCAGGAACAGATCCTTAGAGAAGAAAGCTTfTTAGATAATGTATGGAGAGGATGAGCAACCAGATTACCTTCATCAT引物正向引物序列(5'-3')反向引物序列(5'-3')度/℃表C.2箭苦豌豆引物信息表正向引物序列(5'-3')反向引物序列(5'-3')度/℃123456789AACAAAGAAAGGTCCATTTT正向引物序列(5'-3')反向引物序列(5'-3')度/℃S(資料性附錄)參照品種信息苜蓿和箭苦豌豆參照品種分別見表D.1和D.2。表D.1苜蓿參照品種信息品種名拉丁名1育成品種2育成品種3育成品種4育成品種5公農(nóng)1號苜蓿育成品種6公農(nóng)2號苜蓿育成品種7公農(nóng)3號苜蓿吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院育成品種8中苜1號苜蓿中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所育成品種9中苜2號苜蓿中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所育成品種中蘭1號苜蓿中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所育成品種中牧1號育成品種地方品種育成品種龍牧808紫花苜蓿育成品種圖牧1號苜蓿育成品種隴東苜蓿地方品種天水苜蓿地方品種無棣苜蓿中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所育成品種中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所育成品種東苜1號苜蓿東北師范大學(xué)育成品種品種名拉丁名1育成品種2育成品種3育成品種4蘇箭5號育成品種5蘇箭4號育成品種6蘇箭3號(淮陰)育成品種7蘇箭3號(寧)育成品種8育成品種9育成品種中牧324經(jīng)國畜牧意站畜禽牧草種質(zhì)資源庫栽培品種(規(guī)范性附錄)凝膠配制表E.1非變性聚丙烯酰胺凝膠配制表(資料性附錄)SSR標(biāo)記電泳圖譜苜蓿品種電泳圖譜。DB62/T4094—2020箭苦豌豆品種電泳圖譜。VsTFSSR-15VsTFSSR-17VsTFSSR-22VsTFSSR-28