《植物組織培養(yǎng)》課件 項目5 植物脫毒技術

植物脫毒技術項目五植物脫毒技術任務二馬鈴薯的組織培養(yǎng)任務一植物脫毒技術介紹馬鈴薯的組織培養(yǎng)任務一植物脫毒技術介紹知識目標能理解無病毒苗培養(yǎng)的意義；理解組織培養(yǎng)脫毒的原理；學會組織培養(yǎng)脫毒的方法和培養(yǎng)流程；學會病毒的科學檢測方法；學會解剖鏡的使用；掌握組織培養(yǎng)脫毒苗在生產(chǎn)上的意義；掌握脫毒苗木的保存和利用方法。1234567掌握植物微莖尖培養(yǎng)的脫毒方法掌握無毒苗木的鑒定方法熟悉草莓的微莖尖脫毒培養(yǎng)技術132以草莓為例介紹“脫毒”

視頻5-1草莓脫毒

危害植物的病毒有幾百種，且隨著栽培時間的延長，在母株內逐代積累，危害越來越嚴重。尤其是靠無性繁殖的作物，如通過嫁接、分株、扦插、壓條等途徑來進行繁殖的。象果樹的蘋果、葡萄、草莓等?；ɑ艿陌俸稀⑻戚牌?、水仙、郁金香、香石竹、菊花等，蔬菜的馬鈴薯、姜等。

病毒的危害給作物生產(chǎn)帶來重大的損失。如草莓病毒的危害，使草莓產(chǎn)量嚴重降低，品質大大退化。葡萄扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)10～18%。為害馬鈴薯有幾十種病毒，給馬鈴薯生產(chǎn)帶來嚴重障礙[北愛爾蘭上百萬人饑餓而死]。花卉上病毒的危害大大影響其觀賞價值，表現(xiàn)花少而小，產(chǎn)生畸形、變色等。為了提高作物的產(chǎn)量和質量，根除病毒和其它病原菌是非常必要的。雖然可以治愈受細菌和真菌侵染的植物，但現(xiàn)在還沒有什么藥物可治愈受病毒侵染的植物。若一個無性系的整個群體都已受到侵染，獲得無病毒植株的唯一方法就是消除營養(yǎng)體的病原菌，并由這些組織中再生出完整的植株。一旦獲得了一個不帶病原菌的植株，就可在不致受到重新侵染的條件下，對它進行營養(yǎng)繁殖。用組織培養(yǎng)法消除病毒是唯一行之有效的方法。由于病毒對植物造成如此嚴重的危害。所以世界各國都非常重視這方面的研究，如日本用柑桔莖尖微嫁接繁殖無病毒柑桔營養(yǎng)系。美國用組織培養(yǎng)法，使蘋果無病毒苗進行工廠化育苗，并在全國普遍開展。一、無毒苗培育的意義二、熱處理脫毒三、莖尖培養(yǎng)脫毒四、其它途徑脫毒任務講解五、病毒植物的鑒定六、無病毒植物的保存和利用一、無病毒苗培育的意義

采用生物、物理、化學等途徑防治病毒病收效甚微，甚至毫無成效。自從50年代發(fā)現(xiàn)通過組織培養(yǎng)的方法可以脫除嚴重患病毒植物的病毒種類，提高產(chǎn)量、質量后（如草莓可增產(chǎn)20～50%。菊花切花品種的脫毒株，表現(xiàn)出株高增加，切花數(shù)增多，花朵大）。因此到60至70年代組織培養(yǎng)的技術在花卉、蔬菜和果樹等得到廣泛的應用。用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)無毒苗，是一個積極有效的途徑，由于排除了使用藥劑，所以對減少污染，防止公害，保護環(huán)境都有積極的意義。一、無毒苗培育的意義二、熱處理脫毒1、熱處理法的發(fā)現(xiàn)及應用1889年，印度尼西亞爪畦人發(fā)現(xiàn)，患枯萎病的甘蔗（現(xiàn)證明為病毒?。?，放在50～52℃的熱水中保持30分鐘，甘蔗就可去病生長良好。以后這個方法得到了廣泛的應用，每年在栽種前把大量甘蔗莖段放到大水鍋里進行處理。自1954年Kassanis用熱處理防治馬鈴薯卷葉病以后，這一技術即被用以防治許多植物的病毒病。二、熱處理脫毒

