第6章 基因組課件

第六章基因組基因組：生物細(xì)胞中單套染色體的所含DNA序列的全部組成。人類基因組：22條常染色體和X，Y染色體的DNA組成。

第6章基因組基因組大小

種類Mb大腸桿菌4.64啤酒酵母12.1線蟲100果蠅140蝗蟲5000小鼠3300豌豆4800玉米5000小麥17000人3000

第6章基因組C值悖論生物體單倍體DNA總量稱為C值。高等生物具有比低等生物更復(fù)雜的生命活動(dòng)，所以，理論上應(yīng)該是它們的C值也應(yīng)該更高。但是事實(shí)上C值沒有體現(xiàn)出與物種進(jìn)化程度相關(guān)的趨勢。高等生物的C值不一定就意味著它的C值高于比它低等的生物。這種生物學(xué)上的DNA總量的比較和矛盾，稱為C值悖論。第6章基因組分類最小基因組支原體0.58X106細(xì)菌2.8X106酵母3.0X107霉菌5.5X107蠕蟲1.1X108昆蟲0.5X109鳥類0.2X1010兩棲類0.1X1010哺乳類2.8X1010

第6章基因組

進(jìn)化地位高，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物的同類生物最小基因組比較，符合進(jìn)化程度越高，生物基因組越大的規(guī)律。

第6章基因組DNA序列的分類基因序列和非基因序列基因序列：以起始密碼子開始，終止密碼子結(jié)束的一段DNA序列，稱為開放閱讀框（openreadingframe,ORF）非基因序列：基因序列以外的DNA序列。編碼序列和非編碼序編碼序列：編碼RNA和蛋白質(zhì)的DNA序列。非編碼序：內(nèi)含子和基因的間隔序列。第6章基因組單一序列和重復(fù)序列單一序列：基因組中只有一份的DNA序列。重復(fù)序列：基因組中重復(fù)出現(xiàn)的序列。例如，STR，SNP，微衛(wèi)星DNA等。第6章基因組模式生物

在某一類生物中選取一種或幾種生物作為代表進(jìn)行重點(diǎn)研究,以了解這一類生物的共性和特征常用模式生物:線蟲,果蠅,斑馬魚,小鼠,擬南芥,煙草,水稻,第6章基因組

什么是基因？基因在哪里？第6章基因組尋找基因的思路：基因定位基因克隆基因分離將基因定位于染色體上有大到小，由粗到細(xì)，精細(xì)定位克隆目的基因片段第6章基因組功能克隆克?。ㄖ虏。┗虻囊环N策略。收集所要克隆的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物及其功能的信息，用以分離基因，并對(duì)基因進(jìn)行定位。性狀（疾?。┑鞍踪|(zhì)產(chǎn)物（生物學(xué)功能）從氨基酸序列出發(fā)設(shè)計(jì)DNA引物，從文庫調(diào)取基因得到基因序列染色體定位疾病功能基因第6章基因組

分析異?；虻漠a(chǎn)物（蛋白質(zhì)）：純化蛋白質(zhì)，弄清它是如何引起臨床癥狀的有兩條不同的路線：1.進(jìn)行氨基酸序列測定，據(jù)此推測可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探針，然后用探針從cDNA文庫或基因組文庫中篩選對(duì)應(yīng)的編碼基因；將異常蛋白質(zhì)制成相應(yīng)的抗體，從cDNA表達(dá)文庫中篩選相應(yīng)克隆。得到克隆后，就可以通過DNA序列分析確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷。

絕大部分分子病、遺傳性代謝缺陷（酶）病如白化?。╝lbinism）、苯丙酮尿癥（phenylkeonuria，PKU）和鐮刀形細(xì)胞貧血病（sickle-celldisease）等，都是采取的這一策略。第6章基因組血紅蛋白病——鐮刀形細(xì)胞貧血癥正常HbA四條多肽鏈（2條鏈，兩條鏈）第6章基因組

定位克隆又稱為“逆向遺傳學(xué)”，始于20世紀(jì)80年代后期利用遺傳連鎖或細(xì)胞學(xué)定位技術(shù)將致病基因定位于染色體的特定區(qū)帶。定位：通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記在染色體上的位置?？寺。簭亩ㄎ坏娜旧w區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的基因，并進(jìn)一步研究其功能。疾病遺傳標(biāo)記，染色體定位基因序列mRNAcDNA蛋白質(zhì)產(chǎn)物生物學(xué)功能

