生物酶檢測(cè)技術(shù)通則 編制說(shuō)明

3本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)國(guó)標(biāo)委公布的2024年第一批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃項(xiàng)目（國(guó)標(biāo)委綜合[2024]16本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC387）提出并歸口。國(guó)酶學(xué)及酶制品等產(chǎn)業(yè)起步晚，當(dāng)前國(guó)內(nèi)生物酶處于性化檢測(cè)涉及的生物酶品種多且性能要求高，因而大部分標(biāo)準(zhǔn)，因此阻礙了生物酶的發(fā)展，急需建立生物酶檢測(cè)檢測(cè)技術(shù)通則的問(wèn)題，也可以解決核心原料檢驗(yàn)技術(shù)受術(shù)通則工作將有利于提高生物酶及相關(guān)生物醫(yī)藥、洗滌（1）2022年6月至2022年10月，標(biāo)準(zhǔn)起草單位組織相關(guān)技術(shù)人員對(duì)通則》標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目進(jìn)行了預(yù)研，課題組成員廣泛收集了國(guó)（2）2022年11月至2023年4月相關(guān)技術(shù)人員撰寫了《生物酶質(zhì)量評(píng)全體專家一致通過(guò)，同意牛剛?cè)螌＜医M組長(zhǎng)。標(biāo)4術(shù)路線說(shuō)明、主要技術(shù)指標(biāo)的確定等。專家工作組討論稿進(jìn)行了討論和質(zhì)詢，同時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)可能存物酶的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了生物酶的質(zhì)量評(píng)價(jià)致性、保質(zhì)期、文件要求）評(píng)價(jià)方法，評(píng)價(jià)內(nèi)容等。作組還需按審查委員會(huì)提出的意見建議對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修改14.3“活（性）力”統(tǒng)一參數(shù)統(tǒng)一為“活力”，工業(yè)上稱為“活力”24.3“85%~115%”不合理在貨架期內(nèi)，應(yīng)不低于標(biāo)示值。酶活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)或降低。34.4“90%~110%”沒(méi)有科學(xué)依據(jù)“生物酶的純度應(yīng)不低于標(biāo)示值”。產(chǎn)品的純度應(yīng)有個(gè)確定值。44.8“85%”不科學(xué)去掉“85%”。保質(zhì)期內(nèi)實(shí)測(cè)酶活力不應(yīng)低于標(biāo)示值。5/工作要做深入選取代表性試劑，開展相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)工作。6/無(wú)安全性指標(biāo)增加安全性指標(biāo)（5）2024年4月收到全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)[2024]5號(hào)文件關(guān)于下達(dá)2024年準(zhǔn)委關(guān)于下達(dá)2024年第一批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知》立項(xiàng)文件，計(jì)劃編號(hào)：點(diǎn)在檢測(cè)技術(shù)上，對(duì)應(yīng)之前版本的質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)，建檢測(cè)技術(shù)，酶活力檢測(cè)技術(shù)主要有光譜法、電化學(xué)方技術(shù)和其他方法（等離子共振法、偶聯(lián)測(cè)定法等光譜法主要分為吸光光度法、熒光光5毛細(xì)管電泳雜質(zhì)檢測(cè)主要有化學(xué)法、光譜法、色譜法等；安全性檢測(cè)中的重金屬檢測(cè)主要有原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦和等離子體發(fā)射光譜測(cè)主要有高效液相色譜法、質(zhì)譜法、免疫法等；微生物檢測(cè)參考食品微生物針對(duì)生物酶重要檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，如活力、純度等，選取代表性生物酶如激酶等進(jìn)行驗(yàn)證。技術(shù)通則》標(biāo)準(zhǔn)的起草工作，與會(huì)專家就《生物酶術(shù)通則》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修改和完善。