《鐵皮石斛繁育種子袋生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》編制說(shuō)明

《鐵皮石斛繁育種子袋生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程評(píng)定》編制說(shuō)明一、工作簡(jiǎn)況（一）任務(wù)來(lái)源云南大學(xué)、廣南藥王谷生物科技有限公司提出并立項(xiàng)《鐵皮石斛繁育種子袋生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程評(píng)定》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制定項(xiàng)目，協(xié)會(huì)負(fù)責(zé)該團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的起草工作。（二）起草單位云南大學(xué)、廣南藥王谷生物科技有限公司、云南山里紅生物科技有限公司、云南省地理標(biāo)志產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)、云南地標(biāo)運(yùn)營(yíng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司、地標(biāo)游學(xué)養(yǎng)科技服務(wù)（云南）有限公（三）標(biāo)準(zhǔn)主要起草人------------二、制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義石斛屬（DendrobiumSw.）為蘭科（Orchidaceae）第二大屬，全世界約有1500～1600種，都為附生植物，主要分布于熱帶東南亞及大洋洲地區(qū)。蘭科植物能產(chǎn)生像塵埃一樣數(shù)量巨大的種子，種子非常細(xì)小，沒(méi)有胚乳，需要依靠特定的菌根真菌提供營(yíng)養(yǎng)來(lái)促進(jìn)其萌發(fā)和幼苗形成，萌發(fā)后的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也往往需要依賴與之共生的真菌，只有當(dāng)真菌與幼苗的根形成共生菌根后，改善了水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收利用，植株才能正常地生長(zhǎng)發(fā)育。利用菌根真菌來(lái)促進(jìn)種子萌發(fā)和獲得幼苗，能顯著提高幼苗在自然環(huán)境中的存活率和生長(zhǎng)速度，被認(rèn)為是瀕危蘭科植物保護(hù)的重要途徑。對(duì)于藥用石斛產(chǎn)業(yè)而言，在大棚集約化栽培模式中，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行種子無(wú)菌萌發(fā)生產(chǎn)種苗，人工增施營(yíng)養(yǎng)，利用農(nóng)藥控制病蟲害，在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中，菌根真菌的作用被完全忽略，但在自然條件下開展藥用石斛的仿野生栽培，利用種子和特定的真菌共生萌發(fā)，并制備成真菌袋，不僅能簡(jiǎn)化種苗生產(chǎn)過(guò)程，豐富種植場(chǎng)景，降低生產(chǎn)成本，更重要的是能有效地促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)和增強(qiáng)抗逆性，提高產(chǎn)品品質(zhì)，縮短生產(chǎn)周期，具有巨大的應(yīng)用價(jià)“真菌-種子袋”是一種專門為鐵皮石斛種子在野外進(jìn)行直播而設(shè)計(jì)的繁殖材料，通過(guò)將顯著促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā)及幼苗建成的特定真菌菌粉、鐵皮石斛種子以及水苔等按照特定配比混合制成，解決了蘭科植物種子在自然條件下萌發(fā)和幼苗形成的問(wèn)題，對(duì)于以收獲植株莖干為目的藥用鐵皮石斛仿野生栽培來(lái)說(shuō)，是鐵皮石斛仿野生栽培技術(shù)的革命性突破。目前已利用“真菌-種子袋”技術(shù)開展仿野生栽培技術(shù)示范和推廣，初步形成了鐵皮石斛仿野生栽培產(chǎn)業(yè)，促進(jìn)農(nóng)民增收和區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展，具有顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效三、主要起草過(guò)程組建了包含云南大學(xué)、廣南藥王谷生物科技有限公司、云南山里紅生物科技有限公司、云南地標(biāo)運(yùn)營(yíng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司、地標(biāo)游學(xué)養(yǎng)科技服務(wù)（云南）有限公司的企業(yè)代表以及云南省地理標(biāo)志產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)內(nèi)部專家的標(biāo)準(zhǔn)起草組。本項(xiàng)目立項(xiàng)后，標(biāo)準(zhǔn)起草組通過(guò)調(diào)研、收集資料、分析研究起草了標(biāo)準(zhǔn)討論稿，由協(xié)會(huì)專家?guī)祀S機(jī)抽取專家，經(jīng)多次討論修改、召開研討會(huì)、聽取意見建議修改后形成了征求意見稿及編制說(shuō)明。征求意見稿及編制說(shuō)明形成后，在省、州市級(jí)行政管理部門、相關(guān)研究機(jī)構(gòu)和地理標(biāo)志產(chǎn)品相關(guān)產(chǎn)業(yè)的企業(yè)進(jìn)行了廣泛的征求意見。共提出意見15個(gè)，標(biāo)準(zhǔn)起草單位或工作組對(duì)意見處理結(jié)果：采納13個(gè)，因其中一個(gè)專家建議刪除其中條款，所以未采納另一個(gè)專家對(duì)該條款的內(nèi)容修改。經(jīng)過(guò)對(duì)相關(guān)反饋意見進(jìn)行分析研究和處理，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿進(jìn)行修改完善，形成《鐵皮石斛繁育種子袋生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)草案。