疾病

基因功能第6章基因組定位克?。和ㄟ^遺傳標(biāo)記，先獲得某一表型基因在染色體上的定位，再在候選區(qū)域內(nèi)選擇已知基因，進(jìn)行致病突變的篩選，并獲得cDNA及全基因。

基本思路是通過連鎖分析原理進(jìn)行基因定位。

若多態(tài)標(biāo)記與待定基因距離較遠(yuǎn)，則它們?cè)谙蜃哟鷤鬟f時(shí)會(huì)發(fā)生自由分離，呈“連鎖平衡”；反之，則不發(fā)生自由分離，而呈現(xiàn)“共分離”現(xiàn)象，即“連鎖不平衡”。據(jù)此可在染色體上定位與某一DNA標(biāo)記相連鎖的基因。第6章基因組將基因定位于染色體特定區(qū)段2.候選基因篩選鑒定第6章基因組

定位克隆的主要目的之一是將目標(biāo)基因定位于特定染色體上。

主要方法：家系調(diào)查法體細(xì)胞雜交法核酸雜交技術(shù)等等第6章基因組

A-1型短指（趾）癥法拉比（Farabee）1903年在他的哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士畢業(yè)論文中首先報(bào)道了，即世界上第一例孟德爾常染色體顯性遺傳病，以后作為遺傳學(xué)的經(jīng)典例子被全世界的生物學(xué)和遺傳學(xué)教材廣泛引用。第6章基因組

賀林實(shí)驗(yàn)室利用布依族、苗族和漢族的三個(gè)A-1型短指（趾）癥大家系，對(duì)該病的致病基因進(jìn)行了精確定位（位點(diǎn)定在2q35-36區(qū)）、克隆，并首次發(fā)現(xiàn)了人IHH基因和該基因上的三個(gè)突變位點(diǎn)是導(dǎo)致A-1型短指（趾）癥的直接原因。第6章基因組第6章基因組用遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因定位

形態(tài)標(biāo)記

morphologicalmarkers

細(xì)胞標(biāo)記

cytologicalmarkers

生化標(biāo)記

biochemicalmarkers

分子標(biāo)記

molecularmarkers第6章基因組分子遺傳標(biāo)記

在核酸分子水平，對(duì)具有相對(duì)差異的等位基因DNA多態(tài)性的標(biāo)記，廣泛存在于高等生物編碼區(qū)和非編碼區(qū)，又稱為DNA分子標(biāo)記，是DNA水平上遺傳變異的直接反映。第6章基因組特點(diǎn):

1.直接以DNA形式表現(xiàn)，在生物體各發(fā)育階段,各組織均可檢測到。

2.數(shù)量多，遍及整個(gè)基因組。

3.多態(tài)性高，自然界存在許多等位突變，無需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料

4.中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然連鎖

5.許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性（codominance）,能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息

第6章基因組分子遺傳標(biāo)記發(fā)展

RFLP

restrictfragmentlengthpolymorphism

限制性片段長度多態(tài)性

SSLP

simplesequencelengthpolymorphism

簡單序列長度多態(tài)性

SNP

singlenucleotidepolymorphism

單核苷酸多態(tài)性

第6章基因組第6章基因組SSLP

simplesequencelengthpolymorphism

簡單序列長度多態(tài)性，又稱為VNTR

variablenumbertandemrepeat

數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性

指重復(fù)單位相對(duì)較小,由重復(fù)單位的序列差異和數(shù)目變化,可形成豐富的多態(tài)性。

包括:

小衛(wèi)星序列

minisatellite

微衛(wèi)星序列

microsatellite

,第6章基因組小衛(wèi)星DNA標(biāo)記

minisatellite，核心序列為11－60bp，主要存在于染色體靠近端粒處，由于其拷貝數(shù)變化，在不同個(gè)體間中存在串聯(lián)數(shù)目的差異，若在重復(fù)序列兩側(cè)有限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，則切下來的片段會(huì)呈現(xiàn)出多態(tài)性?？捎糜贒NA指紋，DNAFinger。