完成了《生物酶國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提交了《生物酶檢測(cè)技術(shù)通則》檢驗(yàn)規(guī)則等）及其確定依據(jù)（包括試驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)修訂國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)時(shí)2）本標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格遵循現(xiàn)行相關(guān)法律法規(guī)和其他標(biāo)準(zhǔn)，確保在各個(gè)層面上與現(xiàn)有規(guī)范協(xié)3）在標(biāo)準(zhǔn)的編制過(guò)程中，嚴(yán)格按照GB/T1.1-2020等系列標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)編排、編寫格式和內(nèi)容表達(dá)方法等進(jìn)行統(tǒng)一2、確定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容（如技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、6質(zhì)量指標(biāo)以及檢測(cè)方法，因此生物酶質(zhì)量評(píng)價(jià)通則的質(zhì)量指標(biāo)，主要有外觀、酶活力、比活力、質(zhì)期等，因此綜合以上指標(biāo)確定生物酶的質(zhì)量評(píng)價(jià)雜質(zhì)、安全性、批內(nèi)、批間差異、保質(zhì)期，后面標(biāo)類型標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)名稱發(fā)布日期實(shí)施日期國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T36755-2018BSTDNA聚合酶2018-09-172019-04-01國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T36757-2018M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶2018-09-172019-04-01國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T36389-2018T4DNA連接酶2018-06-072019-01-01國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T36390-2018工具酶溶菌酶2018-06-072019-01-01國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T35542-2017TaqDNA聚合酶2017-12-292018-07-01國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T35540-2017限制性凝血酶2017-12-292018-07-01國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T35543-2017核糖核酸酶A2017-12-292018-07-01國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T35539-2017限制性核酸內(nèi)切酶BamHI2017-12-292018-07-01國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T35541-2017pfuDNA聚合酶2017-12-292018-07-01國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T34793-2017蛋白酶K2017-11-012018-05-011酶的活力和比活力光譜法（吸光光度法、熒光光譜法、濁度測(cè)定類型標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)名稱檢測(cè)技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T36756-2018工具酶活性測(cè)定通用要求/國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T41906-2022超氧化物歧化酶活力檢測(cè)方法-分光光度法分光光度法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T41712-2022脫氧核糖核酸酶Ⅰ酶活及雜質(zhì)檢測(cè)方法分光光度法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5521-2008糧油檢驗(yàn)谷物及其制品中α-淀粉酶活性的測(cè)定分光光度法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T41907-2022腸激酶活性檢測(cè)方法分光光度法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T34776-2017T4DNA接酶酶活及雜質(zhì)檢測(cè)方法瓊脂糖電泳國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T34222-2017核糖核酸酶活力檢測(cè)方法分光光度法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T34801-2017脫氧核糖核酸酶活力檢測(cè)方法分光光度法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T33410-2016生化試劑中蛋白酶K活性檢測(cè)方法分光光度法