四、編制的原則和依據(jù)，與現(xiàn)行法律、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系1、合規(guī)性原則標(biāo)準(zhǔn)起草要完全按照國(guó)家相關(guān)法律法規(guī)和產(chǎn)業(yè)政策標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。2、可行性原則標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容和要求要具有可行性、適用性和可操作性。3、規(guī)范性原則編寫內(nèi)容與格式嚴(yán)格按照按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)（二）依據(jù)國(guó)家/省市相關(guān)法律法規(guī)、產(chǎn)業(yè)政策的規(guī)定和鐵皮石斛的研發(fā)、栽培、管理、采收和溯源管理等實(shí)際情況。五、標(biāo)準(zhǔn)主要條款的說(shuō)明（一）真菌-種子袋Fungus-seedbags真菌-種子袋是一種專門為鐵皮石斛種子在野外進(jìn)行直播而設(shè)計(jì)的繁殖材料，通過(guò)將顯著促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā)及幼苗建成的特定真菌菌粉、鐵皮石斛種子以及水苔等按照一定的配比混合制成。（二）茶包袋透氣、易降解的紙質(zhì)茶包袋（長(zhǎng)*寬：6.2*5.5cm）。（三）菌株菌株為從鐵皮石斛自然萌發(fā)的原球莖中分離獲得的菌體，該菌株通過(guò)形態(tài)和分子序列研究，為蠟殼耳科的一個(gè)真菌新種，定名為石斛蠟殼菌（SerendipitaofficinaleX.J.Wang），菌株在GenBank登錄號(hào)：MN173026；在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為：CCTCCNo:M2019744。（四）菌株活化利用接種環(huán)，從試管斜面中取出一小塊石斛蠟殼菌（SerendipitaofficinaleX.J.Wang）菌種，將菌塊置于平板中心，該平板預(yù)先準(zhǔn)備好馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA；馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L,瓊脂20g/L，pH=5.8-6）；用封口膜將平板密封，放置在25±2℃的培養(yǎng)室中進(jìn)行暗培養(yǎng)，約10天，待真菌菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面，即可將其作為后續(xù)的接種物。（四）培養(yǎng)基培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB；配方：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L,pH=5.8-6）。分裝300ml培養(yǎng)基至錐形瓶（500ml）中，用錫箔紙密封好瓶口，然后將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶放入高壓滅菌鍋中，設(shè)定條件為121℃下滅菌20分鐘。滅菌完成后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)上冷卻至室溫。（五）真菌擴(kuò)繁在超凈工作臺(tái)上，使用已滅菌的尖鑷切取步驟4.2.2中預(yù)備的液體培養(yǎng)基中。接菌操作完成后，立即用錫箔紙密封定。將含有培養(yǎng)基和菌塊的錐形瓶放置于振蕩培養(yǎng)箱中，啟動(dòng)儀器進(jìn)行振蕩培養(yǎng)（25℃±2℃,200轉(zhuǎn)/分），以促進(jìn)真菌的孵化擴(kuò)繁。培養(yǎng)15天左右，菌絲就能長(zhǎng)滿；冬季，可能需要延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至大約20天，以確保菌絲生長(zhǎng)充分。（六）菌粉配制利用尼龍網(wǎng)過(guò)濾步驟4.2.4中得到的含有培養(yǎng)基和菌絲的混合液，以分離出菌絲。移除溶液，僅保留菌絲，并使其自然瀝干，得到純凈的菌絲。將純菌絲與瓊脂以1:2的重量比混合，放入多功能粉碎機(jī)中，先進(jìn)行4秒的快速粉碎，然后暫停機(jī)器，等待儀器完全停止，打開蓋子，用干凈玻璃棒進(jìn)行攪拌，確保菌絲充分粉碎，再次啟動(dòng)粉碎機(jī)進(jìn)行3秒的粉碎，以獲得粒徑均勻的菌粉。將得到的菌粉倒入不銹鋼托盤中，攤平、不超過(guò)1厘米的厚度。將托盤放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在28℃的溫度下吹風(fēng)烘干24-36小時(shí)（期間適當(dāng)攪拌菌粉，確保菌粉充分干燥）。（七）鐵皮石斛種子活力檢驗(yàn)鐵皮石斛種子使用前，先使用TTC（2,3,5-氯化三苯基以上，備用。具體方法見附錄A。（八）萌發(fā)率檢測(cè)試驗(yàn)之后，使用高壓滅菌鍋對(duì)其進(jìn)行滅菌處理，確保松樹皮的無(wú)菌狀態(tài)。冷卻后，將松樹皮均勻地鋪（厚度：2-3cm）到塑料飯盒中。手動(dòng)將鐵皮石斛真菌-種子袋中的粉末抖均勻，并用干凈水源充分浸泡（浸泡5-10分鐘直至濕透。將濕潤(rùn)的真菌-種子袋放置于松樹皮基質(zhì)上，緊接著蓋上飯盒蓋。最后將塑料飯盒放置在組織培養(yǎng)室內(nèi)（25℃±2℃,光照周期：12/12h光/暗，光照強(qiáng)度：2000lx）中進(jìn)行共生萌發(fā)培養(yǎng)。（九）萌發(fā)率評(píng)估共生萌發(fā)培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計(jì)鐵皮石斛真菌-種子袋的萌發(fā)情況。萌發(fā)率（%）=成功萌發(fā)袋數(shù)/總袋數(shù)*100%。（十）菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末含水率檢驗(yàn)菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末長(zhǎng)期貯存要求的含水率與鐵皮石斛種子貯存要求的含水率一致，因此統(tǒng)一按照GB/T3543.6的規(guī)定進(jìn)行含水率檢驗(yàn)。（十一）真菌-種子袋菌粉量檢驗(yàn)使用天平依次稱重每袋真菌-種子袋的菌粉重量。（十二）檢驗(yàn)結(jié)果判定上述報(bào)告中若有