熱處理又稱溫治療法(Theomtherapy)。原理是植物組織處于高于正常溫度的環(huán)境中，組織內部的病毒受熱之后部分或全部鈍化，但寄主植物的組織很少或不會受到傷害。

Kassanis(1954)解釋是：感染植物體內病毒的含量，反映了病毒顆粒生成和破壞的程度。在高溫下，不能生成或生成病毒很少，而破壞卻日趨嚴重，以致病毒含量不斷降低，這樣持續(xù)一段時間，病毒自行消滅，從而達到脫毒的目的。二、熱處理脫毒2、熱處理方法溫湯浸漬處理適用于休眠器官、剪下的接穗或種植的材料，在50℃左右的溫水中浸漬10分鐘至數(shù)小時，方法簡便易行，但易使材料受傷。二、熱處理脫毒

熱空氣處理熱空氣處理對活躍生長的莖尖效果較好，將生長的盆栽植株移入溫熱治療室（箱）內，一般在35～40℃。處理時間因植物而異，短則幾十分鐘，長可達數(shù)月。香石竹于38℃下處理2個月，其莖尖所含病毒即可被清除。馬鈴薯在35℃下處理幾個月才能獲得無病毒苗。草莓莖尖培養(yǎng)結合36℃處理6周，比僅用莖尖培養(yǎng)可更有效地清除輕型黃斑病毒。亦可采用變溫方法，如馬鈴薯每天40℃處理4小時可清除芽眼中馬鈴薯的葉片病毒，而且保持了芽眼的活力。二、熱處理脫毒

熱處理方法主要缺陷是并非能脫除所有病毒。例如在馬鈴薯中，應用這項技術只能消除卷葉病毒。一般來說。對于球狀病毒和類似紋狀的病毒以及類菌質體所導致的病害才有效，對桿狀和線狀病毒的作用不大。而且對寄主植物作較長時間的高溫處理有鈍化植物組織中的阻抗因子，致使寄主植物抗病毒因子不活化，從而增加無效植株的發(fā)生率。因此熱處理需與其他方法配合應用，才可獲得良好的效果。二、熱處理脫毒三、莖尖培養(yǎng)脫毒1、莖尖培養(yǎng)脫毒感染病毒植株的體內病毒的分布并不均勻，病毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染程度越低，生長點（約0.1～1.0mm區(qū)域）則幾乎不含或含病毒很少。這是因為分生區(qū)域內無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不上細胞不斷分裂和活躍的生長速度。在切取莖尖時越小越好，但太小則不易成活，過大則不能保證完全除去病毒。莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定，所以是目前培育無病毒苗的最廣泛最重要的一個途徑。三、莖尖培養(yǎng)脫毒2、培養(yǎng)基一般以White、Morel和MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，尤其是提高鉀鹽和銨鹽含量有利于莖尖的生長。植物激素的種類與濃度對莖尖生長和發(fā)育具有重要的作用。必須添加適當濃度的生長素(0.1～0.5mg/L)與細胞分裂素，用NAA或IBA，細胞分裂素可用KT或BA。GA3對某些植物莖尖培養(yǎng)是有用的。莖尖培養(yǎng)中，由于操作方便，一般都使用瓊脂培養(yǎng)基。不過，在瓊脂培養(yǎng)基能誘導外植體愈傷組織化的情況下，最好還是用濾紙橋。三、莖尖培養(yǎng)脫毒3、莖尖培養(yǎng)方法進行脫毒培養(yǎng)時，由于微小的莖尖組織很難靠肉眼操作，因而需要一臺帶有適當光源的簡單的解剖鏡(8～40X)。剝離莖尖時，應盡快接種，莖尖暴露的時間越短越好，以防莖尖變干?？稍谝粋€襯有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內進行操作，有助于防止莖尖變干。三、莖尖培養(yǎng)脫毒