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T34800-2017蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法分光光度法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T30990-2014溶菌酶活性檢測(cè)方法分光光度法7國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T32131-2015辣根過(guò)氧化物酶活性檢測(cè)方法比色法分光光度法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T33409-2016β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)方法分光光度法分光光度法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T34795-2017谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性檢測(cè)方法分光光度法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T34799-2017幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)方法分光光度法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY-3799-2020生乳及其制品中堿性磷酸酶活性的測(cè)定發(fā)光發(fā)光法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T8622-2006飼料用大豆制品中尿素酶活性的測(cè)定電化學(xué)方法1.1反應(yīng)條件的選擇要點(diǎn)反應(yīng)條件對(duì)酶活力測(cè)定結(jié)果影響很大，反應(yīng)條1.1.1底物類型和濃度（2）對(duì)于專一性不強(qiáng)可使用多種底物的酶，所選用的底物必須有足夠的特異性，通常選底物濃度的確定：米氏常數(shù)(Km值)是用mol/L表示，對(duì)于單底物酶促反應(yīng)，應(yīng)選擇底物濃度為Km的（10~20）倍。雙底物酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的程度一般要求為1.1.2反應(yīng)溫度對(duì)多數(shù)酶，其酶活最適宜溫度在（37~40）℃,但有些生物機(jī)體相當(dāng)?shù)偷臏囟认鹿ぷ鳌６鄶?shù)哺乳動(dòng)物來(lái)源的酶，1.1.3反應(yīng)pH值會(huì)降低酶活性。主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：①改變底物和底物的結(jié)合；②過(guò)高或過(guò)低的pH都會(huì)影響酶的穩(wěn)定性，進(jìn)而配制同一pH的緩沖液常常可使用多種化學(xué)試劑，此時(shí)不僅要考慮試劑的pKa值，以保證有足夠的緩沖能力，還要考慮試劑本身是否具有抑制或根據(jù)酶在不同pH條件下的活性繪制曲線，1.1.4反應(yīng)時(shí)間在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，最終產(chǎn)物的生成量是與酶活件確定的情況下，可以通過(guò)試驗(yàn)得到反應(yīng)時(shí)間和產(chǎn)物濃1.1.5緩沖液和離子強(qiáng)度在方法設(shè)計(jì)時(shí)，選完緩沖物后，還必須了解不言，隨緩沖液濃度增加，電解質(zhì)干擾酶和底物結(jié)合，濃度時(shí)，常需在濃度較高以保持足夠緩沖能力和濃度對(duì)于生物緩沖液，如三羥甲基氨基甲烷、三乙將pH調(diào)到要求范圍。不控制溫度，不用pH計(jì)盲目進(jìn)行配1.1.6其他因素輔助因子是與酶蛋白疏松結(jié)合的小分子量的輔基多為金屬離子，如K+、Na+、Ca），9值得注意的是，很少量的激活劑或抑制劑就和抑制劑不是絕對(duì)的，有些物質(zhì)在低濃度時(shí)為某種酶抑制劑。例如，氯化鈉達(dá)到三分之一飽和度時(shí)就可值得注意的是，酶活性的發(fā)揮與介質(zhì)有關(guān)，經(jīng)常測(cè)定結(jié)果并不會(huì)成正比例地改變，可能與激活劑、等因素有關(guān)。因此，樣品與反應(yīng)液總量的比例一當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)，測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)進(jìn)行的情況。該方法變化，已成為酶活力測(cè)定中一種重要地方法之一。幾1.2紫外-可見分光光度法可見光部分的光吸收度的不同，選擇一適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)，測(cè)方法可以連續(xù)地讀出反應(yīng)過(guò)程中光吸收的變化，已成為酶活力測(cè)定中一種重要得方法之一。表3可見現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中酶活性的檢測(cè)方法幾乎都用的此方法，該方法特別適用于含有不飽和鍵，尤其是含有共軛體系的化合物的分析和測(cè)定手段，幾乎所有的氧化還原酶都可以采用此法進(jìn)行光光度法。