第6章基因組第6章基因組微衛(wèi)星DNA標(biāo)記microsatellite，指以2－7個(gè)堿基為核心單位串聯(lián)重復(fù)而成的一類序列（微衛(wèi)星DNAmicrosatelliteDNA，又稱為STRshorttandemrepeat短串聯(lián)重復(fù)序列）,由于核心序列重復(fù)數(shù)目的變化而在群體中呈現(xiàn)出遺傳多態(tài)性，但在同一家系內(nèi)具有高度的遺傳保守性，以孟德爾方式遺傳。散布于整個(gè)基因組中。第6章基因組SNPsinglenucleotidepolymorphism

單核苷酸多態(tài)性，是指在基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同堿基，其中最少一種在群體中的頻率不小于1％。SNP分為兩種形式：基因編碼區(qū)的SNP，稱為cSNP

遍布于基因組內(nèi)的大量單堿基變異第6章基因組SNP分析的特點(diǎn)：（1）SNP數(shù)量大，分步密集，平均每1000bp就有一個(gè)SNP（2）SNP比STR擴(kuò)增更有效，不會(huì)產(chǎn)生假帶（3）由于SNP是二態(tài)的，易于自動(dòng)化批量檢測，易于用計(jì)算機(jī)分析結(jié)果第6章基因組SNP與RFLP和STR等DNA標(biāo)記的主要不同在于：

不再以“長度”的差異作為檢測手段而是直接以序列的差異作為標(biāo)記。但SNP單個(gè)基因座的多態(tài)性很差，只有二態(tài)，為此采用多個(gè)SNP基因座進(jìn)行“單倍型”分析十分重要。第6章基因組SNP是繼人類基因組計(jì)劃之后又一國際研究競爭新熱點(diǎn)，該項(xiàng)目研究是闡明基因組功能及特點(diǎn)的重要基礎(chǔ)。SNP是人類基因組DNA序列變異的主要形式，是決定人類疾病的重要遺傳基礎(chǔ)。第6章基因組其他遺傳標(biāo)記舉例AFLP

amplifiedfragmentlengthpolymorphism

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性RAPDrandomamplifiedpolymorphismDNA

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性SSCP

singlestrandconformationpolymorphism

單鏈構(gòu)象多態(tài)性第6章基因組AFLPamplifiedfragmentlengthpolymorphism

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性

通過DNAPCR擴(kuò)增基因組DNA的模板，隨后用電泳將擴(kuò)增片段分離，通過DNA譜帶鑒別多態(tài)性。RAPDrandomamplifiedpolymorphismDNA

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性

用于擴(kuò)增多態(tài)性DNA的引物是隨機(jī)的。在做多態(tài)性分析時(shí)，用一組引物（20－

40個(gè)）在基因組全序列上掃描可獲得基因組多態(tài)性的豐富信息。第6章基因組

SSCPsinglestrandconformationpolymorphism

單鏈構(gòu)象多態(tài)性

是基于PCR擴(kuò)增而新發(fā)展起來的DNA多態(tài)性分析，利用PCR特異的擴(kuò)增出基因組的目的DNA片段，變性后形成的單鏈DNA在自然條件下能形成一定的空間構(gòu)象，并且這種空間構(gòu)象由DNA鏈的堿基序列決定，若堿基發(fā)生變化，將在電泳圖譜上表現(xiàn)出不同生物個(gè)體的特異性，即多態(tài)性。第6章基因組

用原位雜交insituhybridazation和熒光原位雜交fluorescenceinsituhybridazation,FISH進(jìn)行基因定位：

將DNA探針用同位素或熒光染料標(biāo)記，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與固定在玻片上的中期染色體雜交后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)不同顏色的熒光。

FISH是一項(xiàng)十分靈敏的技術(shù)，可以檢測出非整倍體，基因擴(kuò)增，微小的染色體重排或易位等染色體變異第6章基因組原位雜交基因定位第6章基因組多色FISHM-FISH技術(shù)熒光原位雜交第6章基因組FISH在腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)染色體變異方面的研究應(yīng)用：比較基因組雜交技術(shù)comparativegenomichybridization，CGH

利用同一種生物異常細(xì)胞的基因組做探針，與正常細(xì)胞基因組雜交，通過對(duì)雜交信號(hào)分析，發(fā)現(xiàn)不同，尋找相關(guān)基因。第6章基因組利用染色體步移確定基因位置第6章基因組定位候選克隆該方法是定位克隆的進(jìn)一步發(fā)展將疾病相關(guān)基因定位于染色體相關(guān)區(qū)域該染色體區(qū)域得到若干候選基因進(jìn)一步分析得到目的cDNA蛋白質(zhì)功能研究疾病染色體定位若干候選基因確定目的基因蛋白質(zhì)功能第6章基因組