進行莖尖培養(yǎng)時，首要一步是獲得表面不帶病原菌的外植體。一般來說，莖尖分生組織由于有彼此重疊的葉原基的嚴密保護，只要仔細解剖，無須表面消毒就應當能得到無菌的外植體。選取莖尖前，可把供試植株種在無菌的盆土中，放在溫室中進行栽培。澆水時要直接澆在土壤中而不要澆在葉片上。另外，最好還要給植株定期噴施內吸殺菌劑，可用多菌靈(0.1%)和抗生素（如0.1%鏈霉素）。對于某些田間種植的材料，可以切取插條插入Knop溶液中令其長大，由這些插條的腋芽長成的枝條，要比由田間植株上直接取來的枝條污染小得多。三、莖尖培養(yǎng)脫毒

為了保險起見，在切取外植體之前一般仍須對莖芽進行表面消毒。葉片包被嚴緊的芽，如菊花、蘭花等只須在75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，如香石竹、蒜和馬鈴薯等，則要用0.1%次氯酸鈉表面消毒10分鐘。對于這些消毒方法，在工作中應靈活運用，如在大蒜莖尖培養(yǎng)時，可將小鱗莖在75%酒精中浸蘸一下，再用燈火燒掉酒精，然后解剖出無菌莖芽。當一個閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀片將分生組織切下來，為了提高成活率，可帶1～2枚幼葉，然后將其接到培養(yǎng)基上。三、莖尖培養(yǎng)脫毒

將接處好的莖尖置于22℃左右的溫度。每天16小時，2000～3000Lx的光照條件下培養(yǎng)。由于在低溫和短日照下，莖尖有可能進入休眠，所以較高的溫度和充足的日照時間必須保證。微莖尖需數(shù)月培養(yǎng)才能成功。莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和一般器官的培養(yǎng)相同，這里不再敘述。三、莖尖培養(yǎng)脫毒4、影響微莖尖培養(yǎng)的因素外植體大?。涸谧钸m培養(yǎng)條件下，外植體的大小決定莖尖的存活率，外植體越大，產(chǎn)生再生植株的機會也就越多，而外植體越小脫毒效果越好。除了外植體的大小之外，葉原基的存在與否也影響分生組織形成植株的能力。三、莖尖培養(yǎng)脫毒培養(yǎng)條件：在莖尖培養(yǎng)中，照光培養(yǎng)的效果通常比暗培養(yǎng)好，如馬鈴薯莖尖培養(yǎng)時，當莖已長到1厘米高時光照強度增加到4000Lx。外植體的生理狀態(tài)：莖尖最好要由活躍生長的芽上切取，在香石竹和菊花中，培養(yǎng)頂芽莖尖比培養(yǎng)腋芽莖尖效果好。但在草莓中，二者沒什么差別。取芽的時間也很重要，一般選作萌動期較好。否則采用某種適當?shù)奶幚?、打破休眠才能進行。三、莖尖培養(yǎng)脫毒四、其它途徑脫毒1、愈傷組織培養(yǎng)脫毒通過植物的器官和組織誘導產(chǎn)生愈傷組織。然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，可以得到無病毒苗。但是，愈傷組織脫毒的缺陷是植株遺傳性不穩(wěn)定，可能會產(chǎn)生變異植株。四、其它途徑脫毒2、莖尖微體嫁接木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根成植株，將實生苗砧木人工培養(yǎng)，在砧木上進行試管微體嫁接。這在桃、柑橘、蘋果等果樹上已獲得成功。3、化學療法脫毒許多化學藥品（包括嘌呤、嘧啶類似物、氨基酸、抗菌素等）對離體組織和原生質體具有脫毒效果。四、其它途徑脫毒五、病毒植物的鑒定