如蛋白酶類（木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性/堿性/酸性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶）、溶菌酶、a-淀粉酶（中溫、耐高溫）、纖維素酶、果膠酶、乳糖酶、谷氨酰蔗糖酶，血清中肌酸激酶、乳酸脫氫酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶的參考測(cè)量方法中，均采用紫外-可見分光光度法，紫外-可見吸光光度設(shè)備價(jià)格相對(duì)低廉，成本較低，操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用范圍廣泛，可檢測(cè)到nmol·L-1水平的變化；該方法的1.3熒光分光光度法有高靈敏度和高專一性的優(yōu)點(diǎn)，如可用來(lái)測(cè)定端1.4色譜技術(shù)底物或產(chǎn)物可以通過(guò)其物理性質(zhì)的不同進(jìn)行分離鑒），分離色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法、氣相色譜法等，這些相色譜法因其高效、快速、高靈敏度等特點(diǎn)在酶活1.5質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)用于生物酶活性的檢測(cè)，是對(duì)游離酶質(zhì)譜對(duì)產(chǎn)物或底物進(jìn)行測(cè)定，是常用的質(zhì)譜檢測(cè)生以是有機(jī)物，也可以是無(wú)機(jī)物，被分析的樣品形態(tài)可敏度、高通量和高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，樣品用量少，能夠1.6其他技術(shù)2生物酶的純度生物酶的純度，是從生物酶樣品中確定目標(biāo)類型標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)名稱檢測(cè)技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T40174-2021工具酶純度的檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T34223-2017核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶純度檢測(cè)方法2.1.1光譜掃描法一種純度的生物酶溶液在一定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描就會(huì)得到一個(gè)特征吸收光譜，可以根據(jù)掃描光譜的吸收曲線的形狀，吸收峰的位用紫外吸收光譜測(cè)定生物酶的純度，既方便2.1.2光吸收比值法一種純物質(zhì)在紫外光區(qū)有其最大吸收峰，如核酸的最大吸收峰在260nm，蛋白類生物酶的最大吸收峰在280nm，同一溶液在這兩種波長(zhǎng)下測(cè)得的光吸收值是不同的，利用在280nm和260nm處測(cè)得的光吸收值之比，即可得到蛋白類生物酶的純度，如純核酸的標(biāo)準(zhǔn)特點(diǎn)：僅限于蛋白類生物酶溶液中含有核酸或核2.2.1保留值法在一定的層析條件下各種生物酶組分在層析柱內(nèi)的如：排阻層析根據(jù)生物酶不同的分子量可得到不同2.2.2基準(zhǔn)物標(biāo)定法2.2.3層析的模式層析分析鑒定法的方法很多，但根據(jù)層析的分離機(jī)制來(lái)分2.2.4幾種層析方法的比較表5常見的層析方法電泳鑒定生物酶純度的方法有：凈電荷電泳（PAGE）、SDS-電泳（SDS）、等電聚焦電泳（IEF）、雙向電泳（2D-PA），表6常見的電泳方法3生物酶的雜質(zhì)類型標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)名稱檢測(cè)技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T34776-2017T4DNA接酶酶活及雜質(zhì)檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T34800-2017蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法分光光度法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T41712-2022脫氧核糖核酸酶Ⅰ酶活及雜質(zhì)檢測(cè)方法分光光度法生物酶的雜質(zhì)主要有工藝相關(guān)的雜質(zhì)和產(chǎn)品響生物酶純度的主要因素，如果生物酶中含有生物酶中雜質(zhì)的分析技術(shù)包括化學(xué)法、光譜降解產(chǎn)物的特性采用不同的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于生物酶中法主要為高效液相色譜法、氣相色譜法和毛酸酶和/或RNase殘留等雜質(zhì)，通常采用酶與核酸底物孵育，瓊脂糖凝膠電泳的方式檢通過(guò)檢測(cè)核酸底物的降解情況，判斷核酸酶的殘留情測(cè)宿主細(xì)胞核酸(HCD)和宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留。