DB22-T2560-2016-水貂病毒性腸炎檢疫技術(shù)規(guī)范-吉林省

ICS11.220DB22B41吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2560—2016水貂病毒性腸炎檢疫技術(shù)規(guī)范Quarantineprotocolforminkviralenteritis吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2560—2016前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局提出并歸口于吉林省畜牧業(yè)管理局。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王偉利、王建科、孟慶峰、程悅寧、易立、姚貴哲、王準(zhǔn)、宋翱、程世鵬。IDB22/T2560—2016水貂病毒性腸炎檢疫技術(shù)規(guī)范1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水貂病毒性腸炎的病原分離鑒定、HA-HI試驗(yàn)、PCR、Real-timePCR及動(dòng)物回歸試驗(yàn)等診斷技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水貂病毒性腸炎的檢疫、疫情監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析試驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3縮略語下列縮略語適用于本文件MEV：水貂腸炎病毒F81：貓腎傳代細(xì)胞CPE：細(xì)胞病變——離心管（1.5mL、0.2mL）——試驗(yàn)動(dòng)物：3月齡健康水貂（水貂腸炎病毒HI抗體效價(jià)≤1∶4）4.2試劑——DEPC雙蒸水（雙蒸餾水1000mL、DEPC1mL，室溫放置28h以上，0.105MPa蒸汽高壓30min。1DB22/T2560—20164℃或室溫保存）——培養(yǎng)液（DMEM粉10g、碳酸氫鈉3.7g，溶于1000mL雙蒸水中，抽濾分裝，4℃保存）——營養(yǎng)液（DMEM培養(yǎng)液900mL、犢牛血清100mL，加青霉素、鏈霉素，使其濃度分別達(dá)到200IU/mL、200μg/mL抽濾除菌）——維持液（DMEM培養(yǎng)液980mL、犢牛血清20mL，加青霉素、鏈霉素使其終濃度分別達(dá)200IU/mL、200μg/mL，抽濾除菌）——胰蛋白酶溶液（胰酶2.50g、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）0.20g、無鈣鎂PBS1000mL，抽濾除菌，4℃保存?zhèn)溆茫律鸂倥Ｑ濉嗝顾亍溍顾亍⑹弦海ㄆ咸烟?.05g、拘椽酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.82g、雙蒸餾水二級(jí)水中溶解后，用鹽酸將pH值調(diào)至6.1，高壓蒸汽滅菌20min，最后用二級(jí)水定容至100mL，4℃保存?zhèn)溆?。）——蛋白酶K（三羥甲基氨基甲烷（Tris）（pH7.8）1.20mg（0.01mmol/L）、乙二胺四乙酸（EDTA）1.86mg（0.005mmol/L）、SDS5.00g、三蒸水1000mL、加入蛋自酶K，使成為20mg/mL，即為貯存液；使用濃度為50μg/mL）——RNaseA（20μg/mL，10mmol/LTris-HCl（pH8.0）1.21g、15mmol/LNaCl0.89g、RNaseA0.02g，加去離子水使其終濃度為20μg/mL。分裝，－20℃保存?zhèn)溆茫猅ris飽和酚——酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）——TE（pH8.0）（10mmol/LTris-Cl（pH8.0）1.21g、lmmol/LEDTA（pH8.0）0.37g、去離子水800mL，調(diào)節(jié)pH至8.0，用去離子水定容至1000mL）——TaqDNA聚合酶（5U/μL）——dNTPs（每種濃度均為10mmol/L）——50×Tris-冰乙酸（TAE）電泳緩沖液（Tris282.0g、冰乙酸57.10g、0.5mol/LEDTA（pH8.0）100mL，三蒸水定容至1000mL，0.105MPa蒸汽高壓30min，備用）——溴化乙錠溶液（10mg/mL）（三蒸水100mL、溴化乙錠1g，置棕色瓶中，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器保存于室溫）——1%瓊脂糖凝膠（瓊脂糖1g、TAE電泳緩沖液（50倍）2mL、滅菌三蒸水98mL、微波爐中完全融化，加溴化乙錠溶液）——豬的紅細(xì)胞：1%豬紅細(xì)胞懸液（用20mL注射器先吸取5mL阿氏液，從健康豬耳靜脈采血10mL左右立即混勻，用pH值6.4的PBS洗滌，3000r/min離心5min，棄掉上清，反復(fù)洗滌3次，直至離心后的PBS無血色，棄上清，取出紅細(xì)胞泥1mL，加含1%BSA的pH值6.4的PBS稀釋液9mL，混勻后取1mL，稀釋液9mL，即為1%的豬紅細(xì)胞懸液）2DB22/T2560—2016——陽性抗原：由指定單位提供或?qū)⑺跄c炎病毒疫苗毒MEVB株通過F81傳代細(xì)胞培養(yǎng)，其培養(yǎng)物經(jīng)過滅活制備而成——陰性抗原：由指定單位提供或?qū)⑸L良好的F81傳代細(xì)胞，凍融2～3次，5000r/min離心10min，取上清液備用——陽性血清：由指定單位提供或用水貂腸炎病毒疫苗株的細(xì)胞培養(yǎng)物免疫水貂后分離血清制成，或采已知水貂腸炎病毒抗體陽性貂血分離而成——引物：根據(jù)MEV國際標(biāo)準(zhǔn)株Abashiri基因序列，在其保守基因序列內(nèi)設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物：引物P1：5’–ACAAGCGGCAAGCAATCCTC–3’，引物P2：5'–CTGCCTCTATTTCGGACCAT–3'，配制成20pmol/μL。