從上述途徑培育得到的植株，必須經(jīng)過嚴格的鑒定，證明確實無病毒存在，才是其正的無病毒苗，才可以提供給生產(chǎn)應用。鑒定的方法有多種。五、病毒植物的鑒定1、指示植物法是利用病毒在其它植物上產(chǎn)生的枯斑作為鑒別病毒種類的方法。這種專門選用以產(chǎn)生局部病斑的寄主即為指示植物。它只能鑒定靠汁液傳染的病毒。指示植物法最早是美國的病毒學家發(fā)現(xiàn)的。這種方法條件簡單，操作方便，故一直沿用至今，仍為一種經(jīng)濟而有效的鑒定方法。應根據(jù)不同的病毒選擇適合的指示植物。此外指示植物一年四季都容易栽培。

五、病毒植物的鑒定

接種時從被鑒定植物取1～3克幼葉，在研缽中加10毫升水及少量磷酸緩沖液（PH7.0），研碎后用兩層紗布濾去渣滓，再在汁液中加入少量的500～600目金鋼砂作為指示植物葉片的磨擦劑，使葉面造成小的傷口，而不破壞表面細胞。以后用棉球蘸取汁液在葉面上輕輕涂抹2～3次進行接種，后用清水沖洗葉面。接種時可用手指涂抹、用紗布或用噴槍等來接種。接種工作應在防蚜蟲溫室中進行，保溫15～25℃。接種后2～6天可見到癥狀出現(xiàn)。木本多年生果樹植物及草莓等無性繁殖的草本植物，通常采用嫁接接種的方法。五、病毒植物的鑒定2、抗血清鑒定法植物病毒是由蛋白質和核酸組成的核蛋白，因而是一種較好的抗原，給動物注射后會產(chǎn)生抗體，抗體存在于血清之中稱抗血清。不同病毒產(chǎn)生的抗血清有各自的特異性。用已知抗血清可以鑒定未知病毒的種類。這種抗血清就是高度專一性的試劑，特異性高，測定速度快，一般幾小時甚至幾分鐘就可以完成。所以抗血清法成為植物病毒鑒定中最有用的方法之一。測定時，把稀釋的抗血清與未知各植物病毒在小試管內仔細混合，這一反應導致形成可見的沉淀。然后根據(jù)沉淀反應來鑒定病毒。五、病毒植物的鑒定3、電子顯微鏡檢查法人的眼睛不能觀察小于0.1毫米的微粒，借助于普通光學顯微鏡也只能看到小至200微米的微粒，只有通過電子顯微鏡才能分辨0.5毫微米大小的病毒顆粒。采用電子顯微鏡可以直接觀察病毒，檢查出有無病毒存在，并可得知病毒顆粒的大小、形狀和結構，借以鑒定病毒的種類。這是一種較為先進的方法。五、病毒植物的鑒定4、酶聯(lián)免疫法（Elisa）是采用酶標記抗原或抗體的定量測定法。將抗原固定在支持物上，加入待檢血清，然后加入酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）標記的抗體，使待檢血清中與對應抗原的特異性抗體結合，最后用特殊分光光度計測定。此法是現(xiàn)在靈敏度較高和常使用的方法。五、病毒植物的鑒定六、無病毒植物的保存和利用1、無病毒苗的保存繁殖無病毒植株有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到無病毒苗，就應很好隔離保存。這些原原種或原種材料保管得好可以保存利用5～10年。通常無病毒苗應種植在隔蟲網(wǎng)內，使用300目，即網(wǎng)眼為0.4～0.5mm大小的網(wǎng)紗，可以防止蚜蟲進入。六、無病毒植物的保存和利用