宿主細(xì)胞核酸檢測(cè)可采用DNA探針雜交法、熒光染色法或定量PCR法；宿主細(xì)胞蛋白可采用酶聯(lián)免疫吸附法、質(zhì)譜分析法、4批內(nèi)、批間差異檢測(cè)批內(nèi)差異檢測(cè)是相同測(cè)量程序、相同操作者、相同點(diǎn)，在短時(shí)間段內(nèi)對(duì)一批內(nèi)樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)量，至少進(jìn)同測(cè)量程序、相同操作者、相同測(cè)量系統(tǒng)、相同操作條件和相同地點(diǎn)，3個(gè)不同批號(hào)的生物酶制品，每個(gè)批號(hào)重復(fù)測(cè)量3次，計(jì)算均值，同時(shí)按以下公式計(jì)算相對(duì)極差，則為生物1N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽234RO水調(diào)零，使用磷酸鹽緩沖液或底物原液調(diào)節(jié)溶液吸于0.585應(yīng)逐步添加約0.5mL～1mL磷酸鹽緩沖液以確保在吸光度范圍內(nèi)，配表9主要測(cè)定儀器(分光光度計(jì))和主要輔助儀器列表名稱要求電子天平精度0.00001紫外-可見分光光度計(jì)恒溫水浴pH計(jì)移液器200uL、1000uL、5mL點(diǎn)式溫度計(jì)表10胰蛋白酶活性測(cè)定條件參數(shù)指標(biāo)溫度25℃±0.1℃波長(zhǎng)光徑10.00mm±0.1mm測(cè)定時(shí)間讀數(shù)(測(cè)定點(diǎn))②將底物工作液和酶溶液在25℃±0.5℃平衡。③取光程為1cm的帶蓋石英比色皿，用5mL移液器加入底物溶液（恒溫于25.0℃±0.5℃)3.0mL放入分光光度計(jì)比色池，用點(diǎn)式溫度計(jì)測(cè)量比色皿內(nèi)溫度，待溫度恒定至25.0℃±0.1℃時(shí)，用200μL移液器加入0.001mol/L鹽酸溶液200μL，攪拌混勻，作為空即計(jì)時(shí)，每隔30s讀取吸光度，共5min。記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)下的吸光度值，每30s吸光度的P=對(duì)胰蛋白酶活性測(cè)定方法線性范圍、準(zhǔn)確度、精密本研究胰蛋白酶活性測(cè)定方法中胰蛋白酶工作濃度為50U/mL-60U/mL，因此將標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法重復(fù)測(cè)定活性3次，繪制不同酶濃度與吸光度變化平均值的關(guān)系圖并計(jì)算線性回吸光度變化值及活性數(shù)據(jù)如表5所示，不同酶濃度與吸光度變化平=0.0003x-0.0008，r=0.9948知，本方法在25U/mL～250U/mL范圍內(nèi)測(cè)出的活性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.44%，表明在此范圖1不同酶濃度與吸光度變化平均值的線性圖濃度（U/mL）吸光度變化值吸光度變化平均值0.007424.7250.00850.00790.01730.008228.327.830.555.0550.01580.01570.02120.016553.854.554.895.20.02130.02140.028795.295.796.70.04480.04500.04580.05970.04522000.05770.05700.07750.058258.32500.08050.07900.079268.3263.3263.3用0.001mol/LHCl將胰蛋白酶稀釋至66U/mL、55回收率=高（1.2:1）、中（1:1）、低（0.8:1）胰蛋白酶濃度下的試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表6所示，結(jié)果顯及AOAC《GuidelinesforSingleLaboratory活性（U/mL）平均活性（U/mL）回收率（%）平均回收率（%）66554465.766.765.755.053.854.843.843.046.266.054.544.3100.0099.15100.6899.94依法測(cè)定胰蛋白酶活性，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算6次重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表7所示，結(jié)果顯示重復(fù)性試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.76%，表明表13重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)次數(shù)活性（U/mg）平均活性（U/mg）RSD（%）1230203307330171.76429935295662974換一個(gè)操作人員，換一臺(tái)設(shè)備采用相同方法測(cè)6次再現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果如表8所示，結(jié)果顯示再現(xiàn)試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.76%，表明此表14再現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)次數(shù)活性（U/mg）平均活性（U/mg）RSD（%）1234320756糜蛋白酶是與胰蛋白酶作用、用途相似的酶，能迅取過(guò)程中容易殘留的雜質(zhì)，因此將建立的胰蛋胰蛋白酶溶液在不同廠家的設(shè)備上測(cè)定活性，重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。