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SZDB/ZSZDB/Z208-2016H7N9亞型禽流感病毒實時熒光RT-PCR檢測ProtocolofReal-timeReverseTranscriptionPolymeraseChainReactionforDetectionofAvianInfluenzaH7N9Virus2016-11-22發(fā)布2016-12-01實施深圳市市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 1 2 2 2 3 3 4 5 6 7檢疫技術(shù)中心、中華人民共和國江西出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國珠1Ct值Cyclethreshold，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾DEPCdiethylprocarbonate，PBSphosphatebuffersalinFAM6-carboxy-fluoresceiRT-PCRreversetranscriptionPolymeraseChainReactionDNAMAN軟件對Genebank公布的所有序列進(jìn)行Blast比較后，分別在各自的高度保守序列內(nèi)進(jìn)行引物和探的熒光信號。反應(yīng)進(jìn)入退火階段時，引物和探針同時與目的基因片段結(jié)合，此時探針上R基團(tuán)發(fā)出的熒2H7N9禽流感H7和N9的引物及探針（附錄B）。采用無DNA酶、無RNA酶水將每條引物與探針配制成100μmol/L儲存液，置-20℃或更低溫度凍存。使用時取適量配制成10μmol/L工作液，避免多次凍融。醇；無水乙醇；70％乙醇（用新開啟的滅菌雙蒸水配制，-20℃預(yù)冷0.01mol/LPBS（pH7.2，3待檢樣品在2℃~8℃保存不應(yīng)超過24h；-20℃保存不超過三個月；-80℃以下可長期保存。樣品b)每管加入600μL裂解液，分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照各200μL，再加入200μLc)取滅菌的1.5mL離心管，加入-20℃49.2.2.1反應(yīng)條件設(shè)定9.2.2.2通道選擇線，有明顯的對數(shù)增長期，才可判定試驗成立，否則試驗無效。10.3.1陽性反應(yīng)結(jié)果判定在試驗成立的條件下，H7亞型和N9亞型檢測結(jié)果同時呈現(xiàn)Ct值≤35且呈現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，判為熒光PCR陽性反應(yīng)，表明H7N9亞型禽流感病毒核酸陽性。5常用試劑配制A.10.01mol/LPBS(pH7.2)7.90gmL。經(jīng)121℃,15min高壓滅菌，室溫保存。A.2DEPC水6ATTACCTGGATAAGGGTC7
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