栽培用的土壤也應進行消毒，周圍環(huán)境也要整潔，并及時噴施農(nóng)藥防治蟲害，以保證植物材料在與病毒嚴密隔離的條件下栽培。另一種更便宜的方法，是把由莖尖得到的并已經(jīng)過脫毒檢驗的植物通過離體培養(yǎng)進行繁殖和保存。六、無病毒植物的保存和利用2、無病毒苗的利用無病毒苗在生產(chǎn)中的利用也要防止病毒的再感染。生產(chǎn)場所應隔離病毒感染途徑，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此種植區(qū)及種植規(guī)模小的地方，要較長時間才會感染。而在種植時間長、輪作及種植規(guī)模大的產(chǎn)地則在短期內就可感染。一旦感染，影響產(chǎn)量質量的，就應重新采用無病毒苗，以保證生產(chǎn)的質量。六、無病毒植物的保存和利用復習思考題1．組織培養(yǎng)在生產(chǎn)脫毒苗木上有何意義？2．熱處理為什么可以去除部分植物病毒？熱處理方法分為幾種，常用的是哪一種？3．為什么用微莖尖組織培養(yǎng)形成的試管苗一般是無毒的？4．分離微莖尖與分離普通莖尖有何區(qū)別？5．怎樣保存和利用無毒苗？植物脫毒技術項目五

植物脫毒技術任務二

馬鈴薯的組織培養(yǎng)任務一

植物脫毒技術介紹任務二馬鈴薯的組織培養(yǎng)馬鈴薯的組織培養(yǎng)知識目標能理解無病毒苗培養(yǎng)的意義；理解組織培養(yǎng)脫毒的原理；學會組織培養(yǎng)脫毒的方法和培養(yǎng)流程；學會病毒的科學檢測方法；學會解剖鏡的使用；學會馬鈴薯微型薯生產(chǎn)技術；能理解無病毒苗木及種質資源的保存和利用方法。1234567掌握馬鈴薯脫毒培養(yǎng)的大致過程，了解馬鈴薯脫毒苗的鑒定方法;掌握馬鈴薯的生物學習性：熟悉微型薯的生產(chǎn)過程132微型薯任務導入以草莓為例介紹“脫毒”

視頻5-1草莓脫毒

馬鈴薯是一種全球性的重要經(jīng)濟作物。適應性廣，營養(yǎng)價值高，耐貯藏適運輸，既是一種重要的糧食作物也是一種調節(jié)市場供應的重要蔬菜。馬鈴薯原產(chǎn)于拉丁美洲，當被發(fā)現(xiàn)可以食用后，很快傳到世界各地，成為栽培很廣的一種作物。

但是，當發(fā)現(xiàn)從外地引種栽培1～2個周期后，明顯發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量降低，植株變矮，并有卷葉的現(xiàn)象產(chǎn)生，經(jīng)檢測證明這是由于病毒引起的退化現(xiàn)象。任務導入

危害馬鈴薯的病毒有17種之多，如X病毒、S病毒、Y病毒、M病毒、A病毒、花葉病毒、紡錘形塊莖病毒等。由于馬鈴薯是無性繁殖作物，病毒逐代積累，日益嚴重，引起嚴重退化。馬鈴薯病毒可使塊莖產(chǎn)量減少50%～80%。