不表15不同設(shè)備試驗(yàn)結(jié)果設(shè)備名稱活性（U/mg）平均活性（U/mg）RSD（%）譜析-單光束320131714.13譜析-雙光束島津-雙光束3147316533293456342034763133303831123165葡萄糖脫氫酶（GDH）以D-葡萄糖（D-Glucose）為底物，將D-葡萄糖氧化，同時(shí)還原吩嗪硫酸甲酯（Phenazinemethosul（Sodium2,6-dichloroindophenolatehydrate,DCIP）進(jìn)一步氧化還原反應(yīng)的DCIP，此過(guò)程中DCIP的顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)為無(wú)色，氧化態(tài)DCIPpMS?p.PMS(還原態(tài))+DCIP—→PMS+DCIP(還原態(tài))①試劑Ⅰ：50mMPIPES-NaOH配制完成后6小時(shí)內(nèi)使用完畢）議配制完成后6小時(shí)內(nèi)使用完畢）將1mg/mL的供試品用冰預(yù)冷的酶稀釋液在冰上進(jìn)一步稀釋約4000-8000倍（稀釋至ΔA—酶促反應(yīng)進(jìn)行每分鐘的吸光值變化，ΔAdf—稀釋倍數(shù)；16.8—2,6-二氯靛酚鈉鹽在600nm處的微摩爾消光系數(shù)，單位為平方厘米每微摩爾內(nèi)，測(cè)得活性RSD在實(shí)際測(cè)量值與標(biāo)稱值差實(shí)際測(cè)量值與標(biāo)稱值差 在0.05-0.20U/mL范圍內(nèi)，測(cè)得葡萄糖脫氫酶的活性RSD在表17線性范圍驗(yàn)證結(jié)果樣品名稱稀釋酶活梯度測(cè)得酶活性（U/mL）平均酶活性（U/mL）RSD（%）葡萄糖脫氫酶0.20U/mL14567.1714782.4820.10U/mL14604.100.05U/mL15176.16果如下表所示。結(jié)果表明，所有的葡萄糖脫氫酶均因此標(biāo)稱活性與本檢測(cè)結(jié)果也會(huì)存在差異。這也進(jìn)表18準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果樣品名稱廠家標(biāo)稱酶活性（U/mL）測(cè)得酶活性（U/mL）測(cè)得酶活性/標(biāo)稱酶活性（%）葡萄糖脫氫酶Av2000021994.59葡萄糖脫氫酶Bh50004510.9290葡萄糖脫氫酶Cx2027414506.6172葡萄糖脫氫酶Dd1000010735.06表19精密度（重復(fù)性）驗(yàn)證結(jié)果樣品名稱酶活性1（U/mL）酶活性2（U/mL）酶活性3（U/mL）平均酶活性（U/mL）RSD（%）葡萄糖脫氫酶A20104.8321938.4723940.4621994.599葡萄糖脫氫酶B4390.774760.364381.634510.925葡萄糖脫氫酶C14371.6014835.5714312.6614506.612葡萄糖脫氫酶D10442.6610660.7710735.063測(cè)定原理CUNG，尿嘧啶-DNA糖基化檢測(cè)到熒光，且熒光值與DNA量在一定范圍內(nèi)成正比。此實(shí)驗(yàn)過(guò)程移液器、掌上離心機(jī)、微孔板離心機(jī)、渦旋混勻③PicoGreen染色液：按100μL1×TE+0.5μLpicogreen體系配制工作液表20反應(yīng)體系試劑體積(μl）DDWto5010×Taq緩沖液5dUTPmix1UDNA-F(10μM)2UDNA-R(10μM)2LamdaDNA(1ng/μl)1TaqDNA聚合酶(5U/μl）2.5表21反應(yīng)體系組分體積μlDDW10×Taq緩沖液2UDNA驗(yàn)證結(jié)果表22驗(yàn)證結(jié)果項(xiàng)目可接受標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證結(jié)果結(jié)論精密度重復(fù)性：測(cè)定3次的數(shù)據(jù)CV≤10.0%中間精密度：三個(gè)分析人員重復(fù)性：一個(gè)人測(cè)定3次的數(shù)據(jù)CV為4.39%。中間精密度：三個(gè)分析人員合格線性范圍1.線性驗(yàn)證：曲線上下平臺(tái)至少2個(gè)點(diǎn)，指數(shù)增長(zhǎng)期至少3個(gè)點(diǎn)。2.R2≥0.991.S曲線的上平臺(tái)和下平臺(tái)有3個(gè)點(diǎn)，指數(shù)增長(zhǎng)期有3個(gè)點(diǎn)2.R2＞0.99合格在0.017-100mU/μL范圍內(nèi)，測(cè)定酶濃度與雙鏈DNA熒光值的關(guān)系，擬合非線性回歸曲線，R2＞0.99。見下表表23線性范圍驗(yàn)證結(jié)果熒光值酶濃度mU/μL實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)2實(shí)驗(yàn)356635545.4545454559716120.661157027591789.3914350114.2688340962682982561.9403791354415014440.8819905166547596610.400904788299738640.182229445103011089880.0828315661076115510680.0376507121117120510860.01711396113212291090上平臺(tái)點(diǎn)數(shù)333下平臺(tái)點(diǎn)數(shù)333指數(shù)增長(zhǎng)期666ES501.1