ｃＤＮＡ篩選染色體定位只是定位克隆的第一步。由于ｃＤＮＡ篩選、確認(rèn)的困難，使其成為定位克隆策略的“瓶頸”。目前獲得基因序列的方法大致有:(1)對(duì)<500ｋｂ的關(guān)鍵部位進(jìn)行直接測序；(2)比較基因組作圖和測序；(3)基因結(jié)構(gòu)特征分析；(4)ｃＤＮＡ捕獲，主要有ＣｐＧ島捕捉層析法、外顯子捕捉法、直接篩選ＰＣＲ法等方法第6章基因組差異表達(dá)

原理:比較不同個(gè)體或不同細(xì)胞來源，即通常所指的樣本(tester，Ｔ)和參照(driver，Ｄ)的蛋白質(zhì)或ｍRNA兩者之間的差異，如缺失或特異表達(dá)部分，從而發(fā)現(xiàn)新基因第6章基因組

1.差異性表達(dá)mRNA方法

（1）mRNA差異顯示（mRNA-DifferentialDisplay，mRNA-DD）（2）抑制性消減雜交（SuppressionSubtractiveHybridization，SSH）（3）cDNA代表性差異分析（cDNARepresentationalDifferenceAnalysis，cDNA-RDA）（4）cDNAmicroarray

2.差異性表達(dá)蛋白質(zhì)第6章基因組消減雜交（subtractivehybrization）

利用目的基因在兩種組織或細(xì)胞中表達(dá)的差異，或者在不同發(fā)育階段、不同狀態(tài)下表達(dá)差異，通過其mRNA或單鏈cDNA進(jìn)行雜交，除去兩者之間相同的基因成分，使表達(dá)有差異的基因得到充分富集。它的實(shí)質(zhì)是對(duì)兩組基因轉(zhuǎn)錄本全面比較，去同存異，分離差異表達(dá)基因第6章基因組Subtractivecloning第6章基因組

cDNA-RDA技術(shù)cDNA-RDA（cDNA-RepresentativeDifferenceAnalysis）技術(shù)是1994年Huband和Schatz在RDA和mRNA-DD二者基礎(chǔ)上建立的一種基因克隆新方法

在代表性差異分析基礎(chǔ)上，以mRNA表達(dá)水平的差異為差減目標(biāo)，因而兼有RDA和mRNA-DD的優(yōu)點(diǎn),這一方法克服了mRNA-DD假陽性率高的缺點(diǎn)，排除與表型無關(guān)的基因，通過消減雜交驅(qū)逐同源序列，降低了后期鑒定的工作量，但操作煩瑣。特點(diǎn)：第6章基因組

腫瘤組織Driver正常組織TesterAAAAAAmRNAdscDNAMboI酶切連接接頭PCR擴(kuò)增無接頭換新接頭雜交無擴(kuò)增線性擴(kuò)增指數(shù)擴(kuò)增cDNA-RDA方法簡要示意圖第6章基因組

因?yàn)橥环NmRNA經(jīng)不同的剪接或翻譯后修飾加工可產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，因此一個(gè)蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)量超過相應(yīng)基因組的基因數(shù)目。蛋白質(zhì)組研究常用方法：二維凝膠電泳技術(shù)，蛋白質(zhì)序列分析，質(zhì)譜分析等等。差異性表達(dá)蛋白質(zhì)第6章基因組生物信息學(xué)方法通過序列的ORF預(yù)測建立cDNA文庫差減雜交得到均質(zhì)化文庫cDNA序列測定生物信息學(xué)分析，ORF預(yù)測同源性比較，功能預(yù)測第6章基因組生物信息學(xué)（bioinformatics）是生物學(xué)，計(jì)算機(jī)科學(xué)，以及應(yīng)用數(shù)學(xué)等學(xué)科相互交叉而形成的一門新興學(xué)科。以計(jì)算機(jī)為主要工具，開發(fā)各種軟件，對(duì)日益增長的DNA和蛋白質(zhì)的序列和