法國Morel和他的同事們，1955年從患病馬鈴薯植株中選取到了無病植株，為治療作物病毒開辟了新途徑。

任務導入一、特性和生物學習性

二、馬鈴薯脫毒技術三、馬鈴薯無病毒苗的鑒定材料四、馬鈴薯無病毒株的繁殖和保存任務講解1、馬鈴薯的形態(tài)特性（1）根馬鈴薯的根系由出生根和匍匐根兩部分組成。（2）莖馬鈴薯分地上部分和地下部分，地上主莖在形成16片葉子后，由花芽封頂，并在花的下部發(fā)生兩個側枝，從而構成馬鈴薯的主要同化系統(tǒng)。地下莖包括主莖的地下部分、匍匐莖和塊莖。一、特性和生物學習性（3）葉馬鈴薯先出土的葉是初生葉，全緣，心臟形。以后發(fā)生的葉奇數(shù)羽狀全裂單葉，在葉柄基部與主莖相連處著生有托葉。（4）花馬鈴薯的花為聚傘花序，第一或第二花序開放，恰是塊莖強盛膨大之時，此時是需要不斷澆水的形態(tài)標志。（5）果實、種子馬鈴薯果實為球形或橢圓形漿果。種子小。扁平腎形。種子可用來繁殖，但后代性狀分離大。一、特性和生物學習性2、生物學習性馬鈴薯性喜冷氣候，不耐高溫和霜凍，解除休眠的塊莖4℃下發(fā)芽，發(fā)芽適溫為12～18℃。地上莖葉生長溫度為17～21℃，25℃以上時生長不良，葉變小，超過30℃和7℃以下莖葉停止生長，-1℃時受凍。塊莖形成要求晝溫14～24℃，夜溫12～14℃，土溫16～18℃。土溫20℃以上時塊莖形成緩慢，而且容易引起退化，高溫下養(yǎng)分多用于芽和匍匐莖生長不易形成塊莖，25～30℃時已經(jīng)長成的塊莖也變成細長莖，結薯期要求12h左右的短日照和疏松、濕潤、肥沃以及通氣良好的土壤條件。土壤板結，薯塊表面粗糙和薯形不整。一、特性和生物學習性

馬鈴薯生產(chǎn)中普遍存在有種性退化問題，表現(xiàn)為植株長勢衰弱，株形矮化，分枝變少，薯塊變小，產(chǎn)量逐降低，造成退化的原因和學說多種，綜合而言，主要是薯塊生長錐細胞發(fā)生階段性衰老而導致種性退化，而病毒和細菌病害的侵染，以及肥水、營養(yǎng)條件不良等都會加劇其退化程度。一、特性和生物學習性

馬鈴薯在營養(yǎng)繁殖時易受病毒的浸染，當條件適合時，病毒就會在植株內增殖，轉運和積累，隨著世代傳遞，病毒危害逐年加重，一般可造成減產(chǎn)50％以上。研究發(fā)現(xiàn)，有30多種病毒易感染馬鈴薯，并引起品種退化，嚴重影響馬鈴薯的生產(chǎn)。通過微莖尖組織培養(yǎng)技術能從馬鈴薯體內脫除PLRV、PVY、PVA、PAF、PVG、PVM、PSW等病毒。二、馬鈴薯脫毒技術意義

因此，采用組織培養(yǎng)技術，通過一定良種繁殖體系，生產(chǎn)優(yōu)質種薯，是保證馬鈴薯高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的一項有效措施。二、馬鈴薯脫毒技術意義

全國現(xiàn)有馬鈴薯播種面積300多萬公頃，且有逐步增加的趨勢，每年需合格種薯45億公斤，脫毒原種4億公斤，脫毒小薯或微型薯45億粒。因此，脫毒馬鈴薯推廣具有廣闊的市場前景，對于增加農(nóng)民收入和發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有十分重要的意義。二、馬鈴薯脫毒技術意義

我國的馬鈴薯平均單產(chǎn)僅為13.60噸/公頃，是世界單產(chǎn)最高國家瑞士（48.80噸/公頃）的1/4。造成如此大的差別，最主要的因素就是種薯質量差，品種布局不合理。采用脫毒快繁技術，種用脫毒種薯，一般可增產(chǎn)30-50%，甚至成倍增產(chǎn)，充分發(fā)揮品種的潛能，提高馬鈴薯生產(chǎn)能力。如果我國現(xiàn)有馬鈴薯播種面積的1/3（即114萬公頃）用脫毒種薯，就可年增產(chǎn)糧食100多億公斤。二、馬鈴薯脫毒技術意義

我國在70年代用莖尖組織培養(yǎng)方法得到脫毒馬鈴薯試管苗，并成功地獲得脫毒復壯的馬鈴薯，開始了脫毒種薯的生產(chǎn)和推廣。"八五"期間，農(nóng)業(yè)部在全國范圍內設立了6個馬鈴薯原原種基地建設和種薯生產(chǎn)項目，初步形成了脫毒草種薯生產(chǎn)體系。共推廣脫毒種薯36.5-40萬公頃，獲經(jīng)濟效益近30.8億元。二、馬鈴薯脫毒技術研究進展