–20℃保存5設(shè)備——生物安全柜——CO2培養(yǎng)箱——倒置顯微鏡——高速冷凍離心機(jī)——組織勻漿器——4℃冰箱——超低溫冰箱——PCR擴(kuò)增儀——電泳儀——移液器（20μL、200μL、1000μL）——8通道移液器（100μL）無菌取病貂的腸道組織或糞便2g，按1:10的比例用培養(yǎng)液制成勻漿，反復(fù)凍融三次，3000r/min離心20min，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，加入抗生素至終濃度為青霉素2000IU/mL，鏈霉素2000μg/mL，37℃感作1h，冷藏備用。將處理過的樣品同步接種F81細(xì)胞，接種量為營養(yǎng)液量的10%，加入營養(yǎng)液，然后37℃恒溫培養(yǎng)箱中吸附24h后，傾去營養(yǎng)液加入維持液，置37℃的5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d～6d，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照。3DB22/T2560—2016接種24h后置顯微鏡下逐日觀察至4d～6d。正常細(xì)胞對(duì)照成立，接種病料的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞變圓、拉網(wǎng)、脫落等CPE，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，放入–80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?duì)照細(xì)胞與接種樣品細(xì)胞均無變化，應(yīng)盲傳3代。盲傳過程中出現(xiàn)CPE，按上述原則，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，放入–80℃冰箱中保存?zhèn)溆?；若盲?代未出現(xiàn)CPE，則按未分離到水貂腸炎病毒出具結(jié)果。6.4病毒鑒定取上述細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行HA-HI試驗(yàn)、PCR、熒光定量PCR和動(dòng)物回歸試驗(yàn)等鑒定。7HA-HI試驗(yàn)7.1樣品采集與處理7.1.1組織與糞便無菌取病貂的腸道組織或糞便2g，按1:20的比例用培養(yǎng)液制成勻漿，反復(fù)凍融三次，3000r/min離心20min，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，加入抗生素至終濃度為青霉素2000IU/mL，鏈霉素2000μg/mL，冷藏備用。7.1.2血清制備趾尖采血，室溫靜置1h后4℃冰箱過夜，吸出血清入離心管中，3000r/min離心5min，取上清液備用。7.2HA試驗(yàn)在微量板上，從第1孔至10孔以及12孔，用移液器每孔加入pH6.410mM的PBS25μL，用移液器吸取7.1.1待檢樣品25μL，從第1孔起，依次作倍比稀釋，至第10孔，棄去移液器內(nèi)25μL液體（稀釋倍數(shù)依次為2、4、8、16、32…1024），11孔為病毒對(duì)照，12孔為紅細(xì)胞對(duì)照。第1孔至12孔每孔補(bǔ)加pH6.4的PBS25μL，再加入1%豬紅細(xì)胞懸液50μL，立即在微量板振蕩器上搖勻后放置4℃靜置60min判定結(jié)果。加樣示意圖參見附錄A.1。使50％紅細(xì)胞凝集的最高稀釋度，作為病毒的HA效價(jià)；HA效價(jià)≥1:8則判定為HA陽性，反之則為陰性。7.3HI試驗(yàn)病毒HA效價(jià)（如為1∶256），4個(gè)血凝工作單位=256/4=64（即1∶64），取pH6.4的PBS9mL，加血凝素lmL，即成1:10稀釋度，將1:10稀釋液lmL加入到生理鹽水5.4mL中，使最終濃度為1:64。將待檢血清用pH6.4的PBS進(jìn)行2倍系列稀釋，加入含4單位血凝素的抗原液，并設(shè)紅細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照，充分振搖后，置37℃作用30min后，加入1%紅細(xì)胞懸液，4℃靜置60min，判定結(jié)果。加樣示意圖參見附錄A.2。4DB22/T2560—20167.3.3判定標(biāo)準(zhǔn)以使紅細(xì)胞凝集被完全抑制的血清最高稀釋度作為判定終點(diǎn)，該最高稀釋度即為被檢血清的HI效價(jià)。8PCR8.1DNA提取取6.1中處理樣品200μL，或取病毒細(xì)胞培養(yǎng)液200μL，–20℃/室溫反復(fù)凍融2～3次，12000r/min離心l0min；將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入等體積的消化緩沖液及5μL蛋白酶K（20mg/mL）50℃消化2h，12000r/min離心10min；將上清液轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入等體積的Tris飽和酚，充分振蕩混勻，12000r/min離心l0min；取上層水相轉(zhuǎn)移入一新的離心管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混勻后，12000r/min離心l0min（重復(fù)此步驟一次）；取上層水相轉(zhuǎn)移入一新的離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，在–20℃放置1h～2h或室溫放置30min以沉淀病毒DNA；12000r/min離心l0min，棄去上清，用70%乙醇洗滌沉淀，自然風(fēng)干；用10μL含RNaseA（20μg/mL）的TE（pH8.0）溶解沉淀，–20℃保存?zhèn)溆谩；虬凑帐惺鄣腄NA抽提試劑盒操作說明提取病毒DNA。8.2PCR擴(kuò)增8.2.1反應(yīng)體系10×PCRbuffer20mmol/LdNTPs20pmol/μL引物P11.0將PCR反應(yīng)管置于PCR擴(kuò)增儀。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；再進(jìn)行94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，31個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸5min，最后4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。用TAE電泳緩沖液配制成1%瓊脂糖平板（溴化乙錠終濃度0.5μg/mL）。將平板放入水平電泳槽中，加入1×TAE電泳緩沖液剛剛高出凝膠表面，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL與1μL6×上樣緩沖液混合，分5DB22/T2560—2016別加入樣品孔中，取5μLDNAMarkerDL2000加入到標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照孔內(nèi)。5V/cm恒壓電泳30min~45min。8.4結(jié)果判定8.4.1用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，在陰性和陽性對(duì)照成立情況下，如被檢樣品無條帶，則結(jié)果為陰性，如被檢樣品有條帶，大小為194bp，即判定為水貂腸炎病毒核酸陽性。必要時(shí)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，進(jìn)一步確認(rèn)待測樣品的結(jié)果。8.4.2如果出現(xiàn)與設(shè)計(jì)長度不同的條帶，為非特異性反應(yīng)，需重復(fù)試驗(yàn)，兩次試驗(yàn)均為非特異性反應(yīng)時(shí)，可判為陰性。9Real-timePCR9.1DNA提取按照6.1或按照DNA抽提試劑盒操作說明提取病毒DNA。9.2熒光PCR檢測9.2.1反應(yīng)體系20pmol/μL引物P120pmol/μL引物P2PCR-gradewaterTotalVolume在檢測區(qū)進(jìn)行，將9.2.1中加樣后的PCR管放入熒光定量PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置見表36DB22/T2560—2016表3反應(yīng)參數(shù)設(shè)置步驟階段預(yù)變性變性溫度（°C）時(shí)間（s）收集信號(hào)循環(huán)數(shù)129594305否否是是140復(fù)性擴(kuò)增熔解5430360～95120019.3結(jié)果分析9.3.1擴(kuò)增分析設(shè)置閾值：確認(rèn)閾值線位于指數(shù)增長階段；設(shè)置基線：確定PCR擴(kuò)增曲線的最小Ct值，然后將基線的范圍設(shè)定在最小Ct值減去3；保存設(shè)置，用樣品名作為文件名，將數(shù)據(jù)輸出為Excel文件。9.3.2熔點(diǎn)曲線分析熔點(diǎn)曲線：大多數(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，當(dāng)在SYBR?Green模式下運(yùn)行時(shí)，會(huì)自動(dòng)進(jìn)行熔點(diǎn)曲線分析；熔點(diǎn)曲線分析：每一反應(yīng)孔的熔點(diǎn)曲線分析所得到的熔點(diǎn)溫度“Tm”值（參照資料性附錄B.2）。陰性對(duì)照無Ct值并且無擴(kuò)增曲線和熔點(diǎn)曲線；陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)≤30.0，并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線和9.3.4結(jié)果描述及判定無Ct值并且無擴(kuò)增曲線和熔點(diǎn)曲線，表明樣品中無水貂腸炎病毒核酸；Ct≤30.0，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線和熔點(diǎn)曲線，表示樣品中存在水貂腸炎病毒核酸。選擇水貂腸炎病毒HI抗體效價(jià)≤1∶4的3月齡的健康水貂10只，分兩組每組5只，人工感染組5只經(jīng)胃管灌服分離鑒定獲得的病毒液8mL/只，腹腔注射2mL/只。對(duì)照組5只，每只灌服注射相同體積的細(xì)胞培養(yǎng)物，分別隔離觀察飼養(yǎng)10d，每天觀察試驗(yàn)及對(duì)照水貂的臨床癥狀，測定體溫；并于接種第3d開始收集水貂糞便，按照7中步驟進(jìn)行MEV的HA檢測。10.2.1感染動(dòng)物臨床觀察評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表4。7DB22/T2560—2016表4評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)臨床觀察項(xiàng)目發(fā)病死亡賦分值54111腹瀉，糞便稀軟、呈黃色、灰白色或粉紅色甚至煤焦油狀體溫升高至40℃以上，并持續(xù)2d以上精神沉郁，食欲減退或廢絕糞便HA效價(jià)≥1:810.2.2判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組動(dòng)物無10.2.1描述的任何癥狀，試驗(yàn)組動(dòng)物