我國已有許多科研、推廣單位開展了脫毒馬鈴薯的研究和生產(chǎn)，在生產(chǎn)上產(chǎn)生了一定的經(jīng)濟效益和增產(chǎn)效果，但由于長期以來各自為政，技術方法和脫毒標準不盡統(tǒng)一，未能發(fā)揮出脫毒種薯應有的增產(chǎn)潛力。到目前為止，我國仍未建立國家級的脫毒種薯質量監(jiān)督和病毒檢測制度。二、馬鈴薯脫毒技術研究進展1.脫毒種薯生產(chǎn)程序采用微莖尖組織培養(yǎng)的方法，誘導出苗，采用聯(lián)免疫吸附試驗法或指示植物方法鑒定馬鈴薯病毒和類病毒，經(jīng)鑒定后，無主要病毒及類病毒的試管苗可定為脫毒試管基礎苗。脫毒種薯生產(chǎn)

試管基礎苗在無菌條件下，采用固體、液體培養(yǎng)基相結合的方法，進行擴繁基礎苗，在防蟲網(wǎng)室栽植或封閉溫室扦插，生產(chǎn)出原原種（或稱脫毒小薯）。用原原種在一定隔離條件下產(chǎn)生原種1代，以后逐級稱為原種2代、良種1代、良種2代。脫毒種薯生產(chǎn)脫毒種薯生產(chǎn)2．莖尖培養(yǎng)脫毒（1）取材和培養(yǎng)一般多采用在室內發(fā)芽，芽經(jīng)熱處理（38℃）2周。然后取頂芽或側芽1厘米的莖尖，在自來水下沖洗干凈，無菌條件下先用70％的酒精浸潤組織15-20秒，再用2％的次氯酸鈉溶液浸泡4～5min，然后用無菌水沖洗3次。脫毒種薯生產(chǎn)

把消毒好的芽放在解剖鏡下仔細剝離，逐層剝去幼葉，露出圓滑的生長點，可以留1～2個葉原基，0.2～0.3毫米，隨即接種于MS液體培養(yǎng)基上，每升加0.1mgNAA、0.2mgGA3、0.5mgBA，2%蔗糖，pH值5.8。脫毒種薯生產(chǎn)培養(yǎng)條件：21～25℃、2000～3000lx、12h/d。2～3周愈傷，4～5周綠點，3～6月長成2～3厘米小芽，越慢越好，出芽很快的扔掉。

（2）繼代和生根

培養(yǎng)成功的馬鈴薯脫毒苗，經(jīng)ELISA（試劑盒）鑒定后（試管苗應每3月檢測一次，每年4次）鑒定后，采用固體、液體培養(yǎng)基相結合方法擴繁。取試管苗單節(jié)切段扦插在（或平放）固體培養(yǎng)基上，每瓶可插20個左右莖段，經(jīng)20d左右發(fā)育成5~10cm高小植株，繼續(xù)進行切段繁殖，此法速度快，每月可繁殖5~8倍，試管苗多節(jié)接種在液體培養(yǎng)基上，進行淺層靜止液體培養(yǎng)。脫毒種薯生產(chǎn)2．莖尖培養(yǎng)脫毒培養(yǎng)基：

MS+NAA0.2-0.5+D-泛酸鈣10，3%蔗糖，20～25度，3000～4000LX，14～16小時光照，每3周繼代一次，單芽莖段約1厘米，可插也可平放，原則上試管苗用2年～3年。

脫毒種薯培養(yǎng)基脫毒種薯培養(yǎng)基(3)馴化

為增強試管苗對溫室內環(huán)境條件的適應能力，移植前對試管苗要進行光、溫鍛煉。煉苗期溫室內的溫度：白天23~27℃，夜間不低于14℃。煉苗的具體方法是：移植前7d左右，將長有3~5片葉、高2~3cm的試管苗，在不開瓶口的狀態(tài)下，從培養(yǎng)室移至溫室排好。為防止強光